Articolo metodologico

Isolamento e purificazione di vescicole extracellulari batteriche da feci umane mediante centrifugazione a gradiente di densità

DOI:

10.3791/65574

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1 settembre 2023

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1Department of Laboratory Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio descrive un metodo per isolare e purificare le vescicole extracellulari batteriche (BEV) arricchite da feci umane tramite centrifugazione a gradiente di densità (DGC), identifica le caratteristiche fisiche dei BEV dalla morfologia, dalla dimensione delle particelle e dalla concentrazione e discute le potenziali applicazioni dell'approccio DGC nella ricerca clinica e scientifica.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) sono nanovescicole derivate da batteri che svolgono un ruolo attivo nella comunicazione batterio-batterio e batterio-ospite, trasferendo molecole bioattive come proteine, lipidi e acidi nucleici ereditati dai batteri genitori. I BEV derivati dal microbiota intestinale hanno effetti all'interno del tratto gastrointestinale e possono raggiungere organi distanti, con conseguenti implicazioni significative per la fisiologia e la patologia. Le indagini teoriche che esplorano i tipi, le quantità e i ruoli dei BEV derivati dalle feci umane sono fondamentali per comprendere la secrezione e la funzione dei BEV dal microbiota intestinale. Queste indagini richiedono anche un miglioramento dell'attuale strategia per l'isolamento e la purificazione dei BEV.

Questo studio ha ottimizzato il processo di isolamento e purificazione dei BEV stabilendo due modalità di centrifugazione a gradiente di densità (DGC): Top-down e Bottom-up. La distribuzione arricchita dei BEV è stata determinata nelle frazioni da 6 a 8 (F6-F8). L'efficacia dell'approccio è stata valutata in base alla morfologia delle particelle, alle dimensioni, alla concentrazione e al contenuto proteico. Sono stati calcolati i tassi di recupero di particelle e proteine ed è stata analizzata la presenza di marcatori specifici per confrontare il recupero e la purezza delle due modalità DGC. I risultati hanno indicato che la modalità di centrifugazione top-down aveva livelli di contaminazione più bassi e raggiungeva un tasso di recupero e una purezza simili a quelli della modalità bottom-up. Un tempo di centrifugazione di 7 ore è stato sufficiente per raggiungere una concentrazione fecale di BEV di 108/mg.

Oltre alle feci, questo metodo potrebbe essere applicato ad altri tipi di fluidi corporei con opportune modifiche in base alle differenze nei componenti e nella viscosità. In conclusione, questo protocollo dettagliato e affidabile faciliterebbe l'isolamento e la purificazione standardizzati dei BEV e, quindi, getterebbe le basi per le successive analisi multi-omiche e gli esperimenti funzionali.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'intestino è ampiamente riconosciuto come l'organo che ospita le comunità microbiche più abbondanti nel corpo umano, con oltre il 90% dei batteri coinvolti nella colonizzazione e moltiplicazione 1,2. Numerose evidenze hanno dimostrato che il microbiota intestinale modula il microambiente intestinale e contemporaneamente interagisce con la disfunzione in organi distanti, principalmente attraverso una barriera intestinale compromessa 3,4. Prove crescenti indicano una correlazione tra lo squilibrio del microbiota intestinale e la progressione della malattia infiammatoria intestinale (IBD)5,6, nonché i disturbi cognitivi attraverso l'asse intestino-cervello 5,6,7,8. Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) prodotte dai batteri svolgono un ruolo significativo in questi processi patologici.

I BEV sono particelle su scala nanometrica che incapsulano derivati batterici, con diametri compresi tra 20 e 400 nm. È stato dimostrato che facilitano le interazioni tra i batteri e i loro organismi ospiti 9,10. Nonostante la loro invisibilità, queste particelle hanno attirato una crescente attenzione da parte dei ricercatori a causa delle loro ampie applicazioni come biomarcatori diagnostici, bersagli terapeutici e veicoli di somministrazione di farmaci11. Le feci umane, spesso utilizzate come campioni biologici per lo studio dei BEV, provenienti prevalentemente da batteri intestinali, contengono una complessa miscela di acqua, batteri, lipidi, proteine, residui di cibo non digerito e cellule epiteliali esfoliate, tra gli altri. L'intricata composizione fecale pone sfide all'isolamento e alla purezza dei BEV, impedendo così un'analisi completa, obiettiva e realistica dei BEV. Pertanto, le strategie efficaci per ridurre al minimo le interferenze dovute alla contaminazione dei componenti e migliorare la resa dei BEV sono emerse come questioni critiche che meritano un'attenzione immediata.

