Articolo metodologico

Formazione ossea integrata attraverso l'ossificazione endocondrale in vivo utilizzando cellule staminali mesenchimali

DOI:

10.3791/65573

⸱

14 luglio 2023

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Craniofacial Embryology, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 2Department of Maxillofacial Surgery, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University, 3Department of Regenerative and Reconstructive Dental Medicine, Graduate School of Medical and Dental Sciences, Tokyo Medical and Dental University

In questo articolo

Sommario

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La terapia ossea tramite ossificazione endocondrale mediante l'impianto di tessuto cartilagineo artificiale prodotto da cellule staminali mesenchimali ha il potenziale per aggirare gli inconvenienti delle terapie convenzionali. Gli idrogel di acido ialuronico sono efficaci nel ridimensionare gli innesti di cartilagine uniformemente differenziati e nel creare osso integrato con vascolarizzazione tra innesti fusi in vivo.

Abstract

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La terapia convenzionale di rigenerazione ossea che utilizza cellule staminali mesenchimali (MSC) è difficile da applicare a difetti ossei di dimensioni superiori a quelle critiche perché non ha un meccanismo per indurre l'angiogenesi. L'impianto di tessuto cartilagineo artificiale fabbricato da MSC induce l'angiogenesi e la formazione ossea in vivo tramite ossificazione endocondrale (ECO). Pertanto, questo approccio ECO-mediato potrebbe essere una promettente terapia di rigenerazione ossea in futuro. Un aspetto importante dell'applicazione clinica di questo approccio ECO-mediato è la definizione di un protocollo per la preparazione di una quantità sufficiente di cartilagine da impiantare per riparare il difetto osseo. In particolare, non è pratico progettare una singola massa di cartilagine innestata di dimensioni conformi alla forma del difetto osseo effettivo. Pertanto, la cartilagine da trapiantare deve avere la proprietà di formare integralmente l'osso quando vengono impiantati più pezzi. Gli idrogel possono essere uno strumento interessante per aumentare gli innesti di ingegneria tissutale per l'ossificazione endocondrale per soddisfare i requisiti clinici. Sebbene molti idrogel di derivazione naturale supportino la formazione di cartilagine MSC in vitro e ECO in vivo, il materiale ottimale per lo scaffold per soddisfare le esigenze delle applicazioni cliniche deve ancora essere determinato. L'acido ialuronico (HA) è un componente cruciale della matrice extracellulare della cartilagine ed è un polisaccaride biodegradabile e biocompatibile. Qui, mostriamo che gli idrogel di HA hanno eccellenti proprietà per supportare la differenziazione in vitro del tessuto cartilagineo a base di MSC e promuovere la formazione di osso endocondrale in vivo.

Introduzione

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L'osso autologo è ancora il gold standard per la riparazione di difetti ossei dovuti a traumi, difetti congeniti e resezione chirurgica. Tuttavia, l'innesto osseo autogeno presenta limitazioni significative, tra cui il dolore del donatore, il rischio di infezione e il volume osseo limitato che può essere isolato dai pazienti 1,2,3,4. Numerosi biomateriali sono stati sviluppati come sostituti ossei, combinando polimeri naturali o sintetici con materiali mineralizzati come il fosfato di calcio o l'idrossiapatite 5,6. La formazione ossea in questi materiali ingegnerizzati viene solitamente ottenuta utilizzando il materiale mineralizzato come materiale di priming per consentire alle cellule staminali di differenziarsi direttamente in osteoblasti attraverso il processo di ossificazione intramembrana (IMO)7. Questo processo manca della fase angiogenica, con conseguente insufficiente vascolarizzazione in vivo dell'innesto dopo l'impianto 8,9,10 e, pertanto, gli approcci che utilizzano tale processo potrebbero non essere ottimali per il trattamento di grandi difetti ossei 11.

