Articolo metodologico

Pinza iperglicemica e pinza ipoglicemica nei topi coscienti

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DOI:

10.3791/65581

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26 gennaio 2024

 , 
1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

In questo articolo

Sommario

Un morsetto iperglicemico viene utilizzato per misurare il rilascio di insulina con una concentrazione di glucosio nel sangue più elevata. Un morsetto ipoglicemico serve a misurare la produzione di glucosio indotta da risposte controregolatorie. Entrambi i metodi utilizzano la stessa procedura chirurgica. Qui, presentiamo una tecnica di clamp per valutare il metabolismo sistemico del glucosio.

Abstract

Il diabete mellito (DM) è causato da un insufficiente rilascio di insulina dalle cellule β pancreatiche (DM di tipo 1) e dalla sensibilità all'insulina nei muscoli, nel fegato e nei tessuti adiposi (DM di tipo 2). L'iniezione di insulina tratta i pazienti affetti da DM, ma porta all'ipoglicemia come effetto collaterale. Il cortisolo e le catecolamine vengono rilasciati per attivare la produzione di glucosio dal fegato per recuperare l'ipoglicemia, chiamate risposte controregolatorie (CRR). Nella ricerca sul DM che utilizza modelli di roditori, i test di tolleranza al glucosio e l'iniezione di 2-deossi-glucosio vengono utilizzati per misurare rispettivamente il rilascio di insulina e il CRR. Tuttavia, le concentrazioni di glucosio nel sangue cambiano in modo persistente durante gli esperimenti, causando difficoltà nella valutazione del rilascio netto di insulina e del CRR. Questo articolo descrive un metodo in cui la glicemia viene mantenuta a 250 mg/dL o 50 mg/dL in topi coscienti per confrontare il rilascio di insulina e ormoni CRR, rispettivamente.

Un tubo di polietilene viene impiantato nell'arteria carotide e nella vena giugulare dei topi e i topi possono riprendersi dall'intervento chirurgico. Il tubo della vena giugulare è collegato a una siringa Hamilton con una pompa a siringa per consentire l'infusione di insulina o glucosio a una velocità costante e variabile. Il tubo dell'arteria carotide serve per la raccolta del sangue. Per il morsetto iperglicemico, il glucosio al 30% viene infuso nella vena e i livelli di glucosio nel sangue vengono misurati dal sangue arterioso ogni 5 minuti o 10 minuti. La velocità di infusione del glucosio al 30% viene aumentata fino a quando il livello di glucosio nel sangue diventa di 250 mg/dL. Il sangue viene raccolto per misurare le concentrazioni di insulina. Per il morsetto ipoglicemico, 10 mU/kg/min di insulina vengono infusi insieme al 30% di glucosio, la cui velocità di infusione è variabile per mantenere un livello di glucosio nel sangue di 50 mg/dL. Il sangue viene raccolto per misurare gli ormoni controregolatori quando sia l'infusione di glucosio che la glicemia raggiungono uno stato stazionario. Sia le pinze iperglicemiche che quelle ipoglicemiche hanno la stessa procedura chirurgica e le stesse configurazioni sperimentali. Pertanto, questo metodo è utile per i ricercatori del metabolismo sistemico del glucosio.

Introduzione

Il glucosio è un'importante fonte di energia per le cellule e la mancanza di glucosio può portare a una varietà di sintomi e complicazioni. In caso di ipoglicemia (ipoglicemia, generalmente inferiore a 70 mg/dL nel livello di glucosio nel sangue a digiuno, ma non deve essere determinato da un singolo valore1), i sintomi più comuni includono debolezza, confusione, sudorazione e mal di testa. Può anche interrompere la funzione cerebrale e aumentare il rischio di eventi cardiovascolari e mortalità2. Al contrario, l'iperglicemia è una condizione medica in cui la concentrazione plasmatica di glucosio supera i livelli normali (generalmente > 126 mg/dL nel livello di glucosionel sangue a digiuno 3). Ciò può verificarsi in individui con diabete che hanno un deficit nella produzione o nell'utilizzo dell'insulina. L'iperglicemia può portare alla chetoacidosi diabetica, che si verifica quando il corpo non può utilizzare il glucosio per produrre energia, ma scompone invece gli acidi grassi come carburante. Lo stato iperglicemico iperosmolare aumenta anche la mortalità4. L'iperglicemia a lungo termine può causare danni ai vasi sanguigni, ai nervi e agli organi, portando allo sviluppo di diverse complicazioni croniche come malattie cardiovascolari, retinopatie e malattie renali. Pertanto, la concentrazione di glucosio nel sangue deve essere mantenuta in un intervallo ristretto tra 100 mg/dL e 120 mg/dL.

