Il metodo qui presentato può valutare l'effetto dei reagenti sull'angiogenesi o sulla permeabilità vascolare in vivo senza colorazione. Il metodo utilizza l'iniezione di destrano-FITC attraverso la vena caudale per visualizzare i neovasi o le perdite vascolari.
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Articolo metodologico
Saggio modificato in vivo del gel plug della matrice per gli studi sull'angiogenesi
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Diversi modelli sono stati sviluppati per studiare l'angiogenesi in vivo. Tuttavia, la maggior parte di questi modelli sono complessi e costosi, richiedono attrezzature specializzate o sono difficili da eseguire per la successiva analisi quantitativa. Qui presentiamo un saggio di gel plug a matrice modificata per valutare l'angiogenesi in vivo. In questo protocollo, le cellule vascolari sono state miscelate con gel di matrice in presenza o assenza di reagenti pro-angiogenici o anti-angiogenici, e quindi iniettate per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi riceventi. Dopo 7 giorni, la soluzione salina tampone fosfato contenente destrano-FITC viene iniettata attraverso la vena caudale e fatta circolare nei vasi per 30 minuti. I tappi di gel della matrice vengono raccolti e incorporati con gel di inclusione tissutale, quindi vengono tagliate sezioni da 12 μm per la rilevazione della fluorescenza senza colorazione. In questo test, il destrano-FITC ad alto peso molecolare (~150.000 Da) può essere utilizzato per indicare i vasi funzionali per rilevarne la lunghezza, mentre il destrano-FITC a basso peso molecolare (~4.400 Da) può essere utilizzato per indicare la permeabilità dei neo-vasi. In conclusione, questo protocollo può fornire un metodo affidabile e conveniente per lo studio quantitativo dell'angiogenesi in vivo.
Introduzione
L'angiogenesi, il processo di formazione di neovasi da vasi preesistenti, svolge un ruolo fondamentale in molti processi fisiologici e patologici, come lo sviluppo embrionale, la guarigione delle ferite, l'aterosclerosi, lo sviluppo del tumore, ecc.1,2,3,4,5. Questo processo dinamico coinvolge diverse fasi, tra cui la degradazione della matrice, la proliferazione delle cellule vascolari, la migrazione e l'auto-organizzazione per formare strutture tubulari e la stabilizzazione dei neo-vasi6. È stato dimostrato che la promozione dell'angiogenesi è fondamentale nel trattamento dell'infarto del miocardio, dell'ictus e di altri tipi di malattie ischemiche7, mentre l'inibizione dell'angiogenesi è stata considerata una strategia promettente nel trattamento dei tumori8 e delle malattie reumatoidi9. L'angiogenesi è stata considerata un principio organizzativo per la scoperta di farmaci10. Pertanto, la costruzione di un metodo affidabile e conveniente per valutare l'estensione dell'angiogenesi è fondamentale per la ricerca meccanica o la scoperta di farmaci nelle malattie dipendenti dall'angiogenesi.
Diversi modelli in vitro e in vivo sono stati sviluppati per valutare l'angiogenesi11. Tra questi, i modelli bidimensionali (2-D), come il test di formazione di tubi di gel a matrice12, non possono formare strutture tubolari funzionali. I modelli animali, come il modello di ischemiadegli arti posteriori 13,14, possono riprodurre il processo di angiogenesi, ma sono complessi e richiedono un sistema di imaging del flusso sanguigno a speckle laser. I modelli 3D della morfogenesi vascolare, come il saggio del gel plug della matrice, forniscono una piattaforma semplice in grado di imitare il processo di angiogenesi in vivo15, ma il rilevamento dell'angiogenesi richiede l'immunoistochimica o la colorazione a immunofluorescenza 16,17,18, che sono variabili e scarsamente visualizzate.
Qui, descriviamo un protocollo per un saggio di gel di matrice modificata in cui le cellule vascolari sono state mescolate con gel di matrice e iniettate per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi per formare un tappo. Nel tappo, le cellule vascolari devono degradare la matrice, proliferare, migrare e auto-organizzarsi per formare infine vasi funzionali con flusso sanguigno nell'ambiente interno. Successivamente, il destrano marcato con fluorescenza viene iniettato attraverso la vena caudale, per fluire attraverso il tappo, e l'etichetta viene visualizzata per indicare i neo-vasi. Il contenuto dell'angiogenesi può essere valutato quantitativamente in base alla lunghezza dei vasi. Questo metodo è in grado di formare vasi funzionali che non possono essere prodotti nei modelli di angiogenesi 2D12 e non richiede un complesso processo di colorazione come nel normale saggio del gel plugdella matrice 11. Inoltre, non richiede costosi strumenti specifici come il sistema di imaging del flusso sanguigno a speckle laser nel modello di ischemia dell'arto posteriore 13,14,19. Questo metodo è versatile, a basso costo, quantificabile e facile da eseguire e può essere utilizzato per determinare la capacità pro- o anti-angiogenica dei farmaci o essere utilizzato nella ricerca meccanica coinvolta nell'angiogenesi.
