Questo studio descrive un metodo per isolare e purificare le vescicole extracellulari batteriche (BEV) arricchite da feci umane tramite centrifugazione a gradiente di densità (DGC), identifica le caratteristiche fisiche dei BEV dalla morfologia, dalla dimensione delle particelle e dalla concentrazione e discute le potenziali applicazioni dell'approccio DGC nella ricerca clinica e scientifica.
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Articolo metodologico
Isolamento e purificazione di vescicole extracellulari batteriche da feci umane mediante centrifugazione a gradiente di densità
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) sono nanovescicole derivate da batteri che svolgono un ruolo attivo nella comunicazione batterio-batterio e batterio-ospite, trasferendo molecole bioattive come proteine, lipidi e acidi nucleici ereditati dai batteri genitori. I BEV derivati dal microbiota intestinale hanno effetti all'interno del tratto gastrointestinale e possono raggiungere organi distanti, con conseguenti implicazioni significative per la fisiologia e la patologia. Le indagini teoriche che esplorano i tipi, le quantità e i ruoli dei BEV derivati dalle feci umane sono fondamentali per comprendere la secrezione e la funzione dei BEV dal microbiota intestinale. Queste indagini richiedono anche un miglioramento dell'attuale strategia per l'isolamento e la purificazione dei BEV.
Questo studio ha ottimizzato il processo di isolamento e purificazione dei BEV stabilendo due modalità di centrifugazione a gradiente di densità (DGC): Top-down e Bottom-up. La distribuzione arricchita dei BEV è stata determinata nelle frazioni da 6 a 8 (F6-F8). L'efficacia dell'approccio è stata valutata in base alla morfologia delle particelle, alle dimensioni, alla concentrazione e al contenuto proteico. Sono stati calcolati i tassi di recupero di particelle e proteine ed è stata analizzata la presenza di marcatori specifici per confrontare il recupero e la purezza delle due modalità DGC. I risultati hanno indicato che la modalità di centrifugazione top-down aveva livelli di contaminazione più bassi e raggiungeva un tasso di recupero e una purezza simili a quelli della modalità bottom-up. Un tempo di centrifugazione di 7 ore è stato sufficiente per raggiungere una concentrazione fecale di BEV di 108/mg.
Oltre alle feci, questo metodo potrebbe essere applicato ad altri tipi di fluidi corporei con opportune modifiche in base alle differenze nei componenti e nella viscosità. In conclusione, questo protocollo dettagliato e affidabile faciliterebbe l'isolamento e la purificazione standardizzati dei BEV e, quindi, getterebbe le basi per le successive analisi multi-omiche e gli esperimenti funzionali.
Introduzione
L'intestino è ampiamente riconosciuto come l'organo che ospita le comunità microbiche più abbondanti nel corpo umano, con oltre il 90% dei batteri coinvolti nella colonizzazione e moltiplicazione 1,2. Numerose evidenze hanno dimostrato che il microbiota intestinale modula il microambiente intestinale e contemporaneamente interagisce con la disfunzione in organi distanti, principalmente attraverso una barriera intestinale compromessa 3,4. Prove crescenti indicano una correlazione tra lo squilibrio del microbiota intestinale e la progressione della malat....
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Protocollo
Il Comitato Etico del Nanfang Hospital, Southern Medical University, ha approvato questo studio, che è stato condotto con il consenso informato dei partecipanti. Tutti i metodi utilizzati nel presente documento sono conformi alle linee guida operative standard fornite dagli standard internazionali del microbioma umano (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Tutte le successive procedure di manipolazione dei liquidi dovevano essere eseguite all'interno di una cabina di biosicurezza o di un banco ultra-pulito.
1. Raccolta e aliquotazione di campioni fecali
- Distribuire un campionatore di feci, un sacchetto sigi....
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Risultati
Determinare la distribuzione delle frazioni arricchite con BEV
Per determinare la distribuzione delle frazioni arricchite con vescicole extracellulari batteriche (BEV), è stato stabilito un controllo in bianco per misurare i valori di assorbanza a OD 340 nm e la densità di ciascuna frazione è stata calcolata in base alle misurazioni e alle linee guida sullo iodixanolo (Fase 8.1). La Tabella 2 presenta i risultati della densità, dimostrando che le frazioni da F4 a F9 hanno mostrato den.......