Le strategie di isolamento esistenti si basano in gran parte su tecniche come la centrifugazione ad altissima velocità (UC), la centrifugazione a gradiente di densità (DGC) e la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC)12,13,14,15,16,17. Attualmente, il DGC è uno dei metodi più ampiamente applicati nel campo della separazione dei BEV, che comprende due modalità di sedimentazione-galleggiamento, "Top-down" e "Bottom-up", che sono determinate dalla posizione di carico iniziale del campione. Queste metodologie differenziano le vescicole extracellulari (EV) da altri componenti in base alle disparità di dimensioni e densità, producendo velocità di purezza e recupero variabili. Ricerche precedenti hanno indicato che le strategie ad approccio singolo sono insufficienti per separare adeguatamente le vescicole extracellulari dalle proteine solubili nei campioni di fluidi corporei, come la lipoproteina nel sangue18 e la proteina Tamm-Horsfall nelle urine19. Inoltre, la distribuzione dimensionale delle vescicole extracellulari eucariotiche (EEV) spesso si sovrappone a quella dei BEV, rendendo quindi necessari ulteriori miglioramenti metodologici per ottimizzare la resa dei BEV. Di conseguenza, l'avanzamento dello studio dei BEV dipende dallo sviluppo di metodologie efficaci di separazione e purificazione. In particolare, Tulkens et al. 15 hanno impiegato una strategia biofisica ortogonale per separare i BEV fecali dagli EEV, in cui il tempo di centrifugazione di una modalità DGC dal basso verso l'alto era fino a18 ore. Al contrario, questo studio lo ha ridotto a 7 ore, risparmiando notevolmente il tempo di ultracentrifugazione a gradiente e semplificando il processo.

Nel presente studio, abbiamo isolato e purificato BEV fecali impiegando due modalità DGC in condizioni tampone ottimizzate, dopo aver arricchito i BEV con una gamma di velocità di centrifugazione differenziali, da bassa a altissima velocità. Le valutazioni basate sulla morfologia, la dimensione delle particelle e la concentrazione hanno indicato prestazioni encomiabili con questo metodo avanzato. Questo studio potrebbe fungere da base per la ricerca futura, estendendo le sue applicazioni a un dominio più ampio e offrendo approfondimenti sull'eterogeneità dei BEV all'interno del corpo umano. Contribuisce inoltre alla standardizzazione delle tecniche di separazione e analisi dei BEV.

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Protocollo

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Il Comitato Etico del Nanfang Hospital, Southern Medical University, ha approvato questo studio, che è stato condotto con il consenso informato dei partecipanti. Tutti i metodi utilizzati nel presente documento sono conformi alle linee guida operative standard fornite dagli standard internazionali del microbioma umano (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Tutte le successive procedure di manipolazione dei liquidi dovevano essere eseguite all'interno di una cabina di biosicurezza o di un banco ultra-pulito.

1. Raccolta e aliquotazione di campioni fecali

  1. Distribuire un campionatore di feci, un sacchetto sigillato e una scatola ghiacciata e fornire istruzioni complete ai partecipanti su come procurarsi e conservare i campioni.
  2. Istruire ogni partecipante a raccogliere il proprio campione fecale utilizzando il campionatore fornito e a trasportarlo in laboratorio a una temperatura di 4 °C entro una finestra di 24 ore.
  3. Al ricevimento in laboratorio, utilizzare un cucchiaio sterile per aliquotare meno di 3,5 g di feci in una provetta da centrifuga da 50 ml prepesata. Annotare il peso del campione fecale sulla provetta per le successive procedure di pretrattamento.
    PUNTO DI PAUSA: Se l'elaborazione immediata dei campioni non è possibile, assegnare il campione per la conservazione a lungo termine a -80 °C dopo un'opportuna annotazione.

2. Preparazione del campione di feci

  1. Raffreddare 500 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a 4 °C. Filtrare il PBS pre-raffreddato attraverso un filtro in polietersulfone (PES) da 0,22 μm utilizzando una siringa da 50 mL in dieci provette da centrifugazione da 50 mL.
  2. Posizionare due provette da 50 ml sul ghiaccio, ciascuna contenente 3,5 g di campioni fecali. Aggiungere 35 mL di PBS a ciascuna provetta.
    NOTA: Calcolare la quantità necessaria di PBS per la dissoluzione delle feci, garantendo una concentrazione massima del campione del 10% (p/v). Se si elaborano campioni aggiuntivi, utilizzare più provette secondo necessità.
  3. Agitare i campioni a 300 giri/min per 2 ore a 4 °C, oppure posizionarli per 8 ore almeno a 4 °C fino a quando le feci sono completamente sospese a vista.

3. Centrifugazione a velocità differenziale

  1. Raffreddare la centrifuga refrigerata ad alta velocità a 4 °C.
  2. Regolare il peso delle due provette contenenti i campioni preparati al punto 2.3 con PBS per raggiungere un peso totale di 0,1 g.
  3. Centrifugare i campioni a 3.000 × g per 20 minuti a 4 °C.
  4. Pipettare con cura il surnatante in due provette da centrifuga pulite da 50 mL, lasciando circa 1 mL sopra il pellet. Utilizzare una pipetta Pasteur in plastica usa e getta per questo processo.
  5. Regolare il peso dei due tubi con PBS per raggiungere un peso totale entro ± 0,1 g.
  6. Centrifugare il surnatante trasferito a 12.000 × g per 30 minuti a 4 °C.
  7. Aspirare il surnatante utilizzando una siringa da 20 mL, rimuovere l'ago della siringa e filtrarlo attraverso filtri da 0,22 μm in provette da 50 mL. A questo punto, il volume del surnatante dovrebbe essere di circa 30 ml.
    NOTA: Se dopo la centrifugazione di 12.000 × g è ancora visibile una quantità significativa di impurità, è necessario ripetere la fase di centrifugazione a 12.000 × g per 30 minuti a 4 °C. La mancata osservanza di questa precauzione può comportare una perdita significativa di BEV a causa dell'ostruzione dei pori durante la filtrazione.