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Protocollo
Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19 luglio 2021). Tutti i reagenti e i materiali di consumo sono elencati nell'Indice dei materiali.
1. Preparazione del terreno di coltura
- 10 terreni di coltura M199: sciogliere la polvere di M199 a una concentrazione di 10 volte con 90 mL di acqua deionizzata e aggiungere 10 mL di siero fetale bovino (FBS), quindi passare attraverso un filtro da 0,22 μm. Conservare il terreno a 4 °C per un massimo di 2 mesi.
- Terreno di coltura endoteliale completo: aggiungere 50 mL di FBS, 5 mL di penicillina/streptomicina e 5 mL di integratore per la crescita delle cellule endoteliali a 460 mL di terreno endoteliale (ECM). Conservare il terreno a 4 °C per un massimo di 1 mese.
2. Preparazione delle cellule vascolari
- Coltura 1 x 105 cellule vascolari (cellule progenitrici endoteliali primarie in coltura14, cellule endoteliali o linee cellulari endoteliali) con 8 mL di terreno di coltura endoteliale completo in piastra di coltura tissutale da 100 mm a 37 °C e confluenza dal 5% di CO2 al 70%.
- Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare la piastra 2 volte con 1 soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere le cellule e i detriti non attaccati. Rimuovere il PBS e aggiungere 3 mL di tripsina allo 0,25% contenente 2,21 mM di EDTA e incubare a 37 °C per 1 min.
- Neutralizzare la tripsina con 7 mL di terreno di coltura endoteliale completo e risciacquare delicatamente le cellule dal piatto di coltura. Confermare il distacco cellulare al microscopio ottico (ingrandimento 40x).
- Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 10 min. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule con 5 mL di terreno di coltura endoteliale completo.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e spostare la sospensione contenente 2 x 106 cellule in una provetta sterile da 1,5 mL. Ogni tappo contiene 1,5 x 10celle da 6 , in caso di scarto vengono utilizzate celle aggiuntive del 25%. Ogni gruppo comprende almeno 3 spine.
NOTA: Dopo le prove è stato riscontrato che 1,5 x 106 cellule in 300 μL di gel di matrice hanno portato al corretto sviluppo dell'angiogenesi ed è stato quindi scelto per la sperimentazione. - Centrifugare la sospensione cellulare a 400 x g per 5 minuti fino a pellet di cellule, quindi rimuovere il surnatante.
3. Preparazione del gel Matrix
- Preraffreddare provette sterili da 1,5 mL contenenti pellet cellulare in un bagno d'acqua a 4 °C. Preraffreddare le siringhe da insulina da 30 G da 1 mL in frigorifero a 4 °C.
- Scongelare completamente il gel della matrice a bagnomaria a 4 °C. Non mescolare o vorticare. Preraffreddare 10x M199 e testare il reagente/farmaco di interesse in un bagno d'acqua a 4 °C.
- Miscelare il gel a matrice preraffreddato con 10x M199 contenente il 10% di FBS e il reagente da testare con un rapporto di volume di 8,8:1:0,2 per ottenere un gel di matrice e una miscela di M199 contenente l'1% di FBS e il reagente.
- Risospendere le cellule con 400 μL della miscela di gel della matrice, mescolare delicatamente per evitare la formazione di bolle. Tenere la provetta sul ghiaccio fino a quando i topi non sono pronti per l'iniezione. Tenere sempre la miscela di gel della matrice sul ghiaccio per evitare la coagulazione.
NOTA: In questo caso, sono stati utilizzati 300 μL di miscela di gel a matrice contenente 1,5 x 106 cellule per formare il tappo di gel. Preparare il 25% di gel in più in base al 25% di cellule aggiuntive nel passaggio 2.
4. Preparazione del topo
- Anestetizzare il topo Nu/Nu maschio di 6-8 settimane (18-25 g) nella camera del dispositivo per anestesia animale con isoflurano (isoflurano al 3% in ossigeno al 100% ad una portata di 1 L/min). Dopo l'anestesia riuscita, confermata dall'assenza del riflesso di raddrizzamento e del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi, spostare il topo fuori dalla camera, spostare il topo fuori dalla camera e mettere una maschera per anestesia sul topo e modificare la concentrazione di isoflurano all'1,5% in ossigeno al 100% a una portata di 1 L/min.