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Discussione
Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) sono nanoparticelle a doppio strato lipidico secrete dai batteri, che trasportano una ricchezza di proteine, lipidi, acidi nucleici e altre molecole bioattive, contribuendo a mediare gli effetti funzionali dei batteri20. È stato verificato che i BEV derivati dall'intestino sono coinvolti nello sviluppo di malattie, come la malattia infiammatoria intestinale, il morbo di Crohn e il cancro del colon-retto, e influenzano anche il metabolismo generale e med.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); il progetto Key della National Natural Science Foundation of China (82230080); il National Key R&D Program of China (2021YFA1300604); la Fondazione Nazionale Cinese per le Scienze Naturali (81871735, 82272438 e 82002245); Fondo di scienze naturali del Guangdong per giovani studiosi illustri (2023B1515020058); la Fondazione per le scienze naturali della provincia del Guangdong (2021A1515011639); il Major State Basic Research Development Program della Natural Scie....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 % (p/v) glutaraldeide (preparato da soluzione madre al 2,5 % in acqua deionizzata) | ACMEC | AP1126 | Osservazione morfologica per BEV utilizzando TEM alla fase 8.3.3 |
| 1 % (p/v) metilcellulosa (preparata da polvere originale in acqua deionizzata) | Sigma-Aldrich | M7027 | Osservazione morfologica per BEV utilizzando TEM alla fase 8.3.6 |
| 1,5 % (p/v) acetato di uranile (preparato da polvere originale in acqua deionizzata) | Polysciences | 21447-25 | Osservazione morfologica per BEV utilizzando TEM al passaggio 8.3.5 |
| 1000 μ L, 200 μ L, 10 μ L Pipetta | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Trasferire la soluzione |
| % (p/v) di soluzione di albumina di siero bovino (preparata dalla polvere originale in tampone TBST) | Fdbio science | FD0030 | Utilizzato nel western blotting per il blocco al passaggio 8.5.6 |
| 5 &volte il tampone di caricamento | Fdbio science | FD006 | Utilizzato nel western blotting e nella colorazione blu brillante di Coomassie al passaggio 8.5.1 |
| 75 % (v/v) di alcol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Disinfezione delle superfici |
| Piastra a 96 pozzetti | Rar | A8096 | Misurare i valori di assorbanza |
| Anticorpo anti-calnexina | Abcam | ab92573 | Western blotting (anticorpo primario) |
| Anticorpo anti-CD63 | Abcam | ab134045 | Western blotting (anticorpo primario) |
| Anticorpo anti-CD9 | Abcam | ab236630 | Western blotting (anticorpo primario) |
| Anticorpo anti-flagellina | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (anticorpo primario) |
| Anticorpo anti-integrina beta 1 | Abcam | ab30394 | Western blotting (anticorpo primario) |
| Anticorpo anti-LPS | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (anticorpo primario) |
| Anticorpo anti-LTA | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (anticorpo primario) |
| Anticorpo anti-OmpA | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (anticorpo primario) |
| Anticorpo anti-Syntenina | Abcam | ab133267 | Western blotting (anticorpo primario) |
| Anticorpo anti-TSG101 | Abcam | ab125011 | Western blotting (anticorpo primario) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilizzazione per forniture e terreni utilizzati nell'esperimento |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance il campione in provetta caricato con PBS |
| Saggio dell'acido bicinconnico | Fdbio science | FD2001 | Misurare il contenuto proteico dei BEV al passaggio 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Realizzare il flusso di lavoro schematico dell'isolamento e della purificazione dei BEV mostrato nella Figura 1 |
| Cabina di biosicurezza | Haier | HR1200- II B2 | Eseguire le procedure relative alla manipolazione dei campioni di feci |
| Centrifuga 5810 R; Rotore F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adattatore: 5804774000 | Pre-processo per BEV (Passaggio 3) |
| Apparato di chemiluminescenza | BIO-OI | OI600SE-MF | Utilizzato nel western blotting per il rilevamento del segnale al passaggio 8.5.12 |
| Cytation 5 | Rivelatore per micropiastre BioTek | F01 | per la misurazione dei valori di assorbanza (Passaggio 8.1) e fluorescenza (Figura 6) |
| Lipoproteina a bassa densità | ACMEC | AC12038 | Definizione della distribuzione dei componenti interferenti |
| Apparecchiature per elettroforesi | Bio-rad | 1658033 | Utilizzato nel western blotting per la separazione e il trasferimento di proteine ai passaggi 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Kit di chemiluminescenza potenziata HRP | Fdbio science | FD8020 | Utilizzato nel western blotting per il rilevamento del segnale al passo 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolare i BEV come controllo positivo. Protocollo: Sciogliere 25 g di polvere LB in 1 L di acqua deionizzata e sterilizzare in autoclave. Trasferisci l'800 μ L di Escherichia coli conservato nel terreno. Coltiva a 37 ° C nell'agitatore dell'incubatrice. Quindi centrifugare a 3.000 & volte; g per 20 min a 4 gradi C, 12.000 &volte; g per 30 min a 4 gradi C, filtrare il surnatante attraverso 0,22 μ m membrana ed eseguire centrifugazioni ultraveloci a 160.000 & g per 70 minuti a 4 °C. Il pellet definito come BEV grezzo da Escherichia coli è stato sospeso in 1,2 mL di PBS (Fase 3, 4). |