4. Centrifugazione ad altissima velocità

  1. Pulire il rotore e la benna strofinandoli con alcol al 75% (v/v) per eliminare qualsiasi contaminazione residua.
  2. Posizionare una provetta per ultracentrifuga da 38,5 mL nel supporto della provetta.
    NOTA: Selezionare la provetta per ultracentrifuga appropriata in base al volume del campione. Evitare radiazioni ultraviolette e reagenti chimici non idonei per la sterilizzazione delle provette centrifughe come indicato nel manuale del prodotto.
  3. Trasferire circa 30 mL del surnatante fecale filtrato dalla fase 3.7 nella provetta per ultracentrifuga.
  4. Riempire la provetta dell'ultracentrifuga con circa 8 mL di PBS, lasciando uno spazio di 3 mm dall'apertura della provetta.
  5. Posizionare le due provette per ultracentrifuga con i campioni in secchi di ultracentrifugazione opposti, ad esempio, il secchio 1 corrisponde a 4 (1-4), 2-5, 3-6.
  6. Regolare il peso dei due secchi con PBS per ottenere un peso totale entro ± 0,005 g.
  7. Installare tutte le benne sul rotore, indipendentemente dal fatto che i tubi siano caricati.
  8. Avviare il vuoto e centrifugare i campioni a 160.000 × g per 70 minuti a 4 °C.
  9. Rilasciare il vuoto della camera e aprire lo sportello una volta visualizzato Ready (Pronto) sulla pagina Home dello strumento.
  10. Rimuovere il rotore dall'ultracentrifuga.
  11. Spostare le benne dal rotore alla rastrelliera e recuperare le provette utilizzando una pinza.
  12. Scartare il surnatante, che conterrà pellet marroni visibili sul fondo.
  13. Risospendere i pellet pipettandoli ripetutamente su e giù utilizzando una pipetta da 1.000 μL con 1 mL di PBS preraffreddato (4 °C) fino alla completa sospensione. Riempire la provetta con circa 37 mL di PBS, lasciando uno spazio di 3 mm dall'apertura.
  14. Eseguire un'altra ultracentrifugazione seguendo i passaggi 4.5-4.11 a 160.000 × g per 70 minuti a 4 °C per rimuovere i componenti contaminanti parzialmente attaccati dalle pareti del tubo.
  15. Scartare il surnatante, capovolgere le due provette dell'ultracentrifuga per 5 minuti ed eliminare la soluzione rimanente sulla parete interna con i tergicristalli.
    NOTA: La pulizia della parete interna riduce al minimo l'interferenza della contaminazione residua che aderisce alla parete della provetta dell'ultracentrifuga. Scegliere tergicristalli che non influenzino l'analisi BEV, in particolare per quanto riguarda la dimensione delle particelle.
  16. Risospendere i pellet in ciascuna provetta pipettandoli su e giù con 1,2 mL di PBS pre-raffreddato (4 °C) utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
  17. Trasferire 1,2 mL della soluzione PBS/BEV da una provetta per ultracentrifuga a una microprovetta pulita da 1,5 mL.
    PUNTO DI PAUSA: La soluzione PBS/BEV raccolta da una provetta per ultracentrifuga può procedere alla fase 6. Conservare la soluzione dall'altra provetta a -80 °C.

5. Preparazione della soluzione per la centrifugazione a gradiente di densità

  1. Preparazione del tampone HEPES da 0,02 M
    1. Combinare 0,477 g di polvere HEPES e 0,8 g di NaCl con 90 mL di acqua deionizzata sterilizzata in autoclave.
    2. Regolare il pH a 7,2 aggiungendo 1 M di idrossido di sodio (NaOH). Portare il volume a 100 mL con acqua deionizzata e filtrare la soluzione attraverso membrane in PES da 0,22 μm.
      ATTENZIONE: L'idrossido di sodio è un forte alcali caustico. Gli operatori devono maneggiarlo e prepararlo con cura in una cappa chimica.
  2. Preparazione del tampone del gradiente di densità
    1. Calcolare il volume richiesto di ciascun tampone a gradiente di densità in base al numero di provette per ultracentrifuga per la centrifugazione a gradiente di densità (fase 6) (in questo protocollo, i volumi per le soluzioni a gradiente al 60%, 50%, 40%, 20% e 10% erano rispettivamente di 2,5 mL, 3 mL, 6 mL, 6 mL e 6 mL).
    2. Per la preparazione di una soluzione di lavoro di iodixanolo al 50% (p/v), miscelare il tampone HEPES 0,02 M e la soluzione madre di iodixanolo al 60% (p/v) in un rapporto di volume di 1:5 (0,5 mL:2,5 mL).
      NOTA: Utilizzare una siringa monouso da 20 ml per prelevare la soluzione madre di iodixanolo ed evitare di introdurre aria.
    3. Per preparare tamponi di iodixanolo con diverse concentrazioni, combinare la soluzione di lavoro di iodixanolo al 50% della fase 5.2.2 con la soluzione di lavoro HEPES ottenuta nella fase 5.1 utilizzando una pipetta da 1.000 μL secondo le proporzioni indicate nella tabella 1.
      NOTA: Eseguire il passaggio 5 su un banco ultra pulito con le luci spente. Conservare la soluzione madre di iodixanolo aperta in frigorifero a 4 °C per prevenire la crescita batterica. Tenere la soluzione di iodixanolo e il tampone HEPES al riparo dalla luce.

