Formazione ossea integrata attraverso l'ossificazione endocondrale in vivo utilizzando cellule staminali mesenchimali

Summary

La terapia ossea tramite ossificazione endocondrale mediante l'impianto di tessuto cartilagineo artificiale prodotto da cellule staminali mesenchimali ha il potenziale per aggirare gli inconvenienti delle terapie convenzionali. Gli idrogel di acido ialuronico sono efficaci nel ridimensionare gli innesti di cartilagine uniformemente differenziati e nel creare osso integrato con vascolarizzazione tra innesti fusi in vivo.

Abstract

La terapia convenzionale di rigenerazione ossea che utilizza cellule staminali mesenchimali (MSC) è difficile da applicare a difetti ossei di dimensioni superiori a quelle critiche perché non ha un meccanismo per indurre l'angiogenesi. L'impianto di tessuto cartilagineo artificiale fabbricato da MSC induce l'angiogenesi e la formazione ossea in vivo tramite ossificazione endocondrale (ECO). Pertanto, questo approccio ECO-mediato potrebbe essere una promettente terapia di rigenerazione ossea in futuro. Un aspetto importante dell'applicazione clinica di questo approccio ECO-mediato è la definizione di un protocollo per la preparazione di una quantità sufficiente di cartilagine da impiantare per riparare il difetto osseo. In particolare, non è pratico progettare una singola massa di cartilagine innestata di dimensioni conformi alla forma del difetto osseo effettivo. Pertanto, la cartilagine da trapiantare deve avere la proprietà di formare integralmente l'osso quando vengono impiantati più pezzi. Gli idrogel possono essere uno strumento interessante per aumentare gli innesti di ingegneria tissutale per l'ossificazione endocondrale per soddisfare i requisiti clinici. Sebbene molti idrogel di derivazione naturale supportino la formazione di cartilagine MSC in vitro e ECO in vivo, il materiale ottimale per lo scaffold per soddisfare le esigenze delle applicazioni cliniche deve ancora essere determinato. L'acido ialuronico (HA) è un componente cruciale della matrice extracellulare della cartilagine ed è un polisaccaride biodegradabile e biocompatibile. Qui, mostriamo che gli idrogel di HA hanno eccellenti proprietà per supportare la differenziazione in vitro del tessuto cartilagineo a base di MSC e promuovere la formazione di osso endocondrale in vivo.

Introduction

L'osso autologo è ancora il gold standard per la riparazione di difetti ossei dovuti a traumi, difetti congeniti e resezione chirurgica. Tuttavia, l'innesto osseo autogeno presenta limitazioni significative, tra cui il dolore del donatore, il rischio di infezione e il volume osseo limitato che può essere isolato dai pazienti 1,2,3,4. Numerosi biomateriali sono stati sviluppati come sostituti ossei, combinando polimeri naturali o sintetici con materiali mineralizzati come il fosfato di calcio o l'idrossiapatite ^5,....

Protocol

Questo protocollo utilizza topi nudi maschi di 4 settimane. Ospitare quattro topi in una gabbia con un ciclo luce/buio di 12 ore a 22−24 °C e 50%-70% di umidità relativa. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti in conformità con le linee guida approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Tokyo Medical and Dental University (ID approvazione: A2019-204C, A2020-116A e A2021-121A).

1. Preparazione di tamponi e reagenti

1. Preparare il terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali (terreno di crescita MSC) aggiungendo il kit supplementare di terreno di crescita MSC al terreno....

Results

Gli idrogel di HA incapsulati in MSC sono stati coltivati in terreno condrogenico integrato con TGFβ3, un induttore della condrogenesi⁴¹ (fase 4.1). Abbiamo confrontato le proprietà dell'HA con quelle del collagene, che ha dimostrato di essere efficace nella creazione di innesti di cartilagine artificiale a base di MSC per l'ossificazione endocondrale, come descritto in precedenza³⁸. Le MSC indifferenziate non sono state incluse come controlli negativi in questo studio perc.......

Discussion

L'utilizzo di materiali per scaffold appropriati che promuovono la transizione dalla cartilagine ipertrofica all'osso è un approccio promettente per aumentare gli innesti di cartilagine ipertrofica ingegnerizzati basati su MSC e trattare difetti ossei di dimensioni clinicamente significative. Qui, mostriamo che l'HA è un eccellente materiale per scaffold per supportare la differenziazione del tessuto cartilagineo ipertrofico basato su MSC in vitro e per promuovere la formazione di osso endocondrale in vivo

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,25 w / v% tripsina-1 mmol / l EDTA.4Na soluzione	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbato-2-fosfato	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
fattore di crescita fibroblastico di base	Reprocell	RCHEOT002
albumina sierica bovina	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7,5 w/v%
Countess Contatore di cellule automatizzato con vetrini della camera di conteggio delle cellule e colorazione Trypan Blue 0,4%	Invitrogen	C10283
desametasone	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Merck	D6429	alto glucosio
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Merck	D6421
Siero fetale bovino	Hyclone	SH30396.03
Gentamicina solfato	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg/mL
Generatore Haccpper	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm acqua acida ipoclorosa
Cellule staminali mesenchimali umane	Lonza	PT-2501
Kit di impalcatura per colture cellulari HyStem	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
Integratore ITS-G	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	&volte; 100
L-Alanil-L-Glutammina	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200mmol/L (&volte; 100)
L-prolina	Nacalai Tesque	29001-42
L-tiroxina	Merck	T1775
MSCGM Terreno di crescita delle cellule staminali mesenchimali BulletKit	Lonza	PT-3001
paraffina	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β 3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Unguento	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glicerofosfato	FUJIFILM Wako Pure Chemical	Codice 048-34332