Espressione di transgeni in cellule in coltura utilizzando vettori virali adeno-associati ricombinanti non purificati

Sommario

Il virus adeno-associato ricombinante (rAAV) è ampiamente utilizzato per la somministrazione genica clinica e preclinica. Un uso sottovalutato per i rAAV è la robusta trasduzione delle cellule in coltura senza la necessità di purificazione. Per i ricercatori che non conoscono l'rAAV, forniamo un protocollo per il clonaggio di cassette transgeniche, la produzione di vettori grezzi e la trasduzione di colture cellulari.

Abstract

I vettori virali adeno-associati ricombinanti (rAAV) possono raggiungere un'espressione transgenica potente e duratura senza integrazione in un'ampia gamma di tipi di tessuto, rendendoli una scelta popolare per la somministrazione genica in modelli animali e in contesti clinici. Oltre alle applicazioni terapeutiche, gli rAAV sono un utile strumento di laboratorio per la somministrazione di transgeni su misura per le esigenze sperimentali e gli obiettivi scientifici del ricercatore nelle cellule in coltura. Alcuni esempi includono geni reporter esogeni, cassette di sovraespressione, interferenza dell'RNA e strumenti basati su CRISPR, compresi quelli per gli screening dell'intero genoma. Le trasduzioni di rAAV sono meno dannose per le cellule rispetto all'elettroporazione o alla trasfezione chimica e non richiedono attrezzature speciali o reagenti costosi per essere prodotte. I lisati grezzi o i terreni condizionati contenenti rAAV possono essere aggiunti direttamente alle cellule in coltura senza ulteriore purificazione per trasdurre molti tipi di cellule, una caratteristica sottovalutata degli rAAV. Qui, forniamo protocolli per il clonaggio di cassette transgeniche di base e dimostriamo come produrre e applicare preparazioni di rAAV grezze alle cellule in coltura. Come prova di principio, dimostriamo la trasduzione di tre tipi di cellule che non sono ancora state riportate nelle applicazioni rAAV: cellule placentari, mioblasti e organoidi dell'intestino tenue. Discutiamo gli usi appropriati per le preparazioni di rAAV grezze, i limiti dei rAAV per la consegna genica e le considerazioni per la scelta del capside. Questo protocollo delinea un metodo semplice, economico ed efficace per i ricercatori per ottenere la consegna produttiva del DNA in coltura cellulare utilizzando rAAV senza la necessità di laboriose fasi di titolazione e purificazione.

Introduzione

Chiarire le basi molecolari delle funzioni cellulari spesso richiede l'espressione di DNA transgenico in coltura cellulare. Per essere espressi, i transgeni devono penetrare attraverso la membrana selettiva di una cellula e raggiungere il nucleo ^1,2. Pertanto, la capacità di aggirare efficacemente le barriere fisiche della cellula e manipolare i suoi processi centrali è una necessità per applicare la transgenesi alla scoperta di nuovi fenomeni biologici. Un approccio sfrutta la capacità intrinseca dei virus di veicolare ed esprimere DNA estraneo ^3,4.

Il virus adeno-associato (AAV) è uno dei più piccoli virus dei mammiferi: il suo genoma a DNA a singolo filamento di 4,7 kilobasi (kb) contiene due geni, rep (per la replicasi) e cap (per il capside), impacchettati all'interno di un capside icosaedrico di 60 mer che misura 25 nm. I geni rep/cap hanno più promotori, frame di lettura e prodotti di splicing che codificano per almeno nove proteine uniche necessarie per la replicazione, la produzione e il confezionamento virale ^5,6. Inoltre, entrambe le estremità del genoma contengono strutture secondarie chiamate ripetizioni terminali invertite (ITR) che sono necessarie per la replicazione del DNA, l'impacchettamento del genoma e l'elaborazione a valle durante la trasduzione 7,8,9,10. Gli ITR sono gli unici elementi del DNA necessari per l'impacchettamento del genoma nel capside, e quindi l'AAV può essere clonato per scopi di trasporto del transgene sostituendo i geni rep/cap virali con elementi regolatori e/o geni di interesse⁶ scelti dal ricercatore. L'AAV ricombinante risultante (rAAV), con un genoma vettoriale ingegnerizzato (VG), è ampiamente utilizzato in clinica per la terapia genica umana e ha accumulato successi¹¹. Un uso sottovalutato del vettore è in laboratorio; Gli rAAV possono raggiungere in modo efficiente l'espressione del transgene nelle cellule in coltura per soddisfare le esigenze sperimentali di un ricercatore¹².

Il metodo più comune per la produzione di rAAV è la trasfezione a triplo plasmide in cellule HEK293 o 293T (Figura 1). Il primo plasmide, comunemente chiamato plasmide cis, contiene il transgene desiderato affiancato da ITR (pAAV). A seconda dell'applicazione, sono disponibili per l'acquisto plasmidi cis con elementi comuni, come promotori forti o strumenti basati su CRISPR. Il secondo è il plasmide pRep/Cap che contiene i geni wild-type AAV rep e cap forniti in-trans, cioè su un plasmide separato, non contenente ITR che esprime elementi regolatori e strutturali che poi interagiscono con il plasmide cis, ed è quindi chiamato plasmide trans. Oltre a racchiudere fisicamente il VG, il capside influenza il tropismo cellulare^12,13. Fornendo il gene cap specifico per il sierotipo in-trans, i ricercatori sono facilmente in grado di massimizzare l'efficienza di trasduzione scegliendo un sierotipo del capside ottimizzato per la loro cellula bersaglio. Infine, come Dependoparvovirus, l'AAV richiede che un virus helper attivi l'espressione rep/cap dai suoi promotori virali, ottenuta dai geni helper adenovirali, forniti su un terzo plasmide come pAdΔF6^14,15. Dopo 72 ore di trasfezione a triplo plasmide, il vettore può essere rilasciato dalle cellule produttrici nel terreno di coltura mediante ripetuti cicli di congelamento/disgelo. L'intero contenuto della piastra viene quindi raccolto e i detriti cellulari di grandi dimensioni vengono rimossi mediante centrifugazione; il surnatante del terreno risultante è una preparazione grezza di rAAV pronta per le trasduzioni a valle.

Figura 1: Panoramica della produzione di vettori rAAV grezzi. La produzione e la trasduzione di rAAV grezzi possono essere effettuate entro 5 giorni. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

rAAV può essere più favorevole per la somministrazione di transgeni rispetto ad altri metodi di trasfezione, che sono comunemente associati a tossicità cellulare, bassa efficienza e reagenti e attrezzature costosi, come per l'elettroporazione o la trasfezione a base chimica/lipidica^16,17. rAAV aggira questi ostacoli e spesso fornisce una potente espressione transgenica con una tossicità minima e un tempo di intervento minimo. È importante sottolineare che la produzione di rAAV e la sua applicazione in coltura cellulare sono semplici e raramente richiedono la purificazione del vettore dal terreno di coltura (Figura 1). Inoltre, rAAV non integra il suo VG nel genoma dell'ospite, a differenza del rilascio del transgene lentivirale, e quindi riduce il rischio di mutagenesi inserzionale¹⁸. Nonostante i potenziali benefici dell'utilizzo di rAAV per la somministrazione di transgeni, è necessario considerare i limiti. È importante sottolineare che la dimensione del transgene, compresi gli ITR, non dovrebbe superare i 4,9 kb a causa dei vincoli fisici del capside, limitando così la capacità di un ricercatore di fornire efficacemente elementi regolatori e transgeni di grandi dimensioni. Inoltre, poiché rAAV è un virus non integrante, la trasduzione provoca un'espressione transgenica transitoria nelle cellule in divisione e potrebbe non essere pratica per un'espressione stabile. Tuttavia, i metodi che utilizzano il doppio Cas9 somministrato da rAAV e i modelli di riparazione diretta all'omologia (HDR) possono essere utilizzati per inserire stabilmente sequenze in loci genomici specifici, se un ricercatore lo desidera¹⁹.