La glicemia è regolata dall'equilibrio tra l'ingresso e l'uscita di glucosio in un modello a un compartimento (Figura 1A). L'apporto di glucosio comprende il glucosio assorbito dal cibo e la produzione di glucosio dal fegato, dai reni e dall'intestino tenue. La produzione di glucosio comprende l'assorbimento del glucosio nei tessuti e lo smaltimento del glucosio dai reni. Sia la quantità di glucosio in ingresso che in uscita sono regolate dagli ormoni endocrini. Ad esempio, glucagone, corticosterone e catecolamine, noti come ormoni controregolatori, vengono rilasciati quando i livelli di glucosio nel sangue diminuiscono5. Stimolano la scomposizione del glicogeno e la sintesi del glucosio, principalmente dal fegato; Questi processi sono noti rispettivamente come glicogenolisi e gluconeogenesi. L'iperglicemia aumenta il rilascio di insulina dalle cellule β pancreatiche e stimola l'assorbimento del glucosio nei muscoli, nei tessuti adiposi e nel cuore 6,7,8,9. L'esercizio fisico aumenta l'assorbimento del glucosio insulino-indipendente10. Il sistema nervoso simpatico aumenta l'assorbimento del glucosio nei muscoli e nel tessuto adiposo bruno 6,11. Per misurare la capacità di regolare il metabolismo del glucosio nei tessuti periferici, i ricercatori utilizzano in genere il test di tolleranza al glucosio (GTT) e il test di tolleranza all'insulina (ITT) (Figura 1B,C). Nella GTT, devono essere considerati due fattori: il rilascio di insulina e la sensibilità all'insulina (Figura 1B). Tuttavia, la curva di concentrazione del glucosio durante il test di 120 minuti è diversa in ogni topo, il che può influenzare diverse quantità di rilascio ormonale. Nell'ITT, la glicemia è regolata sia dalla sensibilità all'insulina che dal rilascio di ormoni controregolatori. Pertanto, è difficile determinare il significato preciso del metabolismo del glucosio, del rilascio di insulina e della sensibilità all'insulina in GTT e ITT, in situazioni in cui i livelli di glucosio nel sangue non sono costanti.

Per ovviare a questi problemi, è auspicabile mantenere la glicemia a un livello costante (o "clamp"). Nel clamp iperglicemico, il glucosio viene infuso nel flusso sanguigno per aumentare i livelli di glucosio nel sangue a un livello specifico e quindi mantenuto a quel livello per un periodo di tempo. La quantità di glucosio infuso viene regolata in base alle misurazioni dei livelli di glucosio nel sangue ogni 5-10 minuti per mantenere uno stato stazionario. Questa tecnica è particolarmente utile per comprendere i parametri della secrezione di insulina a un livello di glucosio bloccato. Il morsetto ipoglicemico è un metodo per mantenere bassi i livelli di glucosio nel sangue mediante infusione di insulina. Il glucosio viene infuso a una velocità variabile per mantenere un livello specifico di glucosio nel sangue. Se il topo non riesce a riprendersi dall'ipoglicemia, deve essere infuso più glucosio.

Sebbene ci siano molti vantaggi nell'eseguire pinze iperglicemiche e ipoglicemiche, le procedure chirurgiche e sperimentali sono considerate tecnicamente difficili. Pertanto, pochi gruppi di ricerca sono stati in grado di farlo. Il nostro obiettivo era quello di descrivere questi metodi per i ricercatori con vincoli finanziari e di forza lavoro per avviare questi esperimenti con un budget inferiore.

Protocollo

Tutte le procedure sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università di Kumamoto.

