Espressione di transgeni in cellule in coltura utilizzando vettori virali adeno-associati ricombinanti non purificati

Chiarire le basi molecolari delle funzioni cellulari spesso richiede l'espressione di DNA transgenico in coltura cellulare. Per essere espressi, i transgeni devono penetrare attraverso la membrana selettiva di una cellula e raggiungere il nucleo ^1,2. Pertanto, la capacità di aggirare efficacemente le barriere fisiche della cellula e manipolare i suoi processi centrali è una necessità per applicare la transgenesi alla scoperta di nuovi fenomeni biologici. Un approccio sfrutta la capacità intrinseca dei virus di veicolare ed esprimere DNA estraneo ^3,4.

Il virus adeno-associato (AAV) è uno dei più piccoli virus dei mammiferi: il suo genoma a DNA a singolo filamento di 4,7 kilobasi (kb) contiene due geni, rep (per la replicasi) e cap (per il capside), impacchettati all'interno di un capside icosaedrico di 60 mer che misura 25 nm. I geni rep/cap hanno più promotori, frame di lettura e prodotti di splicing che codificano per almeno nove proteine uniche necessarie per la replicazione, la produzione e il confezionamento virale ^5,6. Inoltre, entrambe le estremità del genoma contengono strutture secondarie chiamate ripetizioni terminali invertite (ITR) che sono necessarie per la replicazione del DNA, l'impacchettamento del genoma e l'elaborazione a valle durante la trasduzione 7,8,9,10. Gli ITR sono gli unici elementi del DNA necessari per l'impacchettamento del genoma nel capside, e quindi l'AAV può essere clonato per scopi di trasporto del transgene sostituendo i geni rep/cap virali con elementi regolatori e/o geni di interesse⁶ scelti dal ricercatore. L'AAV ricombinante risultante (rAAV), con un genoma vettoriale ingegnerizzato (VG), è ampiamente utilizzato in clinica per la terapia genica umana e ha accumulato successi¹¹. Un uso sottovalutato del vettore è in laboratorio; Gli rAAV possono raggiungere in modo efficiente l'espressione del transgene nelle cellule in coltura per soddisfare le esigenze sperimentali di un ricercatore¹².

Il metodo più comune per la produzione di rAAV è la trasfezione a triplo plasmide in cellule HEK293 o 293T (Figura 1). Il primo plasmide, comunemente chiamato plasmide cis, contiene il transgene desiderato affiancato da ITR (pAAV). A seconda dell'applicazione, sono disponibili per l'acquisto plasmidi cis con elementi comuni, come promotori forti o strumenti basati su CRISPR. Il secondo è il plasmide pRep/Cap che contiene i geni wild-type AAV rep e cap forniti in-trans, cioè su un plasmide separato, non contenente ITR che esprime elementi regolatori e strutturali che poi interagiscono con il plasmide cis, ed è quindi chiamato plasmide trans. Oltre a racchiudere fisicamente il VG, il capside influenza il tropismo cellulare^12,13. Fornendo il gene cap specifico per il sierotipo in-trans, i ricercatori sono facilmente in grado di massimizzare l'efficienza di trasduzione scegliendo un sierotipo del capside ottimizzato per la loro cellula bersaglio. Infine, come Dependoparvovirus, l'AAV richiede che un virus helper attivi l'espressione rep/cap dai suoi promotori virali, ottenuta dai geni helper adenovirali, forniti su un terzo plasmide come pAdΔF6^14,15. Dopo 72 ore di trasfezione a triplo plasmide, il vettore può essere rilasciato dalle cellule produttrici nel terreno di coltura mediante ripetuti cicli di congelamento/disgelo. L'intero contenuto della piastra viene quindi raccolto e i detriti cellulari di grandi dimensioni vengono rimossi mediante centrifugazione; il surnatante del terreno risultante è una preparazione grezza di rAAV pronta per le trasduzioni a valle.

Figura 1: Panoramica della produzione di vettori rAAV grezzi. La produzione e la trasduzione di rAAV grezzi possono essere effettuate entro 5 giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