NOTA: Fornire supporto termico all'animale utilizzando un termoforo durante tutta la procedura. - Usa un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza. Fissare con nastro adesivo gli arti dei topi sulla scheda operatoria in posizione prona.
5. Iniezione di miscela di gel a matrice
- Caricare 300 μL della miscela di gel matrice in una siringa da insulina da 1 mL con un ago da 30 G. Evitare la formazione di bolle. Caricare rapidamente il gel della matrice (entro 2 minuti) per evitare la solidificazione durante questo periodo. Posizionare immediatamente la siringa da insulina caricata con il gel matrice sul ghiaccio.
- Pulisci la pelle sul dorso dei topi usando tamponi imbevuti di alcol al 75%. Iniettare per via sottocutanea 300 μL di miscela di gel matrice in un lato della parte posteriore dei topi.
- Rimuovere delicatamente l'ago dal sito di iniezione per evitare perdite della miscela di gel della matrice. Verificare la presenza di una piccola gobba nel sito di iniezione (Figura 1).
- Posizionare il mouse sul termoforo per 2 minuti per consentire alla miscela di gel della matrice di coagularsi e formare il tappo.
- Ripetere i passaggi 5.2. fino al punto 5.4. per creare una spina sull'altro lato del retro del mouse. Segna i bordi delle gobbe usando un pennarello.
- Osservare il topo fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente per mantenere il decubito sternale. Metti il mouse in una gabbia separata fino a quando non si è completamente ripreso. Alloggiare i topi in un laboratorio di animali da esperimento di classe SPF a 22 ± 2 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore per 7 giorni.
6. Iniezione di destrano-FITC attraverso la vena caudale
- Dopo 7 giorni di iniezione del gel di matrice, sospendere nuovamente 0,5 mg di destrano-FITC con 500 μL di acqua bidistillata (ddH2O) e quindi vorticare violentemente per ottenere la soluzione di destrano-FITC alla concentrazione finale di 1 μg/μL.
NOTA: Utilizzare destrano-FITC con peso molecolare di ~150 kDa per il test di angiogenesi e utilizzare destrano-FITC con peso molecolare di ~4 kDa per il test di permeabilità vascolare. - Caricare 50 μL di soluzione di destrano-FITC nelle siringhe da 29G.
- Fissare il mouse sullo strumento per l'iniezione della vena caudale. Pulire la coda con un batuffolo di cotone alcool al 75% e iniettare delicatamente 50 μL di destrano-FITC attraverso la vena caudale.
- Comprimere il sito di iniezione con un batuffolo di cotone per 1 minuto per fermare l'emorragia, quindi rimettere i topi nella gabbia per 30 minuti.
- Ripetere i passaggi 6.3. e 6.4. fino a quando tutti i topi non hanno ricevuto l'iniezione di destrano-FICC.
7. Raccolta di tappi in gel Matrix
- Iniettare per via intraperitoneale l'1% di pentobarbital sodico in PBS (200 mg/kg di peso corporeo) ed eutanasia i topi con una procedura approvata dalla IACUC.
- Tagliare la pelle lungo il bordo contrassegnato del tappo usando le forbici chirurgiche e rimuovere la pelle sopra il tappo in gel della matrice.
- Raccogliere il tappo e sciacquare in un piccolo becher con 1x PBS per lavare via il sangue in eccesso (Figura 2A). Il colore del tappo può delineare approssimativamente il grado di abbondanza di sangue e il contenuto dei neovasi (Figura 3A).
8. Inclusione del tappo in gel della matrice e preparazione della sezione
- Coprire il pulsante della cassetta di inclusione dei tessuti con circa 0,5 mL di gel per l'inclusione dei tessuti, quindi posizionare immediatamente il tappo in gel per matrice sul gel per l'inclusione dei tessuti nell'orientamento desiderato, come mostrato nella Figura 2B. Quindi, incorporare il tappo con un gel aggiuntivo per l'inclusione dei tessuti.
- Mettere le cassette in un congelatore a -80 °C per 12 ore a solidificare.
- Per la preparazione di sezioni spesse, estrarre il blocco di tappi solidificato e tagliare sezioni spesse 12 μm utilizzando il microtomo di congelamento secondo le istruzioni e montarle sui vetrini del microscopio.
