Profilo fenotipico dei neuroni dopaminergici del mesencefalo derivati da cellule staminali umane

Summary

Questo protocollo descrive la coltura cellulare di neuroni dopaminergici del mesencefalo umano, seguita da colorazione immunologica e generazione di profili fenotipici neuronali da immagini microscopiche acquisite ad alto contenuto che consentono l'identificazione di variazioni fenotipiche dovute a modulazioni genetiche o chimiche.

Abstract

Il morbo di Parkinson (PD) è legato a una serie di processi biologici cellulari che causano la perdita di neuroni dopaminergici del mesencefalo (mDA). Molti attuali modelli cellulari di PD in vitro mancano di complessità e non tengono conto di fenotipi multipli. Il profilo fenotipico nei neuroni mDA derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) può affrontare queste carenze misurando simultaneamente una serie di fenotipi neuronali in un tipo di cellula rilevante per la PD in parallelo. In questo articolo, descriviamo un protocollo per ottenere e analizzare i profili fenotipici da neuroni mDA umani disponibili in commercio. Un pannello di colorazione fluorescente specifico per i neuroni viene utilizzato per visualizzare i fenotipi correlati alla proteina nucleare, alla α-sinucleina, alla tirosina idrossilasi (TH) e alla proteina 2 associata ai microtubuli (MAP2). Il protocollo di profilazione fenotipica descritto è scalabile in quanto utilizza piastre a 384 pozzetti, manipolazione automatica dei liquidi e microscopia ad alto rendimento. L'utilità del protocollo è esemplificata utilizzando neuroni mDA donatori sani e neuroni mDA portatori della mutazione G2019S legata al PD nel gene della chinasi ripetuta 2 ricca di leucina (LRRK2). Entrambe le linee cellulari sono state trattate con l'inibitore della chinasi LRRK2 PFE-360 e sono stati misurati i cambiamenti fenotipici. Inoltre, dimostriamo come i profili fenotipici multidimensionali possano essere analizzati utilizzando metodi di classificazione supervisionati basati sul clustering o sull'apprendimento automatico. Il protocollo descritto interesserà in particolare i ricercatori che lavorano sulla modellazione delle malattie neuronali o che studiano gli effetti dei composti chimici nei neuroni umani.

Introduction

Una varietà di processi biologici cellulari sono disturbati nella malattia di Parkinson (PD). Ad esempio, la disfunzione mitocondriale, lo stress ossidativo, i difetti di degradazione delle proteine, l'interruzione del traffico vescicolare e la funzione endolisosomiale sono stati associati alla perdita di neuroni dopaminergici del mesencefalo (mDA), sono comunemente osservati nella PD¹. Pertanto, la malattia di Parkinson sembra coinvolgere molteplici meccanismi patologici che possono interagire e peggiorarsi a vicenda. Un modo utile per studiare questa interazione meccanicistica è la creazione di un'impronta digitale fenotipica completa o di un....

Protocol

1. Preparazione del terreno e delle piastre per la semina dei neuroni (Giorno 1)

1. Per preparare le piastre per la semina dei neuroni il giorno 1, riscaldare la laminina a temperatura ambiente (RT) appena prima dell'uso. Preparare la soluzione di Laminina diluendo la soluzione madre di Laminina (0,1 mg/mL) 1/10 in PBS+/+ freddo (con Ca 2+ e Mg²⁺).
   NOTA: Tutti i reagenti sono elencati nell'Indice dei materiali. Le composizioni delle soluzioni e dei tamponi sono descritte nelle Tabelle 1-4.
2. Quindi, aggiungere 25 μL della soluzione di Laminina a ciascun pozzetto di una piastra a....

Results

La profilazione fenotipica nei neuroni mDA è un modo efficiente per quantificare molteplici aspetti della biologia cellulare e i loro cambiamenti durante la modulazione sperimentale. Per esemplificare questa metodologia, questo studio ha fatto uso di neuroni LRRK2 G2019S crioconservati e mDA di donatori sani. Questi neuroni sono stati differenziati per circa 37 giorni, sono marcatori neuronali post-mitotici ed espressi (TUBB3 e MAP2) e marcatori neuronali dopaminergici, tra cui la tirosina idrossilasi (TH) in combinazion.......

Discussion

La profilazione fenotipica è una tecnica per misurare un gran numero di fenotipi nelle cellule applicando colorazioni fluorescenti, microscopia e analisi delle immagini³. I profili fenotipici possono essere ottenuti e confrontati tra linee cellulari o altre condizioni sperimentali per comprendere i cambiamenti complessi nella biologia cellulare che potrebbero passare inosservati quando si utilizza una singola lettura. Qui descriviamo l'applicazione del profilo fenotipico ai neuroni mDA umani deriv.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-pollo – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescenza
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescenza
Anti-topo - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescenza
Anti-coniglio - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescenza
Anti-tirosina Idrossilasi	Merck	T2928	Immunofluorescenza
Anti-&alfa;-sinucleina	Abcam		138501 Immunofluorescenza
Piattaforma automatizzata per la manipolazione dei liquidi Bravo con testina 384ST	Agilent		Se non è disponibile un gestore di liquidi, si consiglia l'uso di una pipetta elettronica multicanale.
Microscopio confocale	Yokogawa	CV7000	Si consiglia l'uso di un microscopio a fluorescenza confocale automatizzato per garantire la coerenza della qualità dell'immagine.
Countess Contatore automatico di cellule	Invitrogen		Conteggio delle cellule prima della semina. Può essere fatto anche utilizzando una camera di conteggio manuale.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Tampone per lavaggio
EL406 Dispenser lavatrice	BioTek (Agilent)		Se non è disponibile un dispositivo di manipolazione dei liquidi, si consiglia l'uso di una pipetta elettronica multicanale.
Soluzione di formaldeide (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fissazione prima della colorazione
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Colorazione nucleare
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base Medium per neuroni
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Donatore
apparentemente sanoiCell DPN, Donatore#11299, Fenotipo LRRK2 G2019S, fenotipo PD lotto#106139	Fujifilm	C1149	Donatore portatore della mutazione LRRK2 G2019S
Integratore iCell Nervous System	Fujifilm	M1031	Supplemento per terreno base
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplemento per terreno base
Jupyter Python Notebook	interno	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook per eseguire la visualizzazione e la classificazione del profilo fenotipico a partire da dati grezzi.
Laminin	Biolamina	LN521	Rivestimento per piastre
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	Inibitore della chinasi LRRK2
PhenoLink	Sviluppo interno	Software per l'analisi delle immagini
PhenoPlate 384w, rivestito in PDL	Perkin Elmer	6057500	Piastra pre-rivestita per coltura cellulare e imaging. Questa piastra consente l'imaging di tutti i pozzetti utilizzando tutti gli obiettivi del microscopio Yokogawa CV7000.
Piastre di stoccaggio Abgene 120 µ L	Thermo Scientific	AB-0781	Necessario per l'erogazione di composti utilizzando il sistema di pipettaggio Vprep. Se non disponibile, si consiglia l'uso di una pipetta elettronica multicanale.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilizzazione prima della lisi
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determinazione delle cellule viventi
Sistema di pipettaggio Vprep	Agilent		Medium cambio ed erogazione di composti. In alternativa, è possibile utilizzare una pipetta elettronica multicanale.