rAAV può essere più favorevole per la somministrazione di transgeni rispetto ad altri metodi di trasfezione, che sono comunemente associati a tossicità cellulare, bassa efficienza e reagenti e attrezzature costosi, come per l'elettroporazione o la trasfezione a base chimica/lipidica^16,17. rAAV aggira questi ostacoli e spesso fornisce una potente espressione transgenica con una tossicità minima e un tempo di intervento minimo. È importante sottolineare che la produzione di rAAV e la sua applicazione in coltura cellulare sono semplici e raramente richiedono la purificazione del vettore dal terreno di coltura (Figura 1). Inoltre, rAAV non integra il suo VG nel genoma dell'ospite, a differenza del rilascio del transgene lentivirale, e quindi riduce il rischio di mutagenesi inserzionale¹⁸. Nonostante i potenziali benefici dell'utilizzo di rAAV per la somministrazione di transgeni, è necessario considerare i limiti. È importante sottolineare che la dimensione del transgene, compresi gli ITR, non dovrebbe superare i 4,9 kb a causa dei vincoli fisici del capside, limitando così la capacità di un ricercatore di fornire efficacemente elementi regolatori e transgeni di grandi dimensioni. Inoltre, poiché rAAV è un virus non integrante, la trasduzione provoca un'espressione transgenica transitoria nelle cellule in divisione e potrebbe non essere pratica per un'espressione stabile. Tuttavia, i metodi che utilizzano il doppio Cas9 somministrato da rAAV e i modelli di riparazione diretta all'omologia (HDR) possono essere utilizzati per inserire stabilmente sequenze in loci genomici specifici, se un ricercatore lo desidera¹⁹.

1. Acquisizione di plasmidi

NOTA: Questo protocollo clonerà un gene di interesse (GOI) in un plasmide contenente ITR con un promotore del citomegalovirus (CMV) e una sequenza di poli-adenilazione SV40 (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). Tuttavia, questo plasmide può essere utilizzato senza ulteriore clonazione per produrre rAAV, confezionando un comodo doppio reporter EGFP e Luciferasi. I plasmidi con diversi elementi regolatori o per diverse applicazioni, ad esempio per esperimenti basati su CRISPR, sono disponibili online e seguiranno fasi di clonazione simili a quelle riportate di seguito (vedere la discussione per ulteriori fasi di clonazione). Inoltre, è possibile utilizzare plasmidi rep/cap o trans per diversi sierotipi: questo protocollo utilizzerà rep/cap per il sierotipo AAV 2.

1. Acquista pugnalate batteriche contenenti un plasmide cis contenente ITR, un plasmide helper dell'adenovirus, un plasmide rep/cap e un plasmide contenente un GOI. Strisciare i batteri su singole piastre di agar contenenti antibiotici specifici per la resistenza di ciascun plasmide. Incubare i batteri a 30 °C per una notte per farli crescere.
   NOTA: Se un plasmide con un GOI non è prontamente disponibile per l'acquisto, è possibile acquistare online un frammento di DNA sintetico (vedi Tabella dei materiali). Inoltre, un frammento di DNA sintetico può essere utilizzato per saltare l'intero processo di PCR, se lo si desidera.
2. Prelevare una singola colonia da ogni piastra e far crescere in 3 mL di tampone Luria Bertani (LB) integrato con il corrispondente antibiotico a 30 °C per una notte, agitando a 180 giri/min. Trasferire 1 mL di batteri in un matraccio sterile da 250 mL contenente 50 mL di tampone LB integrato con l'antibiotico corrispondente. Agitare a 30 °C, 180 giri/min per tutta la notte.
3. Trasferire i batteri in una provetta conica da 50 ml e centrifugare per 20 minuti a 3.000 x g, a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Isolare il plasmide utilizzando un kit midiprep a basso contenuto di endotossine o privo di endotossine secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: gli ITR sono strutture instabili. Per prevenire delezioni o mutazioni di ITR, le cellule batteriche devono essere coltivate a 30 °C per rallentare la divisione cellulare e mitigare gli errori di replicazione. Per aumentare la resa e la purezza del plasmide, un kit midiprep o maxiprep è l'ideale. Si raccomanda di utilizzare un kit a basso contenuto di endotossine o privo di endotossine per ridurre la contaminazione da endotossine a valle delle cellule. Non è necessario eseguire l'isolamento del plasmide all'interno di una cappa a flusso laminare, poiché la contaminazione della preparazione plasmidica non è probabile se eseguita su un banco standard.