Protocollo

1. Acquisizione di plasmidi

NOTA: Questo protocollo clonerà un gene di interesse (GOI) in un plasmide contenente ITR con un promotore del citomegalovirus (CMV) e una sequenza di poli-adenilazione SV40 (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). Tuttavia, questo plasmide può essere utilizzato senza ulteriore clonazione per produrre rAAV, confezionando un comodo doppio reporter EGFP e Luciferasi. I plasmidi con diversi elementi regolatori o per diverse applicazioni, ad esempio per esperimenti basati su CRISPR, sono disponibili online e seguiranno fasi di clonazione simili a quelle riportate di seguito (vedere la discussione per ulteriori fasi di clonazione). Inoltre, è possibile utilizzare plasmidi rep/cap o trans per diversi sierotipi: questo protocollo utilizzerà rep/cap per il sierotipo AAV 2.

1. Acquista pugnalate batteriche contenenti un plasmide cis contenente ITR, un plasmide helper dell'adenovirus, un plasmide rep/cap e un plasmide contenente un GOI. Strisciare i batteri su singole piastre di agar contenenti antibiotici specifici per la resistenza di ciascun plasmide. Incubare i batteri a 30 °C per una notte per farli crescere.
   NOTA: Se un plasmide con un GOI non è prontamente disponibile per l'acquisto, è possibile acquistare online un frammento di DNA sintetico (vedi Tabella dei materiali). Inoltre, un frammento di DNA sintetico può essere utilizzato per saltare l'intero processo di PCR, se lo si desidera.
2. Prelevare una singola colonia da ogni piastra e far crescere in 3 mL di tampone Luria Bertani (LB) integrato con il corrispondente antibiotico a 30 °C per una notte, agitando a 180 giri/min. Trasferire 1 mL di batteri in un matraccio sterile da 250 mL contenente 50 mL di tampone LB integrato con l'antibiotico corrispondente. Agitare a 30 °C, 180 giri/min per tutta la notte.
3. Trasferire i batteri in una provetta conica da 50 ml e centrifugare per 20 minuti a 3.000 x g, a temperatura ambiente. Scartare il surnatante. Isolare il plasmide utilizzando un kit midiprep a basso contenuto di endotossine o privo di endotossine secondo le istruzioni del produttore.
   NOTA: gli ITR sono strutture instabili. Per prevenire delezioni o mutazioni di ITR, le cellule batteriche devono essere coltivate a 30 °C per rallentare la divisione cellulare e mitigare gli errori di replicazione. Per aumentare la resa e la purezza del plasmide, un kit midiprep o maxiprep è l'ideale. Si raccomanda di utilizzare un kit a basso contenuto di endotossine o privo di endotossine per ridurre la contaminazione da endotossine a valle delle cellule. Non è necessario eseguire l'isolamento del plasmide all'interno di una cappa a flusso laminare, poiché la contaminazione della preparazione plasmidica non è probabile se eseguita su un banco standard.