6. Realizzazione di un sistema di centrifugazione a gradiente di densità

  1. Modalità DGC dall'alto verso il basso
    1. Combinare 500 μL di soluzione di PBS/BEV isolata dalla fase 4 con 3 mL di PBS. Miscelare delicatamente le soluzioni utilizzando una pipetta da 1.000 μL per ottenere 3,5 mL di soluzione PBS/BEV.
    2. Posizionare una provetta per ultracentrifuga da 31 mL su una piastra di schiuma forata ed etichettarla come "↓".
    3. Aggiungere verticalmente 3 mL della soluzione di iodixanolo al 50% sul fondo della provetta utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
    4. Inclinare il tubo a un angolo di 70° e posizionare un supporto per tubo o un altro supporto leggermente al di sopra del livello della piastra di schiuma, sotto l'apertura del tubo.
    5. Aggiungere 3 mL di soluzione di iodixanolo al 40% sopra la soluzione di iodixanolo al 50% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
    6. Aggiungere 3 mL di soluzione di iodixanolo al 20% sopra la soluzione di iodixanolo al 40% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
    7. Aggiungere 3 mL di soluzione di iodixanolo al 10% sopra la soluzione di iodixanolo al 20% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
    8. Aggiungere 3,5 mL di soluzione PBS/BEV del passaggio 6.1.1 sopra la soluzione di iodixanolo al 10% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
    9. Riportare delicatamente i tubi in posizione verticale.
      NOTA: Dopo il pipettaggio, la stratificazione deve essere visibile.
  2. Modalità DGC dal basso verso l'alto
    1. Posizionare una provetta per ultracentrifuga da 31 ml su una piastra di schiuma forata ed etichettarla come "↑".
    2. Aggiungere verticalmente 2,5 mL della soluzione madre di iodixanolo al 60% sul fondo della provetta. Miscelare delicatamente con 500 μL di soluzione PBS/BEV isolata dalla fase 4 utilizzando una pipetta da 1.000 μL per ottenere 3 mL di soluzione di iodixanolo/BEV al 50%.
    3. Inclinare il tubo a un angolo di 70° e posizionare un supporto per tubo o un altro supporto leggermente al di sopra del livello della piastra di schiuma, sotto l'apertura del tubo.
    4. Aggiungere 3 mL della soluzione di iodixanolo al 40% sopra la soluzione di iodixanolo/BEV al 50% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
    5. Aggiungere 3 mL della soluzione di iodixanolo al 20% sopra la soluzione di iodixanolo al 40% utilizzando una pipetta da 1000 μL.
    6. Aggiungere 3 mL della soluzione di iodixanolo al 10% sopra la soluzione di iodixanolo al 20% utilizzando una pipetta da 1000 μL.
    7. Aggiungere 3,5 mL di PBS sopra la soluzione di iodixanolo al 10% utilizzando una pipetta da 1.000 μL.
    8. Riportare delicatamente i tubi in posizione verticale.
    9. A questo punto sono rimasti 200 μL della sospensione ottenuta nella fase 4.17, che può essere analizzata successivamente come un gruppo chiamato "UC".
      NOTA: Quando si trasferiscono le soluzioni nella fase 6, tenere sempre il puntale della pipetta contro la parete della provetta per ultracentrifuga perpendicolare all'asse della provetta.

7. Centrifugazione a gradiente di densità e raccolta delle frazioni

  1. Regolare il peso dei due tubi con PBS per ottenere un peso totale entro ± 0,005 g.
  2. Mettere le provette nei secchi secondo il passaggio 4.5 e sottoporle a centrifugazione a 160.000 × g per 7 ore a 4 °C.
  3. Raccogliere le frazioni utilizzando un pipettatore (1000 μL) dall'alto verso il basso contro la parete laterale nel seguente ordine: 3 mL, 2 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1 mL, 1,5 mL e 3 mL in una provetta per ultracentrifuga da 38,5 mL.
    NOTA: Mantenere la linea di vista allo stesso livello della superficie del liquido.
  4. Eseguire l'ultracentrifugazione per ciascuna frazione ottenuta nella fase 7.3 secondo la fase 4 a 160.000 × g per 70 minuti a 4 °C.
  5. Rimuovere il surnatante e capovolgere le provette dell'ultracentrifuga per 5 min.
  6. Risospendere i pellet in 200 μL di PBS pre-raffreddato (4 °C) utilizzando una pipetta da 200 μL.
  7. Trasferire la soluzione PBS/BEV in una microprovetta pulita da 1,5 mL.
  8. Etichettare le frazioni da F1 a F10 e analizzarle in base al passaggio 8.
    PUNTO DI PAUSA: Se i campioni ottenuti al punto 7.8 non possono essere processati immediatamente, conservarli a -80 °C.