2. Clonaggio del gene di interesse in un plasmide contenente AAV ITR

1. Aprire la mappa plasmidica contenente il GOI in un software di visualizzazione del DNA.
   NOTA: La cassetta completa, compresi gli ITR, non deve superare i 4,9 kb a causa delle limitazioni dell'imballaggio fisico del capside. Inoltre, l'amplificazione della PCR non può essere ottenuta attraverso gli ITR a causa delle strutture secondarie. Pertanto, l'assemblaggio Gibson non è raccomandato per la clonazione del transgene rAAV.
   1. Fare clic sulla scheda Sequenza per visualizzare la sequenza completa del plasmide. Scorri fino alla regione più lontana di 5' della sequenza GOI e fai clic sul primo nucleotide trascinando verso l'interno verso il corpo del gene per creare un primer in avanti. Rilasciare una volta raggiunta una temperatura di fusione (Tm) di ~55 °C.
   2. Fare clic su Forward Primer. Includere manualmente la sequenza per un sito di restrizione EcoRI (5' GAATTC 3') all'estremità 5' della sequenza di primer. Inoltre, aggiungere sei basi casuali extra all'estremità 5' di questo sito di restrizione per consentire all'enzima di interagire in modo efficiente con il DNA. Fare clic su Aggiungi primer. Fare riferimento alla Figura 2 per un esempio rappresentativo.
   3. Controllare il primer per assicurarsi che non possa formare forcine o dimeri di primer (ad eccezione del sito di restrizione che è palindromico). Se si formano delle forcine, cambia la sequenza casuale delle sei basi extra. Inoltre, assicurarsi che il primer non si leghi in nessun altro punto del plasmide.
   4. Ripetere i passaggi per creare un primer inverso nella regione 3' più grande del GOI verso l'interno del corpo del gene. Fare clic su Reverse Primer e includere un sito di restrizione NotI (5' GCGGCCGC 3').
      NOTA: Il GOI non può contenere siti di restrizione EcoRI o NotI – in tal caso, sarà necessario utilizzare enzimi di restrizione diversi.
2. Amplificare il GOI in una reazione PCR da 50 μL. Utilizzare i singoli componenti richiesti dalla Tabella 1.
   1. Posizionare la reazione in un termociclatore e seguire i parametri del ciclo della Tabella 2 per la programmazione. Se i primer hanno un T m diverso, utilizzare il T_m più basso per il programma.
   2. Verificare l'amplificazione del frammento PCR corretto aggiungendo 1 μL di colorante di caricamento del gel (6x) a 5 μL di reazione PCR. Eseguire una scala di DNA e la miscela PCR su un gel di agarosio allo 0,8% contenente bromuro di etidio e visualizzare con luce UV.
      ATTENZIONE: Il bromuro di etidio è un mutageno noto.
   3. Se sul gel appare una singola fascia specifica, purificare il prodotto PCR rimanente nella provetta della striscia PCR utilizzando un kit di pulizia PCR basato su colonna secondo le istruzioni del produttore. Se compaiono più bande (a causa di un'amplificazione non specifica), asportare la banda desiderata e purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
3. Digerire il prodotto PCR purificato e il plasmide della spina dorsale pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 in una reazione di 50 μL con i singoli componenti richiesti dalla Tabella 3 per 1 ora a 37 °C. È necessaria una maggiore quantità di DNA plasmidico pAAV a causa del recupero inefficiente previsto dopo l'estrazione del gel.
   NOTA: Gli enzimi di restrizione utilizzati sono versioni ad alta fedeltà (HF). Regular NotNon posso essere utilizzato con il buffer CutSmart. Se vengono utilizzati enzimi diversi, potrebbero essere necessari una temperatura di incubazione e un tampone diversi.
   1. Purificare il prodotto PCR digerito con un kit di pulizia PCR basato su colonna secondo le istruzioni del produttore.
   2. Preparare il plasmide spinale pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 digerito per l'elettroforesi su gel aggiungendo 10 μL di colorante di caricamento gel (6x) a 50 μL di reazione di digestione. Caricare una scala di DNA, una reazione di digestione e 250 ng di plasmide non digerito (controllo negativo) su un gel di agarosio allo 0,8% contenente bromuro di etidio con pozzetti a denti larghi. Visualizzare con la luce UV, asportare il frammento desiderato (~4,5 kb) e purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