Le strategie applicate per ricapitolare il processo di ossificazione endocondrale (ECO), un meccanismo innato nella scheletrogenesi durante lo sviluppo, hanno dimostrato di superare problemi significativi associati agli approcci tradizionali basati sull'IMO. Nell'ECO, i condrociti nel modello di cartilagine rilasciano il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF), che promuove l'infiltrazione vascolare e il rimodellamento del modello di cartilagine nell'osso12. L'approccio ECO-mediato all'osteogenesi attraverso il rimodellamento della cartilagine e l'angiogenesi, che viene attivato anche durante la riparazione delle fratture, utilizza tessuto cartilagineo creato artificialmente derivato da MSC come materiale di priming. I condrociti possono tollerare l'ipossia nei difetti ossei, indurre l'angiogenesi e convertire un innesto di cartilagine senza vascolare in tessuto angiogenico. Numerosi studi hanno riportato che gli innesti di cartilagine a base di MSC generano osso in vivo implementando un tale programma ECO 13,14,15,16,17,18,19,20,21.

Un requisito essenziale per l'applicazione clinica di questo approccio ECO-mediato è come preparare la quantità desiderata di innesto di cartilagine in un contesto clinico. La preparazione di cartilagine clinica di dimensioni che si adattino al difetto osseo effettivo non è pratica. Pertanto, la cartilagine dell'innesto deve formare integralmente l'osso quando vengono impiantati più frammenti22. Gli idrogel possono essere uno strumento interessante per aumentare gli innesti di ingegneria tissutale per l'ossificazione endocondrale. Molti idrogel di derivazione naturale supportano la formazione di cartilagine MSC in vitro e ECO in vivo 23,24,25,26,27,28,29,30,31,32; Tuttavia, il materiale di supporto ottimale per soddisfare i requisiti dell'applicazione clinica è rimasto indeterminato. L'acido ialuronico (HA) è un polisaccaride biodegradabile e biocompatibile presente nella matrice extracellulare della cartilagine33. L'acido ialuronico interagisce con le MSC tramite recettori di superficie come CD44 per supportare la differenziazione condrogenica 25,26,28,30,31,32,34. Inoltre, gli scaffold HA promuovono la differenziazione osteogenica mediata da IMO delle cellule staminali della polpa dentale umana35 e gli scaffold combinati con il collagene promuovono l'osteogenesi ECO-mediata36,37.

Qui, presentiamo un metodo per la preparazione di idrogel di HA utilizzando MSC umane adulte derivate dal midollo osseo e il loro utilizzo per la condrogenesi ipertrofica in vitro e la successiva ossificazione endocondrale in vivo38. Abbiamo confrontato le caratteristiche dell'HA con quelle del collagene, un materiale ampiamente applicato nell'ingegneria del tessuto osseo con MSC e un materiale utile per scalare gli innesti artificiali per l'ossificazione endocondrale17. In un modello murino immunocompromesso, i costrutti di HA e collagene seminati con MSC umane sono stati valutati per il potenziale ECO in vivo mediante impianto sottocutaneo. I risultati mostrano che gli idrogel di HA sono eccellenti come impalcatura per le MSC per creare innesti di cartilagine artificiale che consentono la formazione ossea attraverso l'ECO.

Il protocollo è diviso in due fasi. In primo luogo, i costrutti di MSC umane seminati su idrogel di acido ialuronico vengono preparati e differenziati in cartilagine ipertrofica in vitro. Successivamente, i costrutti differenziati vengono impiantati per via sottocutanea in un modello nudo per indurre l'ossificazione endocondrale in vivo (Figura 1).

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Protocollo

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Questo protocollo utilizza topi nudi maschi di 4 settimane. Ospitare quattro topi in una gabbia con un ciclo luce/buio di 12 ore a 22−24 °C e 50%-70% di umidità relativa. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Tokyo Medical and Dental University (ID approvazione: A2019-204C, A2020-116A e A2021-121A).