8. Caratterizzazione e analisi quantitativa delle frazioni raccolte

  1. Determinare i valori di assorbanza (OD 340 nm) di ciascuna frazione utilizzando un rivelatore per micropiastre con un controllo in bianco per calcolare la densità corrispondente.
    NOTA: Sostituire la soluzione PBS/BEV (passaggio 6.1.1 e passaggio 6.2.2) con PBS per stabilire un controllo vuoto.
    1. Preparare 100 μL ciascuno di soluzione di iodixanolo allo 0%, 5%, 10%, 12,5% e 20% diluita da HEPES 0,02 M a base di soluzione madre al 50% (passaggio 5.2.2) come standard, corrispondenti a densità rispettivamente di 1,0058 g/mL, 1,0318 g/mL, 1,058 g/mL, 1,0708 g/mL e 1,111 g/mL.
    2. Aggiungere 50 μL di ciascuna frazione dal controllo in bianco (preparato nella fase 7.3) e 50 μL di ciascuna soluzione standard (preparata nella fase 8.1.1) ai pozzetti duplicati di una piastra a 96 pozzetti.
    3. Impostare la lunghezza d'onda su 340 nm, misurare la densità ottica del punto finale e calcolare la densità di ciascuna frazione.
    4. Identifica F4-F9 come l'intervallo di frazioni BEV in base alla loro densità.
  2. Determinare la concentrazione proteica delle frazioni BEV utilizzando il saggio dell'acido bicinchoninico (BCA).
    1. Diluire la sostanza dieci volte in PBS fornito dal produttore per preparare una soluzione proteica standard da 0,5 μg/μL.
    2. Aggiungere la soluzione proteica standard (preparata nella fase 8.2.1) con volumi variabili secondo le istruzioni del reagente e integrare ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con PBS fino a un volume totale di 20 μL.
    3. Aggiungere 20 μL dei campioni preparati nella fase 7.8 e i campioni rimasti dopo la UC definita nella fase 6.2.9 in ciascun pozzetto.
    4. Miscelare i reagenti A e B in un rapporto di 50:1 e trasferire 200 μL in ciascun pozzetto.
    5. Incubare la piastra a bagnomaria a 37 °C per 30 min.
    6. Misurare il valore di assorbanza utilizzando un lettore per micropiastre, calcolare la concentrazione proteica (μg/μL) e determinare il contenuto proteico (μg) dei campioni in base alla curva standard (x: densità ottica; y: concentrazione proteica) generata dai valori delle soluzioni standard diluite al punto 8.2.2.
  3. Caratterizzare le frazioni di BEV definite nel passaggio 8.1.4 utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per verificare la presenza di BEV. Tutte le procedure riportate di seguito devono essere eseguite su ghiaccio.
    1. Applicare 10 μL di ciascuna frazione F4-F9 isolata del passaggio 7.8 e i campioni rimasti dopo l'UC definito nel passaggio 6.2.9 su griglie di rame supportate da formvar/carbonio per 20 minuti e tamponare con carta da filtro.
    2. Sciacquare i campioni con 100 μL di PBS tre volte per 1 minuto ciascuno e tamponare con carta da filtro.
    3. Fissare i campioni con 100 μL di glutaraldeide all'1% (p/v) per 5 minuti e tamponare con carta da filtro.
    4. Lavare le griglie con 100 μL di PBS dieci volte per 2 minuti ciascuna e tamponare con carta da filtro.
    5. Colorare le griglie con 50 μL di acetato di uranile all'1,5% (p/v) per 10 minuti e tamponare con carta da filtro.
      ATTENZIONE: L'acetato di uranile è radioattivo ed estremamente tossico se a contatto con la pelle o inalato. Maneggiare soluzioni con acetato di uranile in una cappa chimica e seguire le misure di sicurezza appropriate.
    6. Trasferire le griglie su una goccia di metilcellulosa all'1% (p/v) per 5 minuti e tamponare con carta da filtro.
    7. Conservare le griglie essiccate all'aria in un ambiente buio e privo di polvere fino all'osservazione.
    8. Acquisisci immagini e analizzale utilizzando un TEM.
  4. Caratterizzare le frazioni BEV definite nel passaggio 8.1.4 utilizzando l'analisi di tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per contare il numero di particelle.
    1. Calibrare il sistema utilizzando particelle di polistirene da 110 nm.
    2. Lavare il pool di campioni utilizzando PBS.
    3. Diluire i campioni delle diverse frazioni acquisite nella fase 7.8 e i campioni rimasti dopo la UC definita nella fase 6.2.9 a una concentrazione compresa tra 105 e 109 particelle/mL, con una concentrazione ottimizzata di 107 particelle/mL.