2. Clonaggio del gene di interesse in un plasmide contenente AAV ITR

1. Aprire la mappa plasmidica contenente il GOI in un software di visualizzazione del DNA.
   NOTA: La cassetta completa, compresi gli ITR, non deve superare i 4,9 kb a causa delle limitazioni dell'imballaggio fisico del capside. Inoltre, l'amplificazione della PCR non può essere ottenuta attraverso gli ITR a causa delle strutture secondarie. Pertanto, l'assemblaggio Gibson non è raccomandato per la clonazione del transgene rAAV.
   1. Fare clic sulla scheda Sequenza per visualizzare la sequenza completa del plasmide. Scorri fino alla regione più lontana di 5' della sequenza GOI e fai clic sul primo nucleotide trascinando verso l'interno verso il corpo del gene per creare un primer in avanti. Rilasciare una volta raggiunta una temperatura di fusione (Tm) di ~55 °C.
   2. Fare clic su Forward Primer. Includere manualmente la sequenza per un sito di restrizione EcoRI (5' GAATTC 3') all'estremità 5' della sequenza di primer. Inoltre, aggiungere sei basi casuali extra all'estremità 5' di questo sito di restrizione per consentire all'enzima di interagire in modo efficiente con il DNA. Fare clic su Aggiungi primer. Fare riferimento alla Figura 2 per un esempio rappresentativo.
   3. Controllare il primer per assicurarsi che non possa formare forcine o dimeri di primer (ad eccezione del sito di restrizione che è palindromico). Se si formano delle forcine, cambia la sequenza casuale delle sei basi extra. Inoltre, assicurarsi che il primer non si leghi in nessun altro punto del plasmide.
   4. Ripetere i passaggi per creare un primer inverso nella regione 3' più grande del GOI verso l'interno del corpo del gene. Fare clic su Reverse Primer e includere un sito di restrizione NotI (5' GCGGCCGC 3').
      NOTA: Il GOI non può contenere siti di restrizione EcoRI o NotI – in tal caso, sarà necessario utilizzare enzimi di restrizione diversi.
2. Amplificare il GOI in una reazione PCR da 50 μL. Utilizzare i singoli componenti richiesti dalla Tabella 1.
   1. Posizionare la reazione in un termociclatore e seguire i parametri del ciclo della Tabella 2 per la programmazione. Se i primer hanno un T m diverso, utilizzare il T_m più basso per il programma.
   2. Verificare l'amplificazione del frammento PCR corretto aggiungendo 1 μL di colorante di caricamento del gel (6x) a 5 μL di reazione PCR. Eseguire una scala di DNA e la miscela PCR su un gel di agarosio allo 0,8% contenente bromuro di etidio e visualizzare con luce UV.
      ATTENZIONE: Il bromuro di etidio è un mutageno noto.
   3. Se sul gel appare una singola fascia specifica, purificare il prodotto PCR rimanente nella provetta della striscia PCR utilizzando un kit di pulizia PCR basato su colonna secondo le istruzioni del produttore. Se compaiono più bande (a causa di un'amplificazione non specifica), asportare la banda desiderata e purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
3. Digerire il prodotto PCR purificato e il plasmide della spina dorsale pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 in una reazione di 50 μL con i singoli componenti richiesti dalla Tabella 3 per 1 ora a 37 °C. È necessaria una maggiore quantità di DNA plasmidico pAAV a causa del recupero inefficiente previsto dopo l'estrazione del gel.
   NOTA: Gli enzimi di restrizione utilizzati sono versioni ad alta fedeltà (HF). Regular NotNon posso essere utilizzato con il buffer CutSmart. Se vengono utilizzati enzimi diversi, potrebbero essere necessari una temperatura di incubazione e un tampone diversi.
   1. Purificare il prodotto PCR digerito con un kit di pulizia PCR basato su colonna secondo le istruzioni del produttore.
   2. Preparare il plasmide spinale pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 digerito per l'elettroforesi su gel aggiungendo 10 μL di colorante di caricamento gel (6x) a 50 μL di reazione di digestione. Caricare una scala di DNA, una reazione di digestione e 250 ng di plasmide non digerito (controllo negativo) su un gel di agarosio allo 0,8% contenente bromuro di etidio con pozzetti a denti larghi. Visualizzare con la luce UV, asportare il frammento desiderato (~4,5 kb) e purificare il DNA utilizzando un kit di estrazione del gel secondo le istruzioni del produttore.
4. Legare il prodotto PCR digerito e il plasmide della spina dorsale pAAV digerito in una reazione di legatura di 20 μL con i singoli componenti richiesti dalla Tabella 4. Per calcolare la quantità di prodotti PCR necessari, utilizzare la Formula 1. In genere, utilizzare un rapporto molare 3:1 tra prodotto PCR (inserto) e spina dorsale (pAAV), con una massa di 50 ng di spina dorsale.
   Formula 1
5. Eseguire un controllo negativo sostituendo il prodotto PCR con acqua. Incubare le reazioni di legatura a 16 °C per una notte o a temperatura ambiente per 2 ore.
6. Scongelare una fiala di cellule batteriche competenti e carenti di ricombinazione (come le cellule Stbl3) su ghiaccio e posizionare 50 μL in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 3 μL della reazione di legatura direttamente sulle cellule e incubare su ghiaccio per 30 minuti.
   NOTA: Gli ITR sono strutture instabili e pertanto richiedono ceppi batterici carenti di ricombinazione per limitare gli eventi di delezione e ricombinazione degli ITR. Le cellule DH5α possono essere utilizzate in modo intermittente per la propagazione (una o due volte), ma non sono raccomandate per l'uso a lungo termine. L'integrità dell'ITR deve essere controllata regolarmente dopo la purificazione midiprep.
   1. Trasferire i batteri a bagnomaria a 42 °C per 30 secondi, quindi trasferire immediatamente nel ghiaccio per 2 minuti. Aggiungere 200 μL di tampone LB e agitare per 1 ora a 30 °C, 180 giri/min.
   2. Distribuire 125 μL della miscela su una piastra di agar con l'antibiotico corrispondente e incubare per una notte (~18 h) a 30 °C. Prelevare più cloni e metterli in una provetta di plastica sterile con 3 mL di LB contenente l'antibiotico corrispondente. Incubare per una notte agitando a 30 °C, 180 giri/min.
      NOTA: Per prevenire delezioni o mutazioni di ITR, le cellule batteriche devono essere coltivate a 30 °C per rallentare la divisione cellulare e mitigare gli errori di replicazione. Inoltre, le colonie più piccole dovrebbero essere scelte in quanto quelle senza ITR possono avere un vantaggio di crescita rispetto alle altre.
   3. Pipettare 1,8 mL di ciascuna coltura in una provetta da 2 mL e centrifugare a 6.000 x g per 3 minuti, a temperatura ambiente. Isolare il DNA utilizzando un kit miniprep. Conservare i restanti 1,2 mL di coltura a 4 °C. Verificare i cloni corretti mediante sequenziamento del DNA o digestione dell'enzima di restrizione diagnostica.
      NOTA: Si consiglia il sequenziamento con metodo Sanger dell'inserto, ma la processività tramite ITR non è ottenibile con i metodi standard. Gli ITR devono essere verificati mediante digest di restrizione come descritto di seguito.
   4. Aggiungere 50 mL di tampone LB contenente l'antibiotico corrispondente a un matraccio sterile da 250 mL. Aggiungere 500 μL della coltura rimanente nel matraccio e agitare a 30 °C, 180 giri/min fino a raggiungere un OD₆₀₀ di 0,2-0,5 (~18 h). Trasferire i batteri in una provetta conica da 50 mL e centrifugare per 20 minuti a 3.000 x g, 4 °C. Isolare il DNA utilizzando un kit midiprep a basso contenuto di endotossine o privo di endotossine.
   5. Controllare l'integrità dell'ITR con 20 μL di digestione dell'enzima di restrizione diagnostica utilizzando XmaI (o SmaI). Preparare una reazione contenente 500 ng di plasmide, 0,5 μL di enzima e 1x tampone; incubare per 1 ora a 37 °C. Eseguire la reazione su un gel di agarosio allo 0,8%. Se gli ITR sono intatti, la digestione darà una banda a ~2,9 kb e un'altra banda delle dimensioni della cassetta. Se questa banda distinta non viene osservata, l'ITR potrebbe non essere intatta e la clonazione dovrà essere ripetuta.
      NOTA: I plasmidi contenenti siti di restrizione XmaI (o SmaI) (oltre a quelli negli ITR) avranno bande aggiuntive sul gel.

Figura 2: Esempio rappresentativo per la progettazione di primer. Progettazione di primer diretti e inversi per un transgene mScarlatto (esempio rappresentativo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Importo	Componente
X μL	DNA modello (25 ng)
1 μL	Primer F (10 μM)
1 μL	Primer R (10 μM)
1 μL	dNTP (10 mM)
10 μL	Tampone di Phusion (5x)
1 μL	Polimerasi di Phusion
X μL	Acqua
50 μL	Volume finale

Tabella 1: Reagenti di amplificazione PCR. I componenti necessari per una reazione PCR di successo.

Passo	Temperatura	Ore
Denaturazione iniziale	98 °C	1 minuto
30 cicli	98 °C	10 secondi
	Tm di Primer	30 secondi
	72 °C	30 s per kb
Estensione finale	72 °C	10 minuti
Tenere	4 °C	indefinitamente

Tabella 2: Programmazione dell'amplificazione PCR. I parametri ciclici necessari per una reazione PCR di successo.

Importo	Componente
X μL	Prodotto PCR (1μg) o plasmide pAAV (3μg)
5 μL	Tampone (10x)
1 μL	EcoRI-HF
1 μL	NotI-HF
X μL	Acqua
50 μL	Volume finale

Tabella 3: Reagenti per la digestione. I componenti necessari per una reazione digestiva di successo.

Importo	Componente
X μL	Inserisci (X ng)
X μL	Spina dorsale (50 ng)
2 μL	Tampone DNA ligasi T4 (10x)
1 μL	T4 DNA ligasi
X μL	Acqua
20 μL	Volume finale

Tabella 4: Reagenti di legatura. I componenti necessari per una reazione di legatura di successo.

3. Produzione vettoriale con trasfezione a triplo plasmide

NOTA: I seguenti valori sono ottimizzati per un singolo pozzetto di una piastra a 6 pozzetti che produce un volume finale di preparazione del greggio di 2 mL. Tutti i valori possono essere aumentati di 10 volte per una piastra da 15 cm che produce un volume finale di 20 mL o ridotti di 4 volte per una piastra a 24 pozzetti con un volume finale di 500 μL.