- Taglia 5-10 sezioni da ogni blocco di spine.
9. Quantificazione dell'angiogenesi (Figura 3)
- Acquisisci immagini di fluorescenza da 5 campi indipendenti della sezione con un microscopio a fluorescenza invertita a una lunghezza d'onda di 488 nm con un ingrandimento di 10x.
- Aprire il file immagine con il software Image J (https://imagej.en.softonic.com/) e fare clic sul pulsante Analisi angiogenesi. Quindi, fare clic sul pulsante Analizza contrasto di fase HUVEC e passare alla tabella dei risultati delle statistiche per raccogliere informazioni. Misurare tutte e 5 le immagini di fluorescenza acquisite per ciascuna sezione.
- Analizzare la lunghezza totale dei neovasi di diversi gruppi per valutare statisticamente la differenza di angiogenesi tra questi gruppi.
NOTA: La lunghezza totale dei segmenti master indica la lunghezza totale dei neo-vasi. Il reagente che aumenta la lunghezza dei neovasi è definito pro-angiogenico, mentre il reagente che diminuisce la lunghezza dei neo-vasi è anti-angiogenico.
10. Quantificazione della permeabilità vascolare (Figura 4)
- Acquisizione di immagini di fluorescenza da 5 campi indipendenti della sezione con un microscopio a fluorescenza invertita a una lunghezza d'onda di 488 nm con un ingrandimento di 20x.
- Aprire il file immagine con il software Image J. Fare clic sul pulsante Selezione a mano libera e cerchiare l'area di perdita, quindi fare clic sul menu Analizza e selezionare l'opzione Misura per ottenere le informazioni sull'area dell'area di perdita. Utilizzare il rapporto tra l'area di perdita e l'area dell'immagine per indicare la permeabilità vascolare.
- Analizzare il rapporto tra l'area di perdita e l'area dell'immagine da diversi gruppi per valutare statisticamente la differenza di permeabilità vascolare tra questi gruppi.
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Risultati
La Figura 1 è il diagramma di flusso che illustra come preparare la miscela di gel della matrice, cellule vascolari, terreno di coltura e reagente. La miscela è stata quindi iniettata per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi Nu/Nu e riscaldata utilizzando un termoforo per accelerarne la coagulazione e formare infine un tappo di gel.
La Figura 2A è il diagramma di flusso per indicare i recipienti con destrano marcato con fl...
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Discussione
Presentiamo un metodo affidabile e conveniente per la valutazione quantitativa dell'angiogenesi in vivo senza colorazione. In questo protocollo, le cellule vascolari sono state miscelate con gel di matrice in presenza di reagenti pro-angiogenici o anti-angiogenici, e quindi iniettate per via sottocutanea nella parte posteriore dei topi Nu/Nu per formare un tappo di gel (Figura 1). Dopo 7 giorni dalla formazione del tappo di gel, il destrano-FITC è stato iniettato per via endovenosa ...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dalla Natural Science Foundation della provincia di Zhejiang (LY22H020005) e dalla National Natural Science Foundation of China (81873466).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrini per microscopio ad adesione | CITOTEST | 188105 | |
| Sistema di anestesia | RWD | R640-S1 | |
| Contatore cellulare | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Piatto per colture cellulari | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | ||
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Cassette per inclusione | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Medium per cellule endoteliali | ScienCell | 35809 | |
| Integratori per la crescita endoteliale | ScienCell | 1025 | |
| Siero fetale bovino | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblasto Fattore di crescita 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Microscopio a fluorescenza | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Pad riscaldante | Boruida | 30-50-30 | |
| Siringa da insulina | BD | 300841 | |
| Isoflurano | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratorio Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning 356234 | Gel | |
| Media 199 polvere | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubi | Axygen | MCT-150-C | |
| Temperatura di taglio ottimale (OCT) Composto | SUKURA | 4583 | Gel per inclusione tissutale |
| Palmitato Acido | KunChuang | KC001 | |
| Penicillina-Streptomicina liquida | Solarbio | P1400 | |
| Tampone fosfato Soluzione salina | Solarbio | P1022 | |
| Strumenti chirurgici | RWD | RWD | |
| Strumento per iniezione della vena della coda | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Soluzione di tripsina-EDTA | Solarbio | T1320 | |
| Temperatura ultra bassa Congelatore | eppendorf | U410 | |
| Fattore di crescita endoteliale vascolare | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
Riferimenti
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
- De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).
- Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
- Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
- Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
- Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
- Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Folkman, J. Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
- Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449(2022).
- Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821(2022).
- Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
- Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
- Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
- Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
- Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
- Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).
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