    4. Registra e analizza in 11 posizioni con tre repliche, mantenendo la temperatura intorno ai 23-30 °C.
  5. Analizzare il contenuto proteico dei campioni mediante colorazione blu brillante di Coomassie (CBBS) e western blotting (WB).
    1. Diluire i campioni BEV delle diverse frazioni ottenute nella fase 7.8 e i campioni rimasti dopo la UC definita nella fase 6.2.9 utilizzando PBS e tampone di carico a 5 × a una concentrazione finale di 0,5 o 1 μg/μL, se è necessaria la quantificazione, garantendo un carico sufficiente del campione di 20 μL (10 μg o 20 μg) di ciascun pozzetto nella fase 8.5.2. Far bollire i campioni a 95 °C per 10 min.
    2. Assemblare il gel di poliacrilammide prefabbricato nel serbatoio di elettroforesi e trasferire i campioni nei pozzetti.
    3. Eseguire l'elettroforesi verticale con i seguenti parametri: 160 V per 50 min.
    4. Colorare il gel nella soluzione blu brillante di Coomassie per 1 ora, risciacquare in acqua deionizzata fino a quando lo sfondo blu non si schiarisce e catturare le immagini con una fotocamera.
    5. Eseguire procedure di blotting proteico per altri gel con i seguenti parametri: 400 mA per 20 min.
    6. Bloccare le membrane di blotting con una soluzione di BSA al 5% (p/v) per 1 ora a temperatura ambiente.
    7. Lavare le membrane nel tampone TBST tre volte per 5 minuti ciascuna.
    8. Incubare le membrane con anticorpi primari (marcatori BEV: LPS, OMPA, LTA; Marcatori EEV: CD63, CD9, TSG-101, Sintenina, Integrina β1; Altri marcatori di contaminazione: Flagellina, Calnexina) per 8-12 ore a 4 °C.
    9. Lavare le membrane nel tampone TBST tre volte per 10 minuti ciascuna.
    10. Incubare le membrane con anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente.
    11. Eseguire il passaggio 8.5.9.
    12. Sviluppare il blotting utilizzando un apparecchio a chemiluminescenza.
    13. Sostituire la soluzione di PBS/BEV (passaggio 6.1.1 e passaggio 6.2.2) con BEV di Escherichia coli per stabilire un controllo positivo (vedere la tabella dei materiali per la procedura di isolamento dei BEV grezzi di E. coli) e condurre tutti gli esperimenti di cui sopra per la caratterizzazione dei BEV.
      PUNTO DI PAUSA: Determinare F6-F8 come distribuzione delle frazioni arricchite con BEV in base ai risultati della caratterizzazione sopra descritta per i BEV fecali e utilizzare questo intervallo ristretto per l'analisi successiva.
  6. Calcolare i tassi di recupero in termini di particelle e proteine per valutare l'efficienza delle due modalità DGC. I risultati riportati di seguito sono presentati in percentuale.
    1. Calcolare i tassi di recupero delle particelle in modalità Top-down: particelle totali in F6-F8/particelle dopo UC definite al punto 6.2.9.
    2. Calcolare i tassi di recupero delle particelle in modalità Bottom-up: particelle totali in F6-F8/particelle dopo UC definite al punto 6.2.9.
    3. Calcolare i tassi di recupero delle proteine in modalità Top-down: contenuto proteico totale in F6-F8 (μg)/contenuto proteico dopo UC definito nel passaggio 6.2.9 (μg).
    4. Calcolare i tassi di recupero delle proteine in modalità Bottom-up: contenuto proteico totale in F6-F8 (μg)/contenuto proteico dopo UC definito al punto 6.2.9 (μg).
  7. Calcolando il rapporto particelle/proteine per valutare la purezza tradizionalmente definita di UC e delle due modalità DGC, i risultati riportati di seguito sono stati tutti presentati in percentuale.
    1. Rapporto particelle/proteine dopo UC definito al punto 6.2.9: particelle dopo UC/contenuto proteico dopo UC (μg).
    2. Rapporto particelle/proteine in modalità Top-down: particelle totali in F6-F8/contenuto proteico in F6-F8 (μg).
    3. Rapporto particelle/proteine in modalità Bottom-up: particelle totali in F6-F8/contenuto proteico in F6-F8 (μg).
  8. Selezionare la modalità di centrifugazione più adatta (la modalità top-down è stata selezionata nel protocollo) per la purificazione del BEV fecale e l'analisi futura.