1. Ottenere una scorta di 1 μg/μL di polietilenimmina cloridrato (PEI) MAX sciogliendo 100 mg di PEI MAX in 100 mL di acqua distillata. Regolare il pH a 7,1 con NaOH. Filtrare: sterilizzare la miscela con un filtro da 0,22 μm e congelare aliquote da 1 mL a -20 °C per una conservazione a lungo termine. Una volta scongelato, conservare il reagente per 1 mese a 4 °C.
2. Seminare 3 x 10 5 cellule HEK293 o HEK293T in una piastra a 6 pozzetti con terreno di aquila modificato di Dulbecco preriscaldato (DMEM,^4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di piruvato di sodio) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS). Crescere fino a ~75%-90% di confluenza in un'incubatrice impostata a 37 °C e 5% di CO₂ (Figura 3).
   NOTA: È stato osservato che le cellule coltivate con penicillina/streptomicina (P/S) diminuiscono la resa di produzione del vettore. L'uso di una corretta tecnica sterile evita la necessità di utilizzare P/S, e quindi si raccomanda di non coltivare le cellule HEK293 con l'antibiotico²⁰. Se è richiesto P/S nelle trasduzioni a valle, si raccomanda di aggiungere P/S alla preparazione del greggio dopo la raccolta.
3. In una provetta da 2 mL, preparare una miscela contenente 1,3 μg di pAAV2/2 (Rep/Cap, sierotipo 2), 1,3 μg di pAAV.GOI, 2,6 μg di pAdΔF6 e DMEM privo di siero (SF) (4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di piruvato di sodio) in un volume totale di 100 μL (vedere la Tabella supplementare 1 per un comodo calcolo).
4. Preparare un controllo negativo in una provetta separata sostituendo pRep/Cap con qualsiasi plasmide non correlato. Il controllo negativo tiene conto del plasmide pAAV.GOI non confezionato presente nella preparazione grezza che potrebbe eventualmente trasfettare le cellule durante la trasduzione, anche se raramente.
   NOTA: Il plasmide maxiprep o midiprep a basso contenuto di endotossine o privo di endotossine è ideale per la tripla trasfezione e generalmente produce un vettore di titolo più elevato rispetto al DNA miniprep, sebbene il DNA miniprep possa essere utilizzato per test preliminari rapidi e sporchi.
5. Aggiungere 5,2 μL di PEI MAX alla miscela plasmidico; si tratta di una miscela plasmide:PEI con un rapporto di 1:1. Mescolare bene pulsando 10-15 volte su un mixer a vortice impostato a 7. Se vengono prodotte più preparazioni vettoriali, aggiungere PEI a ciascuna miscela plasmidica a intervalli di tempo scaglionati di 1 minuto (ad esempio, preparazione 1 a t = 0 min, preparazione 2 a t = 1 min, ecc.) per consentire un tempo sufficiente per aspirare i pozzetti e diluire la reazione nelle fasi successive.
   NOTA: È stato osservato che un rapporto 1:1 di plasmide:PEI è ottimale. Tuttavia, i singoli utenti possono ottimizzare questo rapporto per la massima efficienza. Fare riferimento alla discussione su come eseguire l'ottimizzazione PEI (vedere anche la Tabella supplementare 2).
6. Incubare ogni provetta per esattamente 15 minuti e poi diluire la reazione con 1,9 mL di SF DMEM (4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di piruvato di sodio) per un volume finale di 2 mL. Pipettare delicatamente 2 volte per mescolare. L'eccessiva miscelazione interromperà i complessi plasmidi/PEI e si tradurrà in una minore efficienza di trasfezione.
7. Aspirare il terreno dal pozzo e aggiungere delicatamente la miscela plasmidico:PEI sui lati del pozzetto per prevenire il distacco cellulare. Incubare le cellule per 72 ore a 37 °C e al 5% di CO₂ . La lisi e il distacco cellulare durante l'incubazione è un normale processo di produzione di rAAV (Figura 4).

Figura 3: Celle HEK293 pronte per la trasfezione. La confluenza ideale (75%-90%) delle cellule HEK293 necessarie per la trasfezione del triplo plasmide. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Cellule HEK293 dopo la trasfezione. La comparsa di cellule HEK293 prima e dopo 1, 2 o 3 giorni dopo la trasfezione con pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 e rapporto 1:1 di plasmide:PEI. Barre della scala: 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

4. Raccolta di preparati vettoriali grezzi

1. Congelare l'intera piastra di cellule trasfettate per 30 minuti a -80 °C, seguito da uno scongelamento per 30 minuti a 37 °C. Ripetere per un totale di tre cicli di congelamento/scongelamento. Non rimuovere il coperchio: la piastra deve rimanere sterile all'interno. Le piastre possono rimanere a -80 °C fino a quando non sono pronte per procedere alle fasi successive.
   NOTA: Un'incubatrice non umidificata funziona meglio per lo scongelamento, che riduce al minimo la condensa all'esterno delle piastre che può portare a contaminazioni accidentali.
2. Eseguire i due passaggi seguenti in una cappa a flusso laminare utilizzando tecniche asettiche. Miscelare ogni pozzetto mediante pipettaggio per garantire la massima disgregazione delle cellule. Trasferire il lisato in una provetta da 2 ml e centrifugare per 15 minuti a 15.000 x g, a temperatura ambiente per rimuovere i detriti cellulari.
3. Trasferire con cautela il surnatante in una nuova provetta da 2 ml. Questo preparato grezzo può essere utilizzato immediatamente senza titolazione o purificazione. Vector può essere conservato a 4 °C per diversi mesi o a -20 °C per anni.
   NOTA: Se necessario, i titoli possono essere calcolati mediante PCR quantitativa (qPCR) quantificando il numero di genomi vettoriali (VG) all'interno di particelle resistenti alla DNasi. Pertanto, i titoli sono espressi in unità di VG/mL. Il vettore conservato per diversi mesi a 4 °C deve essere rititolato prima dell'uso, in quanto il vettore può aggregare e/o legare le pareti delle provette, riducendo il titolo del preparato.

5. Trasduzione

1. Piastra il tipo di cellula desiderato (ad es. Huh7) in una piastra a 96 pozzetti con una confluenza target del 50%-75%, a seconda della durata della trasduzione. Una maggiore confluenza può comportare una riduzione dell'efficienza di trasduzione dell'AAV.
2. Aggiungere un vettore (ad esempio, CMV.mScarlet) alle cellule senza conoscere il titolo del preparato grezzo per applicazioni in cui la dose non è rilevante, come testare un pannello di capsidi per la trasduzione in un nuovo tipo di cellula. Eseguire una serie di diluizioni 1:3 del preparato grezzo in terreni privi di siero (SF) per ottenere la quantità ottimale di vettore necessaria per l'applicazione. Aspirare i terreni da una piastra a 96 pozzetti e aggiungere 50-100 μL di preparato grezzo diluito ai pozzetti. Incubare le cellule a 37 °C e al 5% di CO₂ .
   NOTA: Il siero può contenere anticorpi in grado di neutralizzare il vettore AAV e ridurre l'efficienza di trasduzione. Tuttavia, il siero può essere utilizzato durante la trasduzione per i tipi di cellule sensibili.
3. Rimuovere il vettore dopo 48 ore dalla post-trasduzione (hpt) e lavare le celle una volta con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) preriscaldata. I vettori possono anche essere rimossi e sostituiti con terreni contenenti siero non appena 2 hpt per i tipi di cellule sensibili. Per molte applicazioni, eseguire l'incubazione notturna per trasdurre le cellule e sostituire i pozzetti con terreni freschi contenenti siero al mattino. I tipi di cellule robuste, come Huh7 e U2-OS, non richiedono un cambio di terreno.
4. Terminare la trasduzione fissando le cellule in paraformaldeide al 4% (PFA) per 10 min. In base all'applicazione è inoltre possibile utilizzare vari metodi di terminazione (ad es. lisi). Per la maggior parte dei tipi di cellule, il picco di espressione si verifica entro 48 hpt ed è quindi un endpoint sperimentale comune.