| Provette Falcon 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Pre-processo per BEV (Fase 3) |
| Tampone di colorazione Feto Protein | Absci | ab.001.50 | Colorazione blu brillante Coomassie al Passaggio 8.5.4 |
| Carta da filtro | Biosharp | BS-TFP-070B | Osservazione morfologica per BEV utilizzando TEM al Passaggio 8.3 (Blotting della soluzione) |
| Griglie in rame supportate da Formvar/Carbonio | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Osservazione morfologica per BEV utilizzando TEM al passaggio 8.3 |
| HEPES polvere | Meilunbio | MB6078 | Preparare tamponi iodixanolo con diverse concentrazioni per la centrifugazione in gradiente di densità |
| HRP AffiniPura capra anti-topo IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (anticorpo secondario) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Fdbio scienza | FDR007 | Western blotting (anticorpo secondario) |
| Agitatore per incubatrice | Qiangwen | DHZ-L | Coltiva Escherichia coli |
| Kimwipes&commercio; Salviette per compiti delicati | Kimtech Science | 34155 | Pulire la parete interna della provetta dell'ultracentrifuga al passaggio 4,15 |
| libbre di brodo | Hopebio | HB0128 | Coltivare Escherichia coli |
| Congelatore a bassa temperatura (-80 ° C) | Haier | DW-86L338J | Conservare i campioni |
| Metanolo | Alalddin | M116118 | Utilizzato nel western blotting per l'attivazione della membrana PVDF al passaggio 8.5.5 |
| Microprovette da 1,5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recuperare le frazioni dopo la centrifugazione in gradiente di densità Micro |
| provette da 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recuperare le frazioni dopo la centrifugazione in gradiente di densità |
| Micro provette 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recupera le frazioni dopo la centrifugazione in gradiente di densità Lettore |
| micropiastre | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Misura il contenuto proteico dei BEV al passo 8.2 |
| Filtro millipore 0,22 μ m | Merck millipore | SLGP033RB | Filtrazione sterilizzazione; Materiale: polietersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Soluzione di centrifugazione in gradiente di densità |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Soluzione di centrifugazione in gradiente di densità (regolazione del pH) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugazione per l'isolamento di BEV alla fase 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Soluzione madre per centrifugazione in gradiente di densità |
| Agitatore orbitale | Youning | CS-100 | Sciogliere le feci alla fase 2 |
| Soluzione salina tamponata con fosfato | Procell | PB180327 | Sciogliere le feci alla fase 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Trasferire la soluzione |
| Pipetta pasteur in plastica | ABCbio | ABC217003-4 | Rimuovere il surnatante nel pretrattamento al passaggio 3.4 |
| Membrane in polivinilidene difluoruro (PVDF) | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Utilizzato nel western blotting per il trasferimento di proteine al passaggio 8.5.5 |
| Gel di poliacrilammide prefabbricato, 4– 20% 15 pozzetti ACE | F15420Gel | Utilizzato nel western blotting per la separazione delle proteine ai passaggi 8.5.2, 8.5.3 | |
| Diluente anticorpale primario | Fdbio science | FD0040 | Utilizzato nel western blotting ai passaggi 8.5.8 |
| Scala proteica | Fdbio science | FD0672 | Utilizzato nel western blotting e nella colorazione blu brillante di Coomassie al passaggio 8.5 |
| Soluzione rapida di blotting proteico | UBIO | UW0500 | Utilizzato nel western blotting per il trasferimento di proteine alla fase 8.5.5 |
| Rotore SW 32 Ti Rotore a secchio oscillante Coltro | Beckman | 369650 | Ultracentrifugazione per l'isolamento di BEV alla fase 4, 7 |
| Siringhe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Tamponi di trasferimento e rimuovere il surnatante nella pre-elaborazione |
| della polvere TBS | Fdbio science | FD1021 | Utilizzato nel western blotting al passaggio 8.5 |
| Microscopio elettronico a trasmissione (TEM) | Hitachi | H-7650 | Osservazione morfologica per BEV al passaggio 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Utilizzato nel western blotting al passaggio 8.5 |
| Provetta per ultracentrifuga | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugazione per l'isolamento dei BEV al passaggio 4, 7 |
| Banco ultra-pulito | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Eseguire le procedure relative alla manipolazione dei liquidi |
| Bagno d'acqua | Bluepard | CU600 | Utilizzato per misurare il contenuto proteico dei BEV al passaggio 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (versione 8.05.14 SP7) | Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per misurare la dimensione delle particelle e la concentrazione dei BEV al passaggio 8.4 |
Riferimenti
- Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
- Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in healt....
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Ristampe e permessi