1. Preparazione di tamponi e reagenti

  1. Preparare il terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali (terreno di crescita MSC) aggiungendo il kit supplementare di terreno di crescita MSC al terreno basale MSC e conservarlo a 4 °C.
  2. Preparare il terreno di coltura Dulbecco Modified Eagle e il terreno F12 (DMEM/F-12) di prosciutto aggiungendo il 10% di siero fetale bovino (FBS), 50 μg/mL di gentamicina, 200 μM di L-alanil-L-glutammina e 1 ng/mL di fattore di crescita fibroblastico basico al terreno e conservarlo a 4 °C.
  3. Preparare il terreno condrogenico aggiungendo l'1% di integratore ITS-G, lo 0,12% di albumina sierica bovina, 50 μg/mL di gentamicina, 0,35 mM di L-prolina, 100 nM di desametasone e 10 ng/mL di TGF-β3 al DMEM appena prima dell'uso.
  4. Preparare il terreno ipertrofico aggiungendo 10 mM di β-glicerofosfato, albumina sierica bovina allo 0,12%, desametasone 10 nM, 200 μM di ascorbato-2-fosfato, 50 nM di L-tiroxina, 50 μg/mL di gentamicina e 50 pg/mL di IL-1β al DMEM appena prima dell'uso.
  5. Rivestire una piastra di coltura a 24 pozzetti con 200 μL di paraffina fusa preriscaldata a 60 °C. Lasciare riposare a temperatura ambiente fino a quando la paraffina non si sarà solidificata.

2. Espansione delle MSC umane

NOTA: Prima di iniziare gli esperimenti, le MSC con un alto potenziale di condrogenesi delle MSC devono essere selezionate in micro coltura di massa come descritto alpunto 17.

  1. Secondo le istruzioni del produttore, coltivare MSC primarie derivate dal midollo osseo umano (passaggio 2) con terreno di coltura MSC in un piatto di 10 cm a una densità di 5 x 103 cellule/cm 2 a 37 °C in incubatrice ad aria umidificata al 5% di CO2 e al 95%.
  2. Cambiare il terreno ogni 2-3 giorni. Una volta che le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza, aspirare il terreno dal piatto di coltura cellulare utilizzando una pompa a vuoto, lavare con 5 mL di PBS, quindi aspirare la soluzione con una pompa a vuoto.
  3. Aggiungere 1 ml di soluzione di tripsina allo 0,05% e EDTA allo 0,02% nel piatto. Incubare la capsula per 5-10 minuti a 37 °C.
  4. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura MSC per fermare la reazione enzimatica. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 50 ml.
  5. Unire la sospensione cellulare di altre piastre nella provetta da 50 ml e tenerla in ghiaccio.
  6. Utilizzare il contatore di cellule per contare le cellule mescolando 10 μL di sospensione cellulare con 10 μL di colorante blu tripano allo 0,4%.
  7. Centrifugare la sospensione cellulare rimanente a 220 x g per 3 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e aggiungere la soluzione di crioconservazione a una concentrazione di 1,0 x 106 cellule per mL.
  8. Erogare 1 mL della sospensione cellulare in ciascun criotubo e conservare a -80 °C per 12 ore prima di trasferire in azoto liquido. Per questo protocollo vengono utilizzate le scorte congelate risultanti (passaggio 3).
  9. Per gli esperimenti, seminare le MSC immagazzinate in un piatto di 10 cm ad una densità di 5 x 103 cellule/cm2. Colture cellulari fino all'80%-90% confluente (passaggio 4) in terreno DMEM/F-12.