6. Variazioni sul metodo di trasduzione per tipo di cellula

NOTA: Diversi tipi di cellule richiedono condizioni di coltura diverse. Pertanto, l'aggiunta del vettore per la trasduzione deve essere ottimizzata in base alle esigenze del tipo di cellula. Di seguito sono riportati protocolli di trasduzione molto specifici per i tipi di cellule inclusi nei risultati rappresentativi, che illustrano alcune varianti dei protocolli di trasduzione che un ricercatore potrebbe voler provare per le proprie esigenze.

1. Organoidi dell'intestino tenue di topo
   1. Derivare organoidi dell'intestino tenue (mSIO) di topo da una preparazione della cripta dell'intestino tenue da topi C57BL/6J. Incorporare organoidi in matrice di membrana basale al 90% e coltura in piastre a 24 pozzetti contenenti terreno di crescita organoide (senza antibiotici) o terreno di pre-trasduzione (terreno condizionato al 50% con Wnt3a [prodotto internamente utilizzando cellule L Wnt-3A in terreno di crescita organoide], 10 mM di nicotinamide, 10 μM di inibitore ROCK e 2,5 μM CHIR99021) per un passaggio (5-7 giorni) prima della trasduzione a 37 °C e 5% di CO₂ .
   2. Prima della trasduzione, sciacquare gli organoidi con D-PBS, rompere le cupole della matrice della membrana basale mediante pipettaggio e dissociare gli organoidi in piccoli cluster cellulari incubandoli in terreno di dissociazione per 10 minuti a 37 °C e pipettando ulteriormente.
   3. Arrestare il processo di dissociazione cellulare aggiungendo il 5% di FBS in DMEM/F-12 con HEPES da 15 mM, trasferire i cluster di cellule nelle provette da centrifuga e raccogliere i cluster di cellule mediante centrifugazione per 5 minuti a 1000 x g, a temperatura ambiente.
   4. Risospendere i cluster cellulari nel mezzo di trasduzione (terreno di pre-trasduzione contenente 10 μg/mL di polibrene o terreno di crescita organoide contenente 10 μg/mL di polibrene) e trasferire in piastre da 48 pozzetti, seguito dall'aggiunta di preparati grezzi AAV che confezionano CMV.mScarlet per la trasduzione.
   5. Eseguire la trasduzione degli organoidi centrifugando la piastra per 1 ora a 600 x g e 37 °C e quindi incubare a 37 °C per altre 6 ore. Raccogliere gli organoidi trasdotti in provette da microcentrifuga da 1,5 mL, centrifugare per 5 minuti a 1000 x g, a temperatura ambiente, e mettere in ghiaccio.
   6. Dopo la rimozione del surnatante, risospendere gli organoidi trasdotti in una matrice di membrana basale al 90% in un terreno di pre-trasduzione o in un terreno di crescita dell'organoide e goccioline di semi di 20 μL in un pozzetto di un vetro di copertura a camera preriscaldato.
   7. Dopo un'incubazione di 10 minuti nell'incubatrice, incorporare la gocciolina in 350 μL di terreno di pre-trasduzione o terreno di crescita organoide e incubare a 37 °C nell'incubatrice. Determinare l'efficienza di trasduzione 2-5 giorni dopo la trasduzione visualizzando gli organoidi trasdotti su un microscopio confocale e stimare la percentuale di globuli rossi fluorescenti per organoide.
2. Cellule BeWo
   1. A 24 ore prima della trasduzione, piastre le cellule BeWo del coriocarcinoma placentare umano a 10.000 cellule per pozzetto di piastra a 96 pozzetti. Preparazioni di AAV grezze diluite che confezionano CMV.mScarlet a 1:1 in terreno BeWo F12-K privo di siero fino a un volume totale di 50 μL per pozzetto. Aspirare il terreno dal pozzetto e sostituirlo con 50 μL di AAV diluito per pozzetto.
   2. Incubare le cellule a 37 °C per una notte (~18 h) e quindi aggiungere 100 μL di terreno BeWo F12-K contenente il 10% di FBS per portare il volume totale a 150 μL. Incubare le cellule per altre 6 ore per un totale di 24 ore post-trasduzione (hpt).
   3. Per l'imaging, colorare le cellule vive con il colorante Hoechst per 30 minuti in terreno F12-K, quindi sostituire il terreno con DMEM privo di fenolo contenente il 10% di FBS, 1x integratore di glutamax e 1x integratore di piruvato di sodio per l'imaging. Eseguire l'imaging di cellule vive su un microscopio confocale utilizzando set di filtri DAPI (per l'imaging Hoechst) e mCherry (per l'imaging mScarlet) con 37 °C e 5% di CO₂ .
3. Cellule Hepa1-6 e Huh7
   1. Cellule epatiche Hepa1-6 murine su piastra e cellule epatiche umane Huh7 in DMEM (4,5 g/L di glucosio, 110 mg/L di piruvato di sodio, 10% FBS) a 5.000 cellule per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti 24 ore prima della trasduzione.
   2. Aggiungere 50 μL di preparati grezzi non diluiti di AAV che confezionano CMV.mScarlet direttamente sulle cellule e incubare a 37 °C per 48 ore. Lavare le cellule una volta in PBS, fissare in PFA al 4% e colorare con colorante Hoechst per 10 min. Eseguire l'imaging su un microscopio confocale utilizzando i set di filtri DAPI (per l'imaging Hoechst) e mCherry (per l'imaging mScarlet).
4. Celle C2C12 e HSkMC
   1. Piastra di mioblasti murini indifferenziati C2C12 e mioblasti di cellule muscolari scheletriche primarie umane indifferenziate (HSkMC) a 5.000 cellule per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti, 72 ore prima della trasduzione.
   2. Preparazioni di AAV grezze diluite che confezionano CMV.mScarlet a 1:1 in DMEM (4,5 g/L di glucosio, Penn/Strep, 20% FBS) per mioblasti C2C12 o terreni di crescita del muscolo scheletrico per mioblasti HSkMC. Differenziare i mioblasti HSkMC in miotubi cambiando il mezzo in mezzo di differenziazione.
   3. Incubare mioblasti e miotubi in preparati AAV diluiti per 24 ore a 37 °C. Colorare le cellule vive con il colorante Hoechst per 10 minuti e visualizzarle su un microscopio confocale utilizzando i set di filtri DAPI (per l'imaging Hoechst) e mCherry (per l'imaging mScarlet).

Risultati

Individuazione del capside ottimale per la trasduzione delle cellule in coltura di interesse
Una varietà di tipi di cellule è stata trasdotta per determinare il tropismo di vari sierotipi di capsidi (Figura 5). I sierotipi naturali AAV2¹⁴, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 e le varianti del capside ingegnerizzate Anc80 25, DJ 26, LK03²⁷ e^{KP1 28} sono stati impacchettati con un genoma vettore che esprime mScarlet sotto un promotore di CMV, clonato utilizzando i metodi forniti in questo protocollo. Le preparazioni di vettori grezzi non titolati sono state diluite nei terreni di coltura appropriati e le cellule sono state trasdotte per 24+ ore e sottoposte a imaging (Figura 5B). L'efficienza di trasduzione è stata calcolata in base alla proporzione di cellule totali che erano mScarlet+, o la proporzione di cellule in un singolo piano z che erano mScarlet+ (per gli organoidi dell'intestino tenue di topo; Figura 5C). Le efficienze di trasduzione (cellule mScarlet+) non sono fornite per i miotubi differenziati C2C12 e HSkMC, ma piuttosto per i mioblasti C2C12 e HSkMC indifferenziati (Figura 5A).