NOTA: Per alleviare il dolore, l'ibuprofene è stato somministrato in acqua potabile (0,11 mg/ml) per 48 ore e la buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg i.p.) è stata somministrata 30 minuti prima dell'intervento chirurgico. Le condizioni sterili includono guanti, maschere e strumenti sterilizzati in autoclave con ossido di etilene tra gli animali. L'intervento è stato eseguito su un termoforo impostato a 37 °C e coperto da un nuovo tappetino da laboratorio per ogni animale. Prima dell'intervento, l'area chirurgica è stata pulita con una soluzione di betadina e alcool. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati sterilizzati con autoclave (per non più di due interventi chirurgici). Prima di effettuare l'incisione, i topi sono stati controllati per assicurarsi che fossero completamente anestetizzati . La profondità dell'anestesia per ciascun topo è stata valutata prima e durante l'intervento chirurgico pizzicando un dito del piede. Il periodo di acclimatazione non è stato superiore a 5 minuti ogni volta. Seguire le istruzioni dell'IACUC presso la rispettiva istituzione.

1. Preparazione di tubi per la vena giugulare e l'arteria carotide

  1. Sterilizzare tutti i tubi, le forniture in polipropilene (ad es. puntali per pipette) e i punti di sutura con un'autoclave o ossido di etilene. Per la vena giugulare, collegare 8 cm di tubo1 (vedi Materiali) e 3 cm di tubo2 utilizzando la colla (Figura 2A). Mettere 2 mm di tubo1 sulla parte superiore perché il tubo 2 (polietilene) è troppo duro e può danneggiare i vasi sanguigni (tubo 1.1).
  2. Tubo di prolunga per la vena giugulare (Tubing1.2) per infondere glucosio e insulina
    1. Preparare due provette da 30 cm e una provetta da 10 cm con tubi2 (Figura 2A). Tagliare l'estremità affilata di un puntale per pipette da 20 μL (o qualsiasi altro che abbia un'estremità stretta con diametro esterno < 0,5 mm per il collegamento con il tubo 1.1) e posizionarvi tre tubi2 (30 cm, 30 cm e 10 cm). Sigillare con colla adesiva.
    2. Posizionare 5 cm di tubo1 all'altra estremità del tubo2.
  3. Per l'arteria carotide (tubazione1.3): allungare la tubazione2 per renderla più sottile. Collegare 8 cm di tubo1 e 3 cm di tubo teso2 utilizzando la colla (Figura 2A). Fare un segno a 9 mm dalla punta.
  4. Ago con estremità non affilata che collega il tubo alla siringa: fare un graffio vicino all'estremità affilata dell'ago (23 G) con una lima metallica, piegarlo delicatamente avanti e indietro alcune volte con una pinza e romperlo. Eseguire lo stesso taglio al centro dell'ago per creare un pezzo di connettore metallico (Figura 2A).
  5. Tubo di prolunga per l'arteria per prelevare il sangue (set di tubi1.4): collegare 10 cm di tubo1 con il connettore metallico e l'ago non affilato realizzato al punto 1.4.
    NOTA: Tutti i tubi e le suture sono sterilizzati con autoclave o ossido di etilene