3. Preparazione di idrogel incapsulati in MSC

  1. Tripsinizzare le cellule e preparare la sospensione cellulare come descritto nei passaggi 2.3 - 2.6.
  2. Per ottenere 10 costrutti (2,5 x 10 5 cellule per costrutto), aliquotare la sospensione cellulare contenente 2,5 x 106 cellule in un microtubo da1,5 mL.
  3. Centrifugare la sospensione a 220 x g per 3 minuti, rimuovere il surnatante con una pompa a vuoto e tenerlo in ghiaccio.
  4. Portare a temperatura ambiente l'acido ialuronico (HA) tiolo-modificato, il reticolante tiolo-reattivo, il polietilenglicole diacrilato e le bottiglie d'acqua degassata.
  5. In condizioni sterili, aggiungere 1,0 mL di acqua degassata al flacone contenente acido ialuronico (vedere le istruzioni del produttore) utilizzando una siringa con un ago.
  6. Vortice di tanto in tanto riscaldato a 37 °C fino a quando la soluzione diventa limpida, quindi mettere su ghiaccio. Ci vogliono meno di 30 minuti perché i solidi si dissolvano completamente.
  7. In condizioni sterili, aggiungere 0,5 ml di acqua degassata al flacone reticolante utilizzando una siringa con un ago. Sciogliere capovolgendo più volte, quindi mettere sul ghiaccio.
  8. Aggiungere 120 μL della soluzione di HA disciolta al pellet cellulare aliquotato (2,5 x 106 cellule). Risospendere il pellet cellulare pipettando avanti e indietro.
  9. Aggiungere 30 μL della soluzione reticolante disciolta alla provetta contenente l'acido ialuronico e le cellule (passaggio 3.8) e combinare picchiettando la provetta, quindi ruotare brevemente. Combinare la soluzione HA e la soluzione reticolante in un rapporto 4:1.
  10. Far cadere 15 μL della soluzione combinata contenente MSC (2,5 x 105 cellule) sulla piastra a 24 pozzetti rivestita in paraffina e lasciarla solidificare a 37 °C per 30 minuti (Figura 2). A causa dell'elevata viscosità, preparare almeno il 10% in più della miscela cella/idrogel rispetto al necessario.
    NOTA: Le caratteristiche dell'idrogel sono state descritte in precedenza39.

4. Condizioni di differenziazione in vitro

  1. Aggiungere 0,5 mL di terreno di differenziazione condrogenico a un costrutto di idrogel di HA seminati con MSC. Cambiare il terreno ogni 2-3 giorni.
  2. Dopo 3 settimane, passare al terreno di differenziazione ipertrofica (0,5 mL per pozzetto) e coltivare i costrutti per altre 2 settimane.

5. Impianto in vivo di MSC

  1. Dopo un totale di 5 settimane di coltura in vitro, impiantare i costrutti per via sottocutanea nella parte posteriore di topi nudi come descritto in precedenza38,40.
  2. Pesare i topi e somministrare un anestetico combinato preparato con 0,75 mg/kg di peso corporeo (p.c.) medetomidina, 4,0 mg/kg p.c. midazolam e 5,0 mg/kg p.c. butorfanolo mediante iniezione intraperitoneale come descritto38.
  3. Confermare un'adeguata anestesia mediante immobilità agli stimoli chirurgici e monitorare la profondità respiratoria mediante movimenti toracici lenti e regolari e un corretto apporto di ossigeno in base al colore della mucosa rosa periodicamente durante l'operazione. Utilizzare un unguento veterinario sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
  4. Posizionare il topo su un telo chirurgico sterile in posizione prona, sterilizzare il sito di incisione con 50 ppm di acqua acida ipoclorosa (pH 5,0; HAW) e posizionare un telo chirurgico perforato sul topo.
    NOTA: Sterilizzare tutti i materiali chirurgici in autoclave, gas ossido di etilene o HAW. I chirurghi devono lavarsi le dita e indossare camici e guanti chirurgici.
  5. Eseguire due incisioni cutanee lunghe 5 mm a 2 cm di distanza l'una dall'altra nelle zone delle spalle e dei fianchi lungo la linea centrale della colonna vertebrale usando le forbici.
  6. Inserire una spatola per via sottocutanea attraverso l'incisione per creare una tasca sottocutanea.
  7. Inserire due o tre costrutti (~15 μL ciascuno, passaggio 5.1) in ciascuna tasca con una pinza. I costrutti di acido ialuronico impiantati nella stessa tasca sono soggetti a fusione molto frequentemente. Per evitare la fusione, inserire un costrutto HA in ciascuna tasca.
  8. Chiudere le incisioni con suture di seta intrecciata 4-0. Iniettare nel topo un antagonista degli anestetici preparato con 0,75 mg/kg di patipamezolo nel p.c. come descritto38.
  9. Mentre i topi si riprendono dall'anestesia, metti i topi in gabbie di recupero sterili contenenti lettiera sterile senza cibo e bottiglie d'acqua e monitora continuamente la temperatura corporea, il polso e la respirazione.
  10. Non lasciare i topi incustoditi fino a quando non hanno ripreso coscienza sufficiente per mantenere l'inquisizione sternale. Dopo il completo recupero, riportare gli animali nella stanza di allevamento con gli altri animali.
  11. Monitora gli animali ogni due giorni durante il periodo di guarigione per eventuali complicazioni. Sopprimere i topi per inalazione di anidride carbonica con poca sofferenza a 4 e 8 settimane dopo l'impianto.
  12. Incidere la pelle nei siti innestati e rimuovere i costrutti impiantati con una pinza. Fissare i costrutti in paraformaldeide al 4% per 16 ore e poi sottoporli ad analisi.