AAV2 e KP1 sono risultati i sierotipi più potenti tra le linee cellulari testate (Figura 5A). È stato anche osservato che tipi di cellule simili provenienti da specie diverse vengono trasdotti con efficienze variabili. Ad esempio, Hepa1-6 (una linea cellulare epatica derivata da murina) mostra una marcata diminuzione della trasduzione rispetto a Huh7 (una linea cellulare epatica derivata dall'uomo) quando si utilizza AAV2 (Figura 5B). Inoltre, le diverse condizioni dei mezzi giocano un ruolo importante durante la trasduzione. Gli organoidi dell'intestino tenue di topo (mSIO) coltivati in terreni di pre-trasduzione sono trasdotti in modo meno efficace rispetto a quelli coltivati in terreni di crescita organoidi (Figura 5C). Inoltre, AAV2 trasduce in modo efficiente i mioblasti HSkMC indifferenziati e i miotubi HSkMC differenziati (Figura 5B), sebbene l'analisi quantitativa dei miotubi sia difficile e quindi non venga fornita.

Le elevate efficienze di trasduzione osservate per vari tipi di cellule nella Figura 5 mostrano che le preparazioni di vettori grezzi possono essere utilizzate in modo efficace per trasdurre una varietà di tipi di cellule senza ulteriori passaggi come la purificazione e la titolazione. Tuttavia, è necessario prestare un'attenta considerazione quando si sceglie un capside per massimizzare il rilascio del transgene. Molte altre linee cellulari e capsidi sono state precedentemente testate e sono state pubblicate, anche se con preparati vettoriali purificati¹².

Un effetto indipendente dalle particelle vettoriali delle condizioni del mezzo può influenzare l'efficienza della trasduzione. Tuttavia, è generalmente accettato che il tropismo (cioè l'assorbimento specifico del tipo di cellula e l'espressione del vettore) sia una proprietà specifica del capside²⁹. Non è stato ancora osservato che un confronto tra preparati grezzi e purificati a dose abbinata influisca sul tropismo cellulare. Pertanto, i preparati di vettori grezzi possono essere utilizzati in modo simile ai vettori purificati in coltura cellulare.

Figura 5: Trasduzione vettoriale grezza di vari tipi cellulari . (A) Percentuale di mScarlet+ in seguito all'aggiunta di vari vettori AAV contenenti un transgene mScarlet . (B) Cellule esprimenti mScarlet rilasciate dal sierotipo AAV 2. Barre della scala: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 e HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Abbreviazioni: hpt = ore dopo la trasduzione. (C) Gli organoidi dell'intestino tenue di topo (mSIO) sono stati trattati con rAAV in terreni di pre-trasduzione o in terreni di crescita organoidi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella supplementare 1: Foglio di lavoro sulla trasfezione di tripli plasmidi. Fare clic qui per scaricare il file.

Tabella supplementare 2: Foglio di lavoro per l'ottimizzazione PEI. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussione

Clonazione
Il protocollo di clonazione non è limitato al plasmide pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 utilizzato in precedenza e può essere facilmente modificato in base alle esigenze sperimentali del ricercatore. Molti plasmidi contenenti ITR sono prontamente disponibili online per l'acquisto. Ad esempio, sono disponibili plasmidi contenenti sia Cas9 che un sito di clonaggio di sgRNA, ma richiedono alcuni passaggi aggiuntivi come la ricottura degli oligonucleotidi e il trattamento con PNK³⁰. Inoltre, si possono trovare plasmidi contenenti un sito di clonazione multipla (MCS) con solo ITR e senza elementi regolatori interni³¹. Se devono essere utilizzati plasmidi diversi, gli enzimi di restrizione (RE) utilizzati per la digestione sono in genere gli unici elementi che potrebbero dover essere modificati in questo protocollo. Tuttavia, un limite dell'rAAV è la sua limitata capacità di carico. A causa delle limitazioni fisiche del capside, il genoma del vettore non dovrebbe superare i 4,9 kb, compresi gli ITR.

Quando si isola il plasmide dai batteri, è fondamentale utilizzare un kit midiprep o maxiprep a basso contenuto o privo di endotossine per mitigare i danni alle cellule durante la trasfezione o la trasduzione del triplo plasmide. I plasmidi dei kit miniprep contengono spesso impurità più elevate, concentrazioni ridotte e meno DNA superavvolto, che possono influenzare la produzione a valle di rAAV e quindi non sono raccomandati.

È fondamentale comprendere la struttura e le proprietà degli ITR durante la clonazione. In primo luogo, è estremamente difficile utilizzare la PCR attraverso l'ITR. I progetti di clonazione che richiedono l'amplificazione PCR tramite ITR dovrebbero essere evitati e dovrebbero inoltre limitare l'uso della tecnica di clonazione dell'assemblaggio Gibson. Pertanto, il clonaggio enzimatico di restrizione è il metodo preferito per la clonazione in plasmidi contenenti ITR. Inoltre, alcuni primer per il sequenziamento Sanger potrebbero non essere compatibili se la regione sequenziata contiene l'ITR. Invece, si consiglia di utilizzare primer che si allontanano dagli ITR e si inseriscono nel corpo del genoma del vettore per ottenere risultati di sequenziamento più precisi. In secondo luogo, gli ITR sono soggetti a delezioni, riarrangiamenti e mutazioni quando vengono trasformati in batteri per l'amplificazione plasmidica^32,33. Per mitigare questi eventi, si consiglia di utilizzare ceppi batterici competenti carenti di ricombinazione, come Stbl3, e di incubarli a 30 °C per rallentare le divisioni cellulari. Infine, è stato osservato che le colonie più piccole possono corrispondere a cloni senza riarrangiamenti o delezioni, poiché quelle senza ITR possono conferire un vantaggio di crescita ed essere più grandi. Pertanto, si consiglia di scegliere colonie di piccole dimensioni.

Produzione vettoriale
Il successo della produzione del vettore rAAV può essere influenzato da più elementi. Un fattore critico è la salute delle cellule HEK293 o 293T utilizzate per la trasfezione. Generalmente, un basso numero di passaggi è l'ideale, poiché le cellule altamente passate possono presentare variazioni genotipiche e fenotipiche che possono ridurre i titoli di rAAV. Inoltre, la densità delle cellule seminate dovrebbe essere del 75%-90% di confluenza per una produzione efficace. Le cellule sparse generano basse rese vettoriali perché ci sono meno cellule disponibili per produrre vettori, mentre le cellule troppo cresciute non saranno trasfettate in modo efficiente.