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Risultati

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Determinare la distribuzione delle frazioni arricchite con BEV
Per determinare la distribuzione delle frazioni arricchite con vescicole extracellulari batteriche (BEV), è stato stabilito un controllo in bianco per misurare i valori di assorbanza a OD 340 nm e la densità di ciascuna frazione è stata calcolata in base alle misurazioni e alle linee guida sullo iodixanolo (Fase 8.1). La Tabella 2 presenta i risultati della densità, dimostrando che le frazioni da F4 a F9 hanno mostrato den...

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Discussione

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Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) sono nanoparticelle a doppio strato lipidico secrete dai batteri, che trasportano una ricchezza di proteine, lipidi, acidi nucleici e altre molecole bioattive, contribuendo a mediare gli effetti funzionali dei batteri20. È stato verificato che i BEV derivati dall'intestino sono coinvolti nello sviluppo di malattie, come la malattia infiammatoria intestinale, il morbo di Crohn e il cancro del colon-retto, e influenzano anche il metabolismo generale e med...

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Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); il progetto Key della National Natural Science Foundation of China (82230080); il National Key R&D Program of China (2021YFA1300604); la Fondazione Nazionale Cinese per le Scienze Naturali (81871735, 82272438 e 82002245); Fondo di scienze naturali del Guangdong per giovani studiosi illustri (2023B1515020058); la Fondazione per le scienze naturali della provincia del Guangdong (2021A1515011639); il Major State Basic Research Development Program della Natural Science Foundation della provincia di Shandong in Cina (ZR2020ZD11); la Fondazione per la scienza post-dottorato (2022M720059); l'eccezionale programma di sviluppo dei giovani dell'ospedale di Nanfang, Southern Medical University (2022J001).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1 % (p/v) glutaraldeide (preparato da soluzione madre al 2,5 % in acqua deionizzata)ACMECAP1126Osservazione morfologica per BEV utilizzando TEM alla fase 8.3.3
1 % (p/v) metilcellulosa (preparata da polvere originale in acqua deionizzata)Sigma-AldrichM7027Osservazione morfologica per BEV utilizzando TEM alla fase 8.3.6
1,5 % (p/v) acetato di uranile (preparato da polvere originale in acqua deionizzata)Polysciences21447-25Osservazione morfologica per BEV utilizzando TEM al passaggio 8.3.5
1000 μ L, 200 μ L, 10 μ L PipettaKIRGENKG1313, KG1212, KG1011Trasferire la soluzione
% (p/v) di soluzione di albumina di siero bovino (preparata dalla polvere originale in tampone TBST)Fdbio scienceFD0030Utilizzato nel western blotting per il blocco al passaggio 8.5.6
5 &volte il tampone di caricamentoFdbio scienceFD006Utilizzato nel western blotting e nella colorazione blu brillante di Coomassie al passaggio 8.5.1
75 % (v/v) di alcolLIRCONLIRCON-500 mLDisinfezione delle superfici
Piastra a 96 pozzettiRarA8096Misurare i valori di assorbanza 
Anticorpo anti-calnexinaAbcamab92573Western blotting (anticorpo primario)
Anticorpo anti-CD63Abcamab134045Western blotting (anticorpo primario)
Anticorpo anti-CD9Abcamab236630Western blotting (anticorpo primario)
Anticorpo anti-flagellinaSino Biological40067-MM06Western blotting (anticorpo primario)
Anticorpo anti-integrina beta 1Abcamab30394Western blotting (anticorpo primario)
Anticorpo anti-LPSThermo FisherMA1-83152Western blotting (anticorpo primario)
Anticorpo anti-LTAThermo FisherMA1-7402Western blotting (anticorpo primario)
Anticorpo anti-OmpACUSABIOCSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/Western blotting (anticorpo primario)
Anticorpo anti-SynteninaAbcamab133267Western blotting (anticorpo primario)
Anticorpo anti-TSG101Abcamab125011Western blotting (anticorpo primario)
AutoclaveZEALWAYGR110DPSterilizzazione per forniture e terreni utilizzati nell'esperimento
BalanceMettler ToledoAL104Balance il campione in provetta caricato con PBS
Saggio dell'acido bicinconnico Fdbio scienceFD2001Misurare il contenuto proteico dei BEV al passaggio 8.2
BioRenderBioRenderhttps://app.biorender.comRealizzare il flusso di lavoro schematico dell'isolamento e della purificazione dei BEV mostrato nella Figura 1
Cabina di biosicurezzaHaierHR1200- II B2Eseguire le procedure relative alla manipolazione dei campioni di feci
Centrifuga 5810 R; Rotore F-34-6-38Eppendorf5805000092; 5804727002, adattatore: 5804774000Pre-processo per BEV (Passaggio 3)
Apparato di chemiluminescenzaBIO-OIOI600SE-MFUtilizzato nel western blotting per il rilevamento del segnale al passaggio 8.5.12
Cytation 5Rivelatore per micropiastre BioTekF01per la misurazione dei valori di assorbanza (Passaggio 8.1) e fluorescenza (Figura 6) 
Lipoproteina a bassa densitàACMECAC12038Definizione della distribuzione dei componenti interferenti 