2. Chirurgia

  1. Anestetizzare un topo con isoflurano (1,5-2,0%) o ketamina/xilazina (ketamina 10 mg/mL, xilazina 1 mg/mL in soluzione fisiologica sterile allo 0,9%, 0,1 mL/10 g di peso corporeo (BW) tramite iniezione intraperitoneale [ip]). Tenere il mouse sul pad caldo (37 °C) per ridurre lo stress fisico. Attendere l'anestesia profonda per 5-10 minuti. Confermare la profondità dell'anestesia mediante il riflesso del pedale, la respirazione e la frequenza cardiaca e la risposta agli stimoli mediante pizzicamento delle dita dei piedi. Durante l'intervento chirurgico, è necessario utilizzare del nastro chirurgico per fissare il cappuccio nasale al tavolo operatorio per l'inalazione continua dell'anestesia. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza durante l'anestesia.
  2. Riempire la soluzione fisiologica eparinizzata (100 U/mL) nei tubi 1.1 e 1.3 e collegarli con una siringa da 1 mL con un ago non affilato (Figura 2B). Chiudere l'estremità del tubo3 (vedi Tabella dei materiali) fondendolo con un saldatore, che verrà utilizzato come tappo per il tubo1.1 e il tubo1.3.
  3. Radersi e pulire la prima area di incisione (interscapolare sul retro) e la seconda (collo nella parte anteriore) con tre cicli di betadine al 10% seguiti da una preparazione preoperatoria con alcol sterile al 70%. Eseguire una piccola incisione verticale sulla linea mediana di 5 mm cefalica fino allo sterno, sezionare i tessuti in modo smussato ed esporre l'arteria. Separare il nervo vago dall'arteria. Ciò riduce gli effetti negativi della rimozione del nervo vago sul metabolismo del glucosio.
    NOTA: Il passaggio dall'incisione ventrale al passaggio in cui il catetere viene inserito nella vena e fissato con suture di seta viene eseguito al microscopio.
  4. Posizionare due punti di sutura di seta sotto l'arteria. Arrestare il flusso sanguigno legando saldamente una sutura sul lato cranico (Figura 2C-1) e l'altra in modo lasco sul lato caudale (Figura 2C-2), il che è sufficiente per interrompere il flusso sanguigno ma sufficiente per riaprirlo in seguito. Posizionare un'altra sutura sotto l'arteria (Figura 2C-3).
  5. Tagliare l'arteria vicino alla Figura 2C-1 con le forbici a molla e posizionare il tubo 1.3 nell'arteria. Fate una fascetta allentata sia sull'arteria che sul tubo (Figura 2C-3, non legatela saldamente. Il tubo verrà inserito più in profondità nell'arteria). Aprire il nodo sul lato caudale (Figura 2C-2) per inserire il tubo fino a quando il segno di 9 mm raggiunge il nodo al centro (Figura 2C-3). Legare saldamente tutte le legature e sciacquare con soluzione fisiologica sterile eparinizzata.
  6. Esporre la vena giugulare destra dalla stessa incisione dell'arteria carotide destra per il catetere giugulare. Isolare l'estremità cranica e legarla con sutura di seta (Figura 2D-1, Tabella dei materiali). Posizionare un altro pezzo di sutura all'estremità caudale della vena esposta (Figura 2D-2). Tagliare la vena vicino al segno Figura 2D-1 con le forbici a molla.
  7. Inserire il catetere (non troppo in profondità per evitare che i vasi penetrino), legarlo e verificare visivamente che prelevi il sangue. Sciacquare con soluzione fisiologica sterile eparinizzata (0,2 ml) e confermare visivamente che non rimane sangue nel catetere.
  8. Posiziona il topo sul nuovo telo chirurgico sterile per prevenire l'infezione dalla prima ferita. Capovolgere il mouse, pulire con tre cicli di betadine seguiti da una preparazione preoperatoria con alcol sterile e praticare una piccola incisione tra le scapole.
  9. Passare un portaaghi sotto la pelle dall'incisione sul dorso al lato ventrale. Fissare i cateteri con il supporto dell'ago, farli passare sotto la pelle e riportarli indietro. Pulire il sito di incisione e chiudere le incisioni ventrali con una sutura sintetica (diametro 0,15-0,2 mm). Clamp il catetere venoso con micro serrefine nel sito di incisione tra le scapole.
  10. Tagliare il catetere 1 cm sopra la pinza, sciacquarlo con soluzione fisiologica eparinizzata e chiuderlo con un tappo (passaggio 2.4). Seguire la stessa procedura per il catetere arterioso. Chiudere l'incisione dorsale con una sutura sintetica (diametro 0,15-0,2 mm).
  11. Collocate il mouse in una gabbia calda e pulita (Figura 2E). Eseguire quotidianamente le cure postoperatorie.