4. Legare il prodotto PCR digerito e il plasmide della spina dorsale pAAV digerito in una reazione di legatura di 20 μL con i singoli componenti richiesti dalla Tabella 4. Per calcolare la quantità di prodotti PCR necessari, utilizzare la Formula 1. In genere, utilizzare un rapporto molare 3:1 tra prodotto PCR (inserto) e spina dorsale (pAAV), con una massa di 50 ng di spina dorsale.
   Formula 1
5. Eseguire un controllo negativo sostituendo il prodotto PCR con acqua. Incubare le reazioni di legatura a 16 °C per una notte o a temperatura ambiente per 2 ore.
6. Scongelare una fiala di cellule batteriche competenti e carenti di ricombinazione (come le cellule Stbl3) su ghiaccio e posizionare 50 μL in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 3 μL della reazione di legatura direttamente sulle cellule e incubare su ghiaccio per 30 minuti.
   NOTA: Gli ITR sono strutture instabili e pertanto richiedono ceppi batterici carenti di ricombinazione per limitare gli eventi di delezione e ricombinazione degli ITR. Le cellule DH5α possono essere utilizzate in modo intermittente per la propagazione (una o due volte), ma non sono raccomandate per l'uso a lungo termine. L'integrità dell'ITR deve essere controllata regolarmente dopo la purificazione midiprep.
   1. Trasferire i batteri a bagnomaria a 42 °C per 30 secondi, quindi trasferire immediatamente nel ghiaccio per 2 minuti. Aggiungere 200 μL di tampone LB e agitare per 1 ora a 30 °C, 180 giri/min.
   2. Distribuire 125 μL della miscela su una piastra di agar con l'antibiotico corrispondente e incubare per una notte (~18 h) a 30 °C. Prelevare più cloni e metterli in una provetta di plastica sterile con 3 mL di LB contenente l'antibiotico corrispondente. Incubare per una notte agitando a 30 °C, 180 giri/min.
      NOTA: Per prevenire delezioni o mutazioni di ITR, le cellule batteriche devono essere coltivate a 30 °C per rallentare la divisione cellulare e mitigare gli errori di replicazione. Inoltre, le colonie più piccole dovrebbero essere scelte in quanto quelle senza ITR possono avere un vantaggio di crescita rispetto alle altre.
   3. Pipettare 1,8 mL di ciascuna coltura in una provetta da 2 mL e centrifugare a 6.000 x g per 3 minuti, a temperatura ambiente. Isolare il DNA utilizzando un kit miniprep. Conservare i restanti 1,2 mL di coltura a 4 °C. Verificare i cloni corretti mediante sequenziamento del DNA o digestione dell'enzima di restrizione diagnostica.
      NOTA: Si consiglia il sequenziamento con metodo Sanger dell'inserto, ma la processività tramite ITR non è ottenibile con i metodi standard. Gli ITR devono essere verificati mediante digest di restrizione come descritto di seguito.
   4. Aggiungere 50 mL di tampone LB contenente l'antibiotico corrispondente a un matraccio sterile da 250 mL. Aggiungere 500 μL della coltura rimanente nel matraccio e agitare a 30 °C, 180 giri/min fino a raggiungere un OD₆₀₀ di 0,2-0,5 (~18 h). Trasferire i batteri in una provetta conica da 50 mL e centrifugare per 20 minuti a 3.000 x g, 4 °C. Isolare il DNA utilizzando un kit midiprep a basso contenuto di endotossine o privo di endotossine.
   5. Controllare l'integrità dell'ITR con 20 μL di digestione dell'enzima di restrizione diagnostica utilizzando XmaI (o SmaI). Preparare una reazione contenente 500 ng di plasmide, 0,5 μL di enzima e 1x tampone; incubare per 1 ora a 37 °C. Eseguire la reazione su un gel di agarosio allo 0,8%. Se gli ITR sono intatti, la digestione darà una banda a ~2,9 kb e un'altra banda delle dimensioni della cassetta. Se questa banda distinta non viene osservata, l'ITR potrebbe non essere intatta e la clonazione dovrà essere ripetuta.
      NOTA: I plasmidi contenenti siti di restrizione XmaI (o SmaI) (oltre a quelli negli ITR) avranno bande aggiuntive sul gel.