6. Analisi statistica

  1. Riportare i dati quantitativi come media ± deviazione standard (SD). Eseguire analisi statistiche utilizzando software commerciali.
  2. Utilizzare il test t di Student o l'ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto multiplo di Tukey per determinare differenze significative tra i gruppi. P<0,05 e P<0,01 indicano differenze significative tra i due gruppi.

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Risultati

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Gli idrogel di HA incapsulati in MSC sono stati coltivati in terreno condrogenico integrato con TGFβ3, un induttore della condrogenesi41 (fase 4.1). Abbiamo confrontato le proprietà dell'HA con quelle del collagene, che ha dimostrato di essere efficace nella creazione di innesti di cartilagine artificiale a base di MSC per l'ossificazione endocondrale, come descritto in precedenza38. Le MSC indifferenziate non sono state incluse come controlli negativi in questo studio perc...

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Discussione

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L'utilizzo di materiali per scaffold appropriati che promuovono la transizione dalla cartilagine ipertrofica all'osso è un approccio promettente per aumentare gli innesti di cartilagine ipertrofica ingegnerizzati basati su MSC e trattare difetti ossei di dimensioni clinicamente significative. Qui, mostriamo che l'HA è un eccellente materiale per scaffold per supportare la differenziazione del tessuto cartilagineo ipertrofico basato su MSC in vitro e per promuovere la formazione di osso endocondrale in vivo

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Dichiarazioni

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Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per la ricerca scientifica (KAKENHI) della Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) (sovvenzione n. JP19K10259 e 22K10032 a MAI).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,25 w / v% tripsina-1 mmol / l EDTA.4Na soluzioneFUJIFILM Wako Pure Chemical 209-16941
AntisedanNippon Zenyaku Kogyo
ascorbato-2-fosfatoNacalai Tesque13571-14
BambankerGC LymphotecCS-02-001
fattore di crescita fibroblastico di baseReprocellRCHEOT002 
albumina sierica bovinaFUJIFILM Wako Pure Chemical 012-238817,5 w/v%
Countess Contatore di cellule automatizzato con vetrini della camera di conteggio delle cellule e colorazione Trypan Blue 0,4%InvitrogenC10283
desametasoneMerckD8893
DomitorNippon Zenyaku Kogyo
DormicumAstellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle MediumMerckD6429alto glucosio
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 HamMerckD6421
Siero fetale bovinoHycloneSH30396.03
Gentamicina solfatoFUJIFILM Wako Pure Chemical 1676045  10 mg/mL
Generatore HaccpperTechnoMaxCH-400-5QB50 ppm acqua acida ipoclorosa
Cellule staminali mesenchimali umaneLonzaPT-2501
Kit di impalcatura per colture cellulari HyStemMerckHYS020
IL-1ßPeproTechAF-200-01B
Integratore ITS-GFUJIFILM Wako Pure Chemical 090-06741&volte; 100
L-Alanil-L-GlutamminaFUJIFILM Wako Pure Chemical 016-21841200mmol/L (&volte; 100)
L-prolinaNacalai Tesque29001-42
L-tiroxinaMerckT1775
MSCGM Terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali
BulletKit		LonzaPT-3001
paraffinaFUJIFILM Wako Pure Chemical 165-13375
PBS / pH7.4 100mlMedicago09-2051-100
TGF-β 3 ProteintechHZ-1090
VetorphaleMeiji Seika Kaisha
Visiocare UnguentoSAVAVET/SAVA Healthcare
β-glicerofosfatoFUJIFILM Wako Pure Chemical Codice 048-34332

Riferimenti

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