Apparecchiature per elettroforesiBio-rad1658033Utilizzato nel western blotting per la separazione e il trasferimento di proteine ai passaggi 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Kit di chemiluminescenza potenziata HRP Fdbio scienceFD8020Utilizzato nel western blotting per il rilevamento del segnale al passo 8.5.12
Escherichia coli  American Type Culture CollectionATCC8739Isolare i BEV come controllo positivo. Protocollo: Sciogliere 25 g di polvere LB in 1 L di acqua deionizzata e sterilizzare in autoclave. Trasferisci l'800 μ L di Escherichia coli conservato nel terreno. Coltiva a 37 ° C nell'agitatore dell'incubatrice. Quindi centrifugare a 3.000 & volte; g per 20 min a 4 gradi C, 12.000 &volte; g per 30 min a 4 gradi C, filtrare il surnatante attraverso 0,22 μ m membrana ed eseguire centrifugazioni ultraveloci a 160.000 & g per 70 minuti a 4 °C. Il pellet definito come BEV grezzo da Escherichia coli è stato sospeso in 1,2 mL di PBS (Fase 3, 4).      
Provette Falcon 50 mLKIRGENKG2811Pre-processo per BEV (Fase 3)
Tampone di colorazione Feto ProteinAbsciab.001.50Colorazione blu brillante Coomassie al Passaggio 8.5.4
Carta da filtroBiosharpBS-TFP-070BOsservazione morfologica per BEV utilizzando TEM al Passaggio 8.3 (Blotting della soluzione)
Griglie in rame supportate da Formvar/Carbonio Sigma-AldrichTEM-FCF200CU50Osservazione morfologica per BEV utilizzando TEM al passaggio 8.3
HEPES polvereMeilunbioMB6078Preparare tamponi iodixanolo con diverse concentrazioni per la centrifugazione in gradiente di densità
HRP AffiniPura capra anti-topo IgG (H+L)Fdbio scienceFDM007Western blotting (anticorpo secondario)
HRP AffiniPure Goat Anti-rabbit IgG (H+L)Fdbio scienzaFDR007Western blotting (anticorpo secondario)
Agitatore per incubatriceQiangwenDHZ-LColtiva Escherichia coli 
Kimwipes&commercio; Salviette per compiti delicatiKimtech Science34155Pulire la parete interna della provetta dell'ultracentrifuga al passaggio 4,15
libbre di brodoHopebioHB0128Coltivare Escherichia coli 
Congelatore a bassa temperatura (-80 ° C)HaierDW-86L338JConservare i campioni
MetanoloAlalddinM116118Utilizzato nel western blotting per l'attivazione della membrana PVDF al passaggio 8.5.5
Microprovette da 1,5 mLKIRGENKG2211Recuperare le frazioni dopo la centrifugazione in gradiente di densità Micro
provette da 2 mLKIRGENKG2911Recuperare le frazioni dopo la centrifugazione in gradiente di densità
Micro provette 5 mLBBIF610888-0001Recupera le frazioni dopo la centrifugazione in gradiente di densità Lettore
micropiastre Thermo FisherMultiskan MK3Misura il contenuto proteico dei BEV al passo 8.2
Filtro millipore 0,22 μ mMerck milliporeSLGP033RBFiltrazione sterilizzazione; Materiale: polietersulfone, PES
NaClGHTECH1.01307.040Soluzione di centrifugazione in gradiente di densità
NaOHGHTECH1.01394.068Soluzione di centrifugazione in gradiente di densità (regolazione del pH)
Optima™ XPN-100Beckman CoulterA94469Ultracentrifugazione per l'isolamento di BEV alla fase 4, 7
OptiPrep™Serumwerk Bernburg AG1893Soluzione madre per centrifugazione in gradiente di densità
Agitatore orbitaleYouningCS-100Sciogliere le feci alla fase 2
Soluzione salina tamponata con fosfatoProcellPB180327Sciogliere le feci alla fase 2
PipettorEppendorf3120000267, 3120000259Trasferire la soluzione
Pipetta pasteur in plasticaABCbioABC217003-4Rimuovere il surnatante nel pretrattamento al passaggio 3.4
Membrane in polivinilidene difluoruro (PVDF)MilliporeISEQ00010, IPVH00010Utilizzato nel western blotting per il trasferimento di proteine al passaggio 8.5.5
Gel di poliacrilammide prefabbricato, 4– 20% 15 pozzetti ACEF15420GelUtilizzato nel western blotting per la separazione delle proteine ai passaggi 8.5.2, 8.5.3
Diluente anticorpale primarioFdbio scienceFD0040Utilizzato nel western blotting ai passaggi 8.5.8
Scala proteicaFdbio scienceFD0672Utilizzato nel western blotting e nella colorazione blu brillante di Coomassie al passaggio 8.5
Soluzione rapida di blotting proteicoUBIOUW0500Utilizzato nel western blotting per il trasferimento di proteine alla fase 8.5.5
Rotore SW 32 Ti Rotore a secchio oscillante ColtroBeckman369650Ultracentrifugazione per l'isolamento di BEV alla fase 4, 7
Siringhe 20 mL, 50 mL JetwayZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mLTamponi di trasferimento e rimuovere il surnatante nella pre-elaborazione
della polvere TBSFdbio scienceFD1021Utilizzato nel western blotting al passaggio 8.5
Microscopio elettronico a trasmissione (TEM)Hitachi H-7650Osservazione morfologica per BEV al passaggio 8.3
Tween-20Fdbio scienceFD0020Utilizzato nel western blotting al passaggio 8.5
Provetta per ultracentrifugaBeckman326823, 355642Ultracentrifugazione per l'isolamento dei BEV al passaggio 4, 7
Banco ultra-pulitoAIRTECHSW-CJ-2FDEseguire le procedure relative alla manipolazione dei liquidi
Bagno d'acquaBluepardCU600Utilizzato per misurare il contenuto proteico dei BEV al passaggio 8.2.5
ZetaViewParticle MetrixS/N 21-734, Software ZetaView (versione 8.05.14 SP7)Analisi del tracciamento delle nanoparticelle (NTA) per misurare la dimensione delle particelle e la concentrazione dei BEV al passaggio 8.4
5 di

Riferimenti

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