Figura 2: Esempio rappresentativo per la progettazione di primer. Progettazione di primer diretti e inversi per un transgene mScarlatto (esempio rappresentativo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Reagenti di amplificazione PCR. I componenti necessari per una reazione PCR di successo.

Tabella 2: Programmazione dell'amplificazione PCR. I parametri ciclici necessari per una reazione PCR di successo.

Tabella 3: Reagenti per la digestione. I componenti necessari per una reazione digestiva di successo.

Tabella 4: Reagenti di legatura. I componenti necessari per una reazione di legatura di successo.

3. Produzione vettoriale con trasfezione a triplo plasmide

NOTA: I seguenti valori sono ottimizzati per un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti che produce un volume finale di preparazione del greggio di 2 mL. Tutti i valori possono essere aumentati di 10 volte per una piastra da 15 cm che produce un volume finale di 20 mL o ridotti di 4 volte per una piastra a 24 pozzetti con un volume finale di 500 μL.

1. Ottenere una scorta di 1 μg/μL di polietilenimmina cloridrato (PEI) MAX sciogliendo 100 mg di PEI MAX in 100 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7,1 con NaOH. Filtrare: sterilizzare la miscela con un filtro da 0,22 μm e congelare aliquote da 1 mL a -20 °C per una conservazione a lungo termine. Una volta scongelato, conservare il reagente per 1 mese a 4 °C.
2. Seminare 3 x 10 5 cellule HEK293 o HEK293T in una piastra a 6 pozzetti con terreno di aquila modificato di Dulbecco preriscaldato (DMEM,^4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di piruvato di sodio) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS). Crescere fino a ~75%-90% di confluenza in un'incubatrice impostata a 37 °C e 5% di CO₂ (Figura 3).
   NOTA: È stato osservato che le cellule coltivate con penicillina/streptomicina (P/S) diminuiscono la resa di produzione del vettore. L'uso di una corretta tecnica sterile evita la necessità di utilizzare P/S, e quindi si raccomanda di non coltivare le cellule HEK293 con l'antibiotico²⁰. Se è richiesto P/S nelle trasduzioni a valle, si raccomanda di aggiungere P/S alla preparazione del greggio dopo la raccolta.
3. In una provetta da 2 mL, preparare una miscela contenente 1,3 μg di pAAV2/2 (Rep/Cap, sierotipo 2), 1,3 μg di pAAV.GOI, 2,6 μg di pAdΔF6 e DMEM privo di siero (SF) (4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di piruvato di sodio) in un volume totale di 100 μL (vedere la Tabella supplementare 1 per un comodo calcolo).
4. Preparare un controllo negativo in una provetta separata sostituendo pRep/Cap con qualsiasi plasmide non correlato. Il controllo negativo tiene conto del plasmide pAAV.GOI non confezionato presente nella preparazione grezza che potrebbe eventualmente trasfettare le cellule durante la trasduzione, anche se raramente.
   NOTA: Il plasmide maxiprep o midiprep a basso contenuto di endotossine o privo di endotossine è ideale per la tripla trasfezione e generalmente produce un vettore di titolo più elevato rispetto al DNA miniprep, sebbene il DNA miniprep possa essere utilizzato per test preliminari rapidi e sporchi.
5. Aggiungere 5,2 μL di PEI MAX alla miscela plasmidico; si tratta di una miscela plasmide:PEI con un rapporto di 1:1. Mescolare bene pulsando 10-15 volte su un mixer a vortice impostato a 7. Se vengono prodotte più preparazioni vettoriali, aggiungere PEI a ciascuna miscela plasmidica a intervalli di tempo scaglionati di 1 minuto (ad esempio, preparazione 1 a t = 0 min, preparazione 2 a t = 1 min, ecc.) per consentire un tempo sufficiente per aspirare i pozzetti e diluire la reazione nelle fasi successive.
   NOTA: È stato osservato che un rapporto 1:1 di plasmide:PEI è ottimale. Tuttavia, i singoli utenti possono ottimizzare questo rapporto per la massima efficienza. Fare riferimento alla discussione su come eseguire l'ottimizzazione PEI (vedere anche la Tabella supplementare 2).
6. Incubare ogni provetta per esattamente 15 minuti e poi diluire la reazione con 1,9 mL di SF DMEM (4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di piruvato di sodio) per un volume finale di 2 mL. Pipettare delicatamente 2 volte per mescolare. L'eccessiva miscelazione interromperà i complessi plasmidi/PEI e si tradurrà in una minore efficienza di trasfezione.
7. Aspirare il terreno dal pozzo e aggiungere delicatamente la miscela plasmidico:PEI sui lati del pozzetto per prevenire il distacco cellulare. Incubare le cellule per 72 ore a 37 °C e al 5% di CO₂ . La lisi e il distacco cellulare durante l'incubazione è un normale processo di produzione di rAAV (Figura 4).

Figura 3: Celle HEK293 pronte per la trasfezione. La confluenza ideale (75%-90%) delle cellule HEK293 necessarie per la trasfezione del triplo plasmide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Cellule HEK293 dopo la trasfezione. La comparsa di cellule HEK293 prima e dopo 1, 2 o 3 giorni dopo la trasfezione con pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 e rapporto 1:1 di plasmide:PEI. Barre della scala: 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Raccolta di preparati vettoriali grezzi