3. Recupero

  1. Single-house il topo perché un altro topo potrebbe mordere il catetere nell'alloggiamento del gruppo.
    1. Per ridurre lo stress dovuto all'isolamento sociale, tenere i topi con arricchimenti ambientali (ad esempio, rifugi). Eseguire quotidianamente le cure postoperatorie. Per alleviare il dolore, l'angoscia e il disagio, fornire cure postoperatorie, compresa l'analgesia (ibuprofene in acqua potabile (0,11 mg/ml).
    2. Osservare i topi per segni di infezione, come putrefazione, letargia o dolore nel sito dell'incisione. La maggior parte dei topi sani inizia a camminare e a nutrirsi circa 2 ore dopo l'intervento chirurgico. Una postura ingobbita, la pelliccia arruffata e la diminuzione dell'assunzione di cibo possono indicare dolore. Se si osservano questi segni, sopprimere immediatamente i topi decapitandoli in anestesia profonda o asfissia da anidride carbonica.
  2. Il sangue entrerà nel catetere nell'arteria e formerà un coagulo. Per mantenere le linee del catetere, rimuovere il coagulo ogni giorno, seguendo i passaggi 3-6.
  3. Riempire una siringa da 1 mL e un ago da 23 G (estremità non tagliente) con soluzione fisiologica eparinizzata (100 U/mL). Utilizzando una camera a induzione, anestetizzare leggermente il topo con isoflurano (1,0%-1,5%). Quindi, rimuovere il topo dalla camera ed eseguire la rimozione del coagulo in anestesia con isoflurano con un tappo nasale.
  4. Clamp il tubo per l'arteria sul retro del topo con micro serrefine, rimuovere il cappuccio ed estrarre il sangue e i coaguli. Sciacquare il catetere con soluzione fisiologica eparinizzata utilizzando un'altra siringa da 1 ml con un ago da 23 G (estremità non tagliente) e richiuderlo. Pulire la linea venosa come la linea arteriosa in caso di coagulazione grave.
  5. Eseguire la stessa procedura per pulire il catetere una volta al giorno per 3-5 giorni.
  6. Controllare il peso corporeo del mouse. Se il peso corporeo si riduce di oltre il 10% dal giorno dell'intervento, applicare una terapia di supporto e cercare di migliorare il punteggio della condizione corporea normale e utilizzare il topo per un altro esperimento.
    NOTA: La perdita di peso degli animali è stata inferiore al 10% negli esperimenti in questo studio. La perdita di peso influenzerà fortemente il metabolismo sistemico del glucosio. Pertanto, si consiglia di attendere il recupero del peso corporeo o di rimuovere l'esperimento del morsetto.

4. Impostare il sistema di pompaggio (per pinza ipoglicemica)

  1. Preparare 1 U/mL di insulina in soluzione fisiologica BSA allo 0,1%, glucosio al 30% in soluzione fisiologica e soluzione fisiologica eparinizzata.
  2. Misurare il peso corporeo del topo. Calcolare il volume di 1 U/mL di insulina per rendere l'insulina infusa (10 mU/kg/min). Infondere 1,7 μL/min di soluzione di insulina nei topi nell'esperimento del clamp. Per produrre 300 μL di insulina infusa, il volume richiesto per 1 U/mL di insulina (μL) è 2,647 (μL/g) x peso corporeo (g). Un volume di 300 μL di insulina infusa è sufficiente per completare l'esperimento del clamp su 1 topo. La Tabella 1 mostra un esempio di infusato di insulina.
  3. Riempire l'insulina infusa e il 30% di glucosio in ciascuna siringa Hamilton, collegarli con il tubo 1.2 e posizionare la siringa sulla pompa a siringa (Figura 3A). Riempire ogni soluzione nel tubo 1.2. Riempire la soluzione fisiologica in una siringa da 1 mL e nel set di tubi 1.4 (Figura 2A).
  4. Anestetizzare il topo con isoflurano (1,0%-1,5%) e collegare il tubo1.2 al catetere venoso e il set di tubi1.4 al catetere arterioso (Figura 3A). Usa del nastro di cellophane per tenere insieme i tubi.
  5. Mettere il mouse in un bicchiere vuoto da 500 ml.
    NOTA: Per il morsetto iperglicemico, utilizzare soluzione fisiologica invece di 1 U/mL di insulina.