Le variazioni tra i lotti di reagenti, le scorte di cellule e la variabilità generale da laboratorio a laboratorio contribuiscono alle differenze nell'efficienza di trasfezione e nel titolo di produzione. Un fattore ottimizzabile che può portare a miglioramenti del titolo è il rapporto plasmide:PEI nelle reazioni di trasfezione. È fondamentale utilizzare PEI MAX fresco (<1 mese). Si raccomanda di utilizzare un rapporto plasmide:PEI di 1:1 come punto di partenza e, se l'efficienza di trasfezione o trasduzione appare scarsa, testare diversi rapporti. L'ottimizzazione del titolo è più semplice se si utilizza un transgene con una lettura visiva, come il transgene reporter CMV.Luc.IRES.EGFP utilizzato in questo documento come materiale di partenza per la clonazione. Per eseguire l'ottimizzazione, seguire la fase 3 del protocollo utilizzando una piastra a 12 pozzetti e riducendo di due le masse del plasmide e i volumi dei reagenti (la massa finale del plasmide è di 2,6 μg). Regolare di conseguenza il volume PEI in modo che corrisponda a rapporti compresi tra 1:0,75 e 1:3, con incrementi crescenti di 0,25 (Figura 6). Diluire ogni reazione con 950 μL di terreno SF dopo 15 minuti. Per comodità, è possibile creare una miscela master contenente i plasmidi tripli e pipettare singolarmente in provette da 1,5 mL prima di aggiungere PEI (vedere il file supplementare 2). Raccogli il vettore, trasduci le cellule di interesse e l'immagine. Il pozzetto con la più alta efficienza di trasduzione (proporzione di cellule GFP+) corrisponde al titolo più alto e al rapporto ottimale di PEI:DNA.

Figura 6: Flusso di lavoro di ottimizzazione PEI. Schema dei passaggi necessari per l'ottimizzazione PEI. Rapporti multipli di plasmidi: PEI vengono testati per determinare il rapporto ottimale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Considerazioni sul raccolto e sul titolo
La tecnica di congelamento/scongelamento utilizzata per raccogliere il vettore rAAV lisa efficacemente le cellule HEK293 in modo compatibile con l'uso diretto del lisato chiarificato per trasdurre le cellule in coltura. Alcuni sierotipi di rAAV, come AAV1, AAV8 e AAV9, vengono rilasciati dalle cellule durante la produzione del vettore e possono essere raccolti dal terreno cellulare coltivato senza cicli di congelamento/scongelamento³⁴. Il metodo qui descritto produce in genere titoli dell'ordine di 1 x 10¹⁰ VG/mL quando si utilizzano capsidi AAV2 e 1 x^{10 11} VG/mL per AAV8. Sebbene titoli più elevati possano essere ottenuti mediante lisi detergente o altre sostanze chimiche, queste sono dannose per le cellule nell'uso a valle e richiedono che i rAAV siano ulteriormente purificati dal lisato. Il titolo più basso è un compromesso che un ricercatore dovrebbe considerare quando determina se i preparati grezzi sono appropriati per le proprie esigenze di ricerca, tuttavia, i titoli marginalmente più bassi prodotti dai metodi qui descritti possono trasdurre molto bene molti tipi di cellule (vedi risultati rappresentativi). Oltre all'efficienza di trasfezione e alla salute cellulare, i titoli dei vettori variano a seconda del capside utilizzato durante la produzione di rAAV e delle dimensioni e della sequenza del transgene all'interno del VG³⁵.

Durante la raccolta di preparati vettoriali grezzi, può essere presente DNA plasmidico utilizzato durante la trasfezione a triplo plasmide e, sebbene raramente, provocare la trasfezione a valle durante la trasduzione. Inoltre, i VG non confezionati possono legarsi all'esterno dei capsidi e invocare una risposta immunitaria innata al DNA a singolo filamento nudo ed estraneo^36,37. Pertanto, i tipi di cellule sensibili possono richiedere che le preparazioni vettoriali siano digerite e purificate con DNasi per rimuovere i VG e i plasmidi non confezionati.

Se si desidera calcolare il titolo di un preparato grezzo, è possibile eseguire la qPCR per quantificare il numero di VG confezionati all'interno di particelle resistenti alla DNasi (DRP). In breve, una piccola quantità di preparato grezzo viene digerita con DNasi per rimuovere il DNA plasmidico, contaminando gli acidi nucleici o il VG parzialmente confezionato. Il campione viene quindi sottoposto a qPCR e viene quantificato il VG protetto all'interno dei DRP, ottenendo un titolo con unità di genoma vettoriale per mL di preparato grezzo³⁸. Non è consigliabile eseguire la titolazione vettoriale utilizzando saggi basati su ELISA che quantificano i titoli del capside. Rispetto al virus AAV wild-type, il rAAV soffre di una percentuale di capsidi vuoti e parzialmente impacchettati³⁹. L'ELISA quantificherà tutti i capsidi indipendentemente dal loro contenuto genomico e sovrastimerà le unità trasducibili presenti in una preparazione, che richiede un VG impacchettato.

Considerazioni sulla trasduzione
Molti fattori influenzano le trasduzioni di rAAV e le opportune considerazioni dovrebbero essere fatte per ogni nuovo esperimento. A seconda del promotore che guida l'espressione del transgene, l'insorgenza dell'espressione può avvenire già 4 ore dopo la trasduzione (hpt) e il picco di espressione è tipicamente raggiunto entro 48 hpt. È importante tenere presente il periodo di tempo che intercorre tra la semina iniziale delle cellule e l'endpoint sperimentale. Questo per stimare la confluenza iniziale delle cellule e garantire che non crescano eccessivamente entro la fine dell'esperimento. Se le cellule diventano troppo confluenti, il comportamento cellulare può essere alterato a causa di una risposta allo stress e può confondere i risultati sperimentali. Alcuni tipi di cellule, come U2-OS, possono tollerare abbastanza bene la crescita eccessiva/inibizione da contatto. Inoltre, possono resistere a lunghi periodi (48 h+) in terreno condizionato privo di siero, il prodotto di questo protocollo di produzione. Tuttavia, i tipi di cellule sensibili possono richiedere l'aggiunta di siero o la diluizione del preparato grezzo con uno speciale terreno di crescita per mantenere la salute durante la trasduzione. Un'efficienza di trasduzione leggermente ridotta dall'uso di terreni contenenti siero è un potenziale compromesso per la salute delle cellule e dovrebbe essere presa in considerazione dal ricercatore.

Tipicamente, per celle che si dividono rapidamente, una confluenza iniziale di circa il 50% è ottimale per le applicazioni che saranno terminate a 48 hpt. Tuttavia, la confluenza può essere regolata di conseguenza in base alle esigenze dell'esperimento. Non è consigliabile trasdurre linee cellulari immortalizzate di tipo monostrato con una confluenza superiore al 75% a causa della diminuzione dell'efficienza di trasduzione. La maggior parte dei tipi di cellule in coltura viene trasdotta con successo e sana dopo l'incubazione notturna con preparati rAAV grezzi, seguita da un passaggio a terreni freschi contenenti siero al mattino.

Il sierotipo del capside è un fattore importante da considerare quando si produce rAAV per trasdurre una cellula bersaglio, poiché il capside è il determinante primario del tropismo cellulare e della successiva espressione del transgene¹³. AAV2 è un sierotipo ampiamente utilizzato grazie alla sua capacità di trasdurre efficacemente molti tipi di cellule in coltura¹². Questa proprietà di AAV2 può essere attribuita ai proteoglicani dell'eparina solfato (HSPGs) che fungono da fattore di attacco primario per AAV2 e agli alti livelli di HSPGs sulle cellule in coltura dall'adattamento alla crescita in un piatto⁴⁰. Altri capsidi, come AAV9, sono meno efficaci nel trasdurre i tipi di cellule larghe e possono essere spiegati dai loro fattori di attaccamento di dipendenza che non sono espressi in questo setting⁴¹. Pertanto, raccomandiamo AAV2 come capside di prima scelta nelle cellule in coltura se una cellula bersaglio desiderata non è stata precedentemente testata con rAAV in letteratura.