1. Congelare l'intera piastra di cellule trasfettate per 30 minuti a -80 °C, seguito da uno scongelamento per 30 minuti a 37 °C. Ripetere per un totale di tre cicli di congelamento/scongelamento. Non rimuovere il coperchio: la piastra deve rimanere sterile all'interno. Le piastre possono rimanere a -80 °C fino a quando non sono pronte per procedere alle fasi successive.
   NOTA: Un'incubatrice non umidificata funziona meglio per lo scongelamento, che riduce al minimo la condensa all'esterno delle piastre che può portare a contaminazioni accidentali.
2. Eseguire i due passaggi seguenti in una cappa a flusso laminare utilizzando tecniche asettiche. Miscelare ogni pozzetto mediante pipettaggio per garantire la massima disgregazione delle cellule. Trasferire il lisato in una provetta da 2 ml e centrifugare per 15 minuti a 15.000 x g, a temperatura ambiente per rimuovere i detriti cellulari.
3. Trasferire con cautela il surnatante in una nuova provetta da 2 ml. Questo preparato grezzo può essere utilizzato immediatamente senza titolazione o purificazione. Vector può essere conservato a 4 °C per diversi mesi o a -20 °C per anni.
   NOTA: Se necessario, i titoli possono essere calcolati mediante PCR quantitativa (qPCR) quantificando il numero di genomi vettoriali (VG) all'interno di particelle resistenti alla DNasi. Pertanto, i titoli sono espressi in unità di VG/mL. Il vettore conservato per diversi mesi a 4 °C deve essere rititolato prima dell'uso, in quanto il vettore può aggregare e/o legare le pareti delle provette, riducendo il titolo del preparato.

5. Trasduzione

1. Piastra il tipo di cellula desiderato (ad es. Huh7) in una piastra a 96 pozzetti con una confluenza target del 50%-75%, a seconda della durata della trasduzione. Una maggiore confluenza può comportare una riduzione dell'efficienza di trasduzione dell'AAV.
2. Aggiungere un vettore (ad esempio, CMV.mScarlet) alle cellule senza conoscere il titolo del preparato grezzo per applicazioni in cui la dose non è rilevante, come testare un pannello di capsidi per la trasduzione in un nuovo tipo di cellula. Eseguire una serie di diluizioni 1:3 del preparato grezzo in terreni privi di siero (SF) per ottenere la quantità ottimale di vettore necessaria per l'applicazione. Aspirare i terreni da una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 50-100 μL di preparato grezzo diluito ai pozzetti. Incubare le cellule a 37 °C e al 5% di CO₂ .
   NOTA: Il siero può contenere anticorpi in grado di neutralizzare il vettore AAV e ridurre l'efficienza di trasduzione. Tuttavia, il siero può essere utilizzato durante la trasduzione per i tipi di cellule sensibili.
3. Rimuovere il vettore dopo 48 ore dalla post-trasduzione (hpt) e lavare le celle una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) preriscaldata. I vettori possono anche essere rimossi e sostituiti con terreni contenenti siero non appena 2 hpt per i tipi di cellule sensibili. Per molte applicazioni, eseguire l'incubazione notturna per trasdurre le cellule e sostituire i pozzetti con terreni freschi contenenti siero al mattino. I tipi di cellule robuste, come Huh7 e U2-OS, non richiedono un cambio di terreno.
4. Terminare la trasduzione fissando le cellule in paraformaldeide al 4% (PFA) per 10 min. In base all'applicazione è inoltre possibile utilizzare vari metodi di terminazione (ad es. lisi). Per la maggior parte dei tipi di cellule, il picco di espressione si verifica entro 48 hpt ed è quindi un endpoint sperimentale comune.

6. Variazioni sul metodo di trasduzione per tipo di cellula

NOTA: Diversi tipi di cellule richiedono condizioni di coltura diverse. Pertanto, l'aggiunta del vettore per la trasduzione deve essere ottimizzata in base alle esigenze del tipo di cellula. Di seguito sono riportati protocolli di trasduzione molto specifici per i tipi di cellule inclusi nei risultati rappresentativi, che illustrano alcune varianti dei protocolli di trasduzione che un ricercatore potrebbe voler provare per le proprie esigenze.

1. Organoidi dell'intestino tenue di topo
   1. Derivare organoidi dell'intestino tenue (mSIO) di topo da una preparazione della cripta dell'intestino tenue da topi C57BL/6J. Incorporare organoidi in matrice di membrana basale al 90% e coltura in piastre a 24 pozzetti contenenti terreno di crescita organoide (senza antibiotici) o terreno di pre-trasduzione (terreno condizionato al 50% con Wnt3a [prodotto internamente utilizzando cellule L Wnt-3A in terreno di crescita organoide], 10 mM di nicotinamide, 10 μM di inibitore ROCK e 2,5 μM CHIR99021) per un passaggio (5-7 giorni) prima della trasduzione a 37 °C e 5% di CO₂ .
   2. Prima della trasduzione, sciacquare gli organoidi con D-PBS, rompere le cupole della matrice della membrana basale mediante pipettaggio e dissociare gli organoidi in piccoli cluster cellulari incubandoli in terreno di dissociazione per 10 minuti a 37 °C e pipettando ulteriormente.
   3. Arrestare il processo di dissociazione cellulare aggiungendo il 5% di FBS in DMEM/F-12 con HEPES da 15 mM, trasferire i cluster di cellule nelle provette da centrifuga e raccogliere i cluster di cellule mediante centrifugazione per 5 minuti a 1000 x g, a temperatura ambiente.
   4. Risospendere i cluster cellulari nel mezzo di trasduzione (terreno di pre-trasduzione contenente 10 μg/mL di polibrene o terreno di crescita organoide contenente 10 μg/mL di polibrene) e trasferire in piastre da 48 pozzetti, seguito dall'aggiunta di preparati grezzi AAV che confezionano CMV.mScarlet per la trasduzione.
   5. Eseguire la trasduzione degli organoidi centrifugando la piastra per 1 ora a 600 x g e 37 °C e quindi incubare a 37 °C per altre 6 ore. Raccogliere gli organoidi trasdotti in provette da microcentrifuga da 1,5 mL, centrifugare per 5 minuti a 1000 x g, a temperatura ambiente, e mettere in ghiaccio.
   6. Dopo la rimozione del surnatante, risospendere gli organoidi trasdotti in una matrice di membrana basale al 90% in un terreno di pre-trasduzione o in un terreno di crescita dell'organoide e goccioline di semi di 20 μL in un pozzetto di un vetro di copertura a camera preriscaldato.
   7. Dopo un'incubazione di 10 minuti nell'incubatrice, incorporare la gocciolina in 350 μL di terreno di pre-trasduzione o terreno di crescita organoide e incubare a 37 °C nell'incubatrice. Determinare l'efficienza di trasduzione 2-5 giorni dopo la trasduzione visualizzando gli organoidi trasdotti su un microscopio confocale e stimare la percentuale di globuli rossi fluorescenti per organoide.
2. Cellule BeWo
   1. A 24 ore prima della trasduzione, piastre le cellule BeWo del coriocarcinoma placentare umano a 10.000 cellule per pozzetto di piastra a 96 pozzetti. Preparazioni di AAV grezze diluite che confezionano CMV.mScarlet a 1:1 in terreno BeWo F12-K privo di siero fino a un volume totale di 50 μL per pozzetto. Aspirare il terreno dal pozzetto e sostituirlo con 50 μL di AAV diluito per pozzetto.
   2. Incubare le cellule a 37 °C per una notte (~18 h) e quindi aggiungere 100 μL di terreno BeWo F12-K contenente il 10% di FBS per portare il volume totale a 150 μL. Incubare le cellule per altre 6 ore per un totale di 24 ore post-trasduzione (hpt).
   3. Per l'imaging, colorare le cellule vive con il colorante Hoechst per 30 minuti in terreno F12-K, quindi sostituire il terreno con DMEM privo di fenolo contenente il 10% di FBS, 1x integratore di glutamax e 1x integratore di piruvato di sodio per l'imaging. Eseguire l'imaging di cellule vive su un microscopio confocale utilizzando set di filtri DAPI (per l'imaging Hoechst) e mCherry (per l'imaging mScarlet) con 37 °C e 5% di CO₂ .
3. Cellule Hepa1-6 e Huh7
   1. Cellule epatiche Hepa1-6 murine su piastra e cellule epatiche umane Huh7 in DMEM (4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di piruvato di sodio, 10% FBS) a 5.000 cellule per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti 24 ore prima della trasduzione.
   2. Aggiungere 50 μL di preparati grezzi non diluiti di AAV che confezionano CMV.mScarlet direttamente sulle cellule e incubare a 37 °C per 48 ore. Lavare le cellule una volta in PBS, fissare in PFA al 4% e colorare con colorante Hoechst per 10 min. Eseguire l'imaging su un microscopio confocale utilizzando i set di filtri DAPI (per l'imaging Hoechst) e mCherry (per l'imaging mScarlet).
4. Celle C2C12 e HSkMC
   1. Piastra di mioblasti murini indifferenziati C2C12 e mioblasti di cellule muscolari scheletriche primarie umane indifferenziate (HSkMC) a 5.000 cellule per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, 72 ore prima della trasduzione.
   2. Preparazioni di AAV grezze diluite che confezionano CMV.mScarlet a 1:1 in DMEM (4,5 g/L di glucosio, Penn/Strep, 20% FBS) per mioblasti C2C12 o terreni di crescita del muscolo scheletrico per mioblasti HSkMC. Differenziare i mioblasti HSkMC in miotubi cambiando il mezzo in mezzo di differenziazione.
   3. Incubare mioblasti e miotubi in preparati AAV diluiti per 24 ore a 37 °C. Colorare le cellule vive con il colorante Hoechst per 10 minuti e visualizzarle su un microscopio confocale utilizzando i set di filtri DAPI (per l'imaging Hoechst) e mCherry (per l'imaging mScarlet).