Si noti che una delle principali limitazioni dei preparati vettoriali grezzi è che sono inappropriati per la trasduzione di modelli animali. Gli studi in vivo richiedono che i preparati siano purificati e sottoposti a valutazione della qualità.

Considerazioni sull'espressione del transgene e sulla potenziale integrazione
Gli rAAV non determinano in modo affidabile l'espressione permanente del transgene. Nel corso del tempo, i VG possono essere silenziati e l'espressione transgenica può essere interrotta dopo diversi passaggi⁴². Inoltre, la maggior parte dei VG rimane episomiale e i rAAV non contengono le proteine Rep virali che medierebbero la frequente integrazione nel genoma dell'ospite come in un'infezione lisogenica virale wild-type o promuoverebbero la replicazione dei VG⁴³. Di conseguenza, gli episomi nelle cellule trasdotte alla fine saranno diluiti tra le cellule figlie attraverso le divisioni.

L'integrazione a livello basale è una possibilità per tutto il materiale di DNA transgenico consegnato. Tuttavia, i VG contenenti ITR sono inclini all'integrazione a una frequenza più elevata⁴⁴. Pertanto, l'espressione permanente di un transgene può essere osservata in un piccolo sottogruppo di cellule. Gli utenti dovrebbero considerare questa possibilità soprattutto quando utilizzano rAAV per fornire enzimi che tagliano il DNA, come Cas9, poiché le rotture a doppio filamento possono comportare una frequenza ancora maggiore di integrazione ed espressione permanente⁴⁵. Sebbene ciò renda rAAV un buon candidato per la fornitura di modelli di riparazione diretti all'omologia per il tagging endogeno o l'aggiunta genica, la possibilità di inserimento di Cas9 dovrebbe essere considerata^19,46.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Snapgene DNA visualizzazione sofrware	Snapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40	AddGene	105533
pAAV2/2 (Rep/Cap)	AddGene	104963
pAdΔ F6	AddGene	112867
LB Agar Carbenicillin	Sigma-Aldrich	L0418
Boekel Scientific Economy Incubatore digitale	Boekel Scientific	133000
LB medium, polvere	MP Biomedicals	113002042
Carbencillina (Disodium)	GoldBio	C-103-5
New Brunswick I26 Shaker	Eppendorf	M1324-0000
Provette da centrifuga da 50 ml	Corning	430828
Centrifuga 5810 R	Eppendorf	22627040
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit	Qiagen	12945
PCR PULL-APART 8 STRISCE PER PROVETTE	USA Scientific	1402-3900
Mastercycler nexus	Eppendorf	6333000022
dNTP	Thermo Fisher Scientific 18427013
5x Phusion Buffer	NEB	B0518S	Fornito con l'acquisto di Phusion Polymerase
Phusion  Colorante ad alta fedeltà DNA polimerasi	NEB	M0530S
, arancione (6X)	NEB	B7022S
DNA pulito e Concentratore-100	Zymo	D4029
Kit di recupero del DNA su gel Zymoclean	Zymo	D4001
NotI-HF	NEB	R3189S
EcoRI-HF	NEB	R3101S
CutSmart Buffer (10x)	NEB	B6004S	Fornito con l'acquisto dell'enzima di restrizione
UltraPure Agarosio	Thermo Fisher Scientific	16500100
Bromuro di etidio	Sigma-Aldrich	E1510
T4 DNA ligasi	NEB	M0202S
T4 DNA ligasi tampone di reazione	NEB	B0202S	Fornito con l'acquisto di provette Eppendorf Safe-Lock per ligasi T4
(1,5 ml)	Eppendorf	22363204
Precision Microprocessor Water Bath	Thermo Scientific	51221046
Provette sterili per colture in plastica	Fisher Scientific	149566B
Provetta per microcentrifuga da 2,0 mL	Thomas Scientific	1149Y01
ZR Plasmid Miniprep - Classic	Zymo	D4015
Xma1	NEB	R0180S
Sma1	NEB	R0141S
HEK 293T cellule	ATCC	CRL-3216
Falcon a 6 pozzetti	Corning	353046
Gibco  DMEM, glucosio alto, piruvato	Thermo-Fisher	11995065
Sanyo MCO-18AIC(UV) Incubatore a CO2	Marshall Scientific	MCO-18AIC
PEI MAX (Polietilenimmina cloridrato)	Polysciences	24765-100
Mixer Vortex Genie 2	Scienze di microscopia elettronica	102091-234
Sanyo Ultra Low Freezer	Sanyo	14656-15267-16219
INCU-Line IL 10 con finestra trasparente	VWR	390-0384
Eppendorf Microcentrifughe	Eppendorf	05-400-005
Falcon 96-well	Corning	353072
C57BL/6J topi	JAX	ceppo #000664
terreno di crescita per organoidi	STEMCELL Technologies	6005
Cellule L Wnt-3A	ATCC	CRL-2647
nicotinamide	Sigma	N0636-100G
Inibitore ROCK	STEMCELL Technologies	72302
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72052
Corning Matrigel Fattore di crescita ridotto (GFR) Membrana basale	Fisher	356231
Piastra a 24 pozzetti	Fisher	08-772-1
D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-250
TrypLE Express	Fisher	12604013
DMEM/F-12 con 15 mM HEPES	STEMCELL Technologies	36254
polibrene	Millipore Sigma	TR-1003-G
Piastre a 48 pozzetti	Fisher	08-772-3D
Thermo Scientific  Nunc Lab-Tek Vetro di copertura camerato	Fisher	12-565-470
Celle BeWo	ATCC	CCL-98
F-12K Medio	ATCC	30-2004
Hepa1-6	ATCC	CRL-1830
Huh7	UC Berkeley BSD Cell Culture Facility	HUH-7
C2C12	ATCC	CRL-1772
HSkMC	ATCC	PCS-950-010
Terreno di crescita delle cellule muscolari scheletriche	Sigma	C-23060
Mezzo di differenziazione del muscolo scheletrico	Sigma	C-23061
Invitrogen  EVOS Microscopio digitale a fluorescenza a colori	Fisher Scientific	12-563-340
Perkin Elmer Opera Phenix	Perkin Elmer	HH14001000
PhenoPlate 96 pozzetti	Perkin Elmer	6055302
DMEM, alto glucosio, senza glutammina, senza rosso fenolo	Thermo-Fisher	31053028
GlutaMAX Integratore	Thermo-Fisher	35050079
Sodium Piruvato	Thermo-Fisher	11360070
pAAV2/5 (Rep/Cap)	Addgene	104964
pAAV2/8 (Rep/Cap)	Addgene	112864
pAAV-DJ-N589X (Rep/Cap)	Addgene	130878
pAAV2/9n (Rep/Cap)	Addgene	112865
pAnc80L65AAP	Addgene	92307
KP1 (rep/cap)			donato dal Professor Mark Kay (Stanford University)
LK03 (rep/cap)			donato dal Professor Mark Kay (Stanford University)
pAAV4 (rep/cap)			donato dal Professor Luk Vandenberghe (Harvard Medical School)
pAAV.Cas9.sgRNA	Addgene	61591
pAAV.MCS	Addgene	46954
gBlock (frammento di DNA sintetico)	IDT