Individuazione del capside ottimale per la trasduzione delle cellule in coltura di interesse
Una varietà di tipi di cellule è stata trasdotta per determinare il tropismo di vari sierotipi di capsidi (Figura 5). I sierotipi naturali AAV214, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 e le varianti del capside ingegnerizzate Anc80 25, DJ 26, LK0327 eKP1 28 sono stati impacchettati con un genoma vettore che esprime mScarlet sotto un promotore di CMV, clonato utilizzando i metodi forniti in questo protocollo. Le preparazioni di vettori grezzi non titolati sono state diluite nei terreni di coltura appropriati e le cellule sono state trasdotte per 24+ ore e sottoposte a imaging (Figura 5B). L'efficienza di trasduzione è stata calcolata in base alla proporzione di cellule totali che erano mScarlet+, o la proporzione di cellule in un singolo piano z che erano mScarlet+ (per gli organoidi dell'intestino tenue di topo; Figura 5C). Le efficienze di trasduzione (cellule mScarlet+) non sono fornite per i miotubi differenziati C2C12 e HSkMC, ma piuttosto per i mioblasti C2C12 e HSkMC indifferenziati (Figura 5A).

AAV2 e KP1 sono risultati i sierotipi più potenti tra le linee cellulari testate (Figura 5A). È stato anche osservato che tipi di cellule simili provenienti da specie diverse vengono trasdotti con efficienze variabili. Ad esempio, Hepa1-6 (una linea cellulare epatica derivata da murina) mostra una marcata diminuzione della trasduzione rispetto a Huh7 (una linea cellulare epatica derivata dall'uomo) quando si utilizza AAV2 (Figura 5B). Inoltre, le diverse condizioni dei mezzi giocano un ruolo importante durante la trasduzione. Gli organoidi dell'intestino tenue di topo (mSIO) coltivati in terreni di pre-trasduzione sono trasdotti in modo meno efficace rispetto a quelli coltivati in terreni di crescita organoidi (Figura 5C). Inoltre, AAV2 trasduce in modo efficiente i mioblasti HSkMC indifferenziati e i miotubi HSkMC differenziati (Figura 5B), sebbene l'analisi quantitativa dei miotubi sia difficile e quindi non venga fornita.

Le elevate efficienze di trasduzione osservate per vari tipi di cellule nella Figura 5 mostrano che le preparazioni di vettori grezzi possono essere utilizzate in modo efficace per trasdurre una varietà di tipi di cellule senza ulteriori passaggi come la purificazione e la titolazione. Tuttavia, è necessario prestare un'attenta considerazione quando si sceglie un capside per massimizzare il rilascio del transgene. Molte altre linee cellulari e capsidi sono state precedentemente testate e sono state pubblicate, anche se con preparati vettoriali purificati12.

Un effetto indipendente dalle particelle vettoriali delle condizioni del mezzo può influenzare l'efficienza della trasduzione. Tuttavia, è generalmente accettato che il tropismo (cioè l'assorbimento specifico del tipo di cellula e l'espressione del vettore) sia una proprietà specifica del capside29. Non è stato ancora osservato che un confronto tra preparati grezzi e purificati a dose abbinata influisca sul tropismo cellulare. Pertanto, i preparati di vettori grezzi possono essere utilizzati in modo simile ai vettori purificati in coltura cellulare.

Figura 5: Trasduzione vettoriale grezza di vari tipi cellulari . (A) Percentuale di mScarlet+ in seguito all'aggiunta di vari vettori AAV contenenti un transgene mScarlet . (B) Cellule esprimenti mScarlet rilasciate dal sierotipo AAV 2. Barre della scala: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 e HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Abbreviazioni: hpt = ore dopo la trasduzione. (C) Gli organoidi dell'intestino tenue di topo (mSIO) sono stati trattati con rAAV in terreni di pre-trasduzione o in terreni di crescita organoidi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Foglio di lavoro sulla trasfezione di tripli plasmidi. Fare clic qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 2: Foglio di lavoro per l'ottimizzazione PEI. Fare clic qui per scaricare il file.

A.C.M. è consulente per Janssen Pharmaceuticals e fa parte del SAB per NewBiologix. Tutti gli altri autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.