5. Pinza ipoglicemica

  1. Misurare i livelli di glucosio nel sangue ogni 5-10 minuti, come mostrato nella Figura 3B, e raccogliere campioni di sangue per le misurazioni ormonali a -15 minuti, 10 minuti, 20 minuti, 40 minuti, 60 minuti, 80 minuti, 100 minuti e 120 minuti. Seguire il passaggio 5.2 per misurare la glicemia.
    NOTA: Non è necessario misurare la glicemia in ogni momento, ma si consiglia di misurarla almeno ogni 10 minuti. Misurare la glicemia ogni 5 minuti quando il livello e la velocità di infusione del glucosio non sono costanti.
  2. Clamp l'estremità superiore del set di tubi1.4 e collegare una nuova siringa, estrarre 50 μL di sangue e posizionarlo in una provetta da 1.5 mL per il lavaggio. Misurare il livello di glucosio nel sangue.
    NOTA: Questo è il sangue diluito dalla soluzione salina nella provetta a causa del lavaggio del catetere dopo il precedente prelievo. Un volume di 50 μL è sufficiente per sostituire il sangue diluito con sangue puro.
  3. Conservare il sangue diluito (globuli rossi). Lavare il sangue raccolto (~500 μL) con soluzione fisiologica (vedere i passaggi 5.11-5.12) e tornare all'organismo per prevenire l'ipossia.
  4. Il catetere è collegato all'arteria con pressione alta, quindi quando la pinza viene allentata, il sangue fuoriesce e viene utilizzato per misurare il glucosio con un pratico glucometro. Infondere 50 μL di soluzione fisiologica per mantenere una quantità sufficiente di liquido sanguigno.
  5. Per il prelievo di sangue, prelevare altri 50 μL di sangue e inserirli in una provetta da 1,5 mL su ghiaccio. Infondere 100 μL (50 μL di sostituzione + 50 μL di campionamento) di soluzione fisiologica.
  6. Dopo 0 minuti di misurazione della glicemia, avviare la pompa siringa per insulina. Innanzitutto, infondere 30 mU/kg/min in bolo per 2 minuti (5,1 μL/min), quindi 10 mU/kg/min (1,7 μL/min) infusione per il resto della durata.
  7. Misurare il livello di glucosio nel sangue e modificare la velocità di infusione del glucosio ogni 5-10 minuti per 120 minuti.
  8. Creare uno stato stazionario in cui la velocità di infusione del glucosio non cambia e il livello di glucosio nel sangue è di 50 mg/dL.
  9. Dopo aver raccolto il campione di sangue a t = 120 min, infondere un agente di eutanasia nella vena giugulare e raccogliere i tessuti per l'analisi dell'RNA o delle proteine.
  10. Centrifugare il sangue a 1000 x g per 5 minuti e misurare la concentrazione ormonale come l'insulina o il peptide c utilizzando un kit ELISA secondo il protocollo del produttore.
  11. Per lavare il sangue, centrifugare il sangue a 1000 x g per 3 min. Rimuovere il surnatante, aggiungere 500 μL di soluzione fisiologica eparinizzata ed eseguire il pipettaggio.
  12. Ripetere nuovamente il lavaggio e mettere i globuli rossi lavati in una siringa da 1 ml per l'arteria. Le cellule del sangue verranno reinfuse automaticamente quando vengono infusi 50 o 100 μL di soluzione fisiologica nei passaggi 5.2 e 5.3. Monitorare attentamente l'ematocrito per prevenire l'ipossia.
    NOTA: Per la misurazione della glicemia, è stato utilizzato un pratico glucometro commerciale.

6. Pinza iperglicemica

  1. Seguire i passaggi della tecnica del clamp ipoglicemico, ma senza infusione di insulina e con la glicemia regolata a 250-300 mg/dL. Misurare i livelli di glucosio nel sangue ogni 5-10 minuti, come mostrato nella Figura 3B, e raccogliere campioni di sangue per le misurazioni ormonali a -15 minuti, 10 minuti, 20 minuti, 40 minuti, 60 minuti, 80 minuti, 100 minuti e 120 minuti.
  2. Collegare una nuova siringa al set di tubi1.4, estrarre 50 μL di sangue e inserirla in una provetta da 1.5 mL per il lavaggio.
  3. Per il prelievo di sangue, prelevare altri 50 μL di sangue e inserirli in una provetta da 1,5 mL su ghiaccio. Infondere 100 μL (50 μL di sostituzione + 50 μL di campionamento) di soluzione fisiologica.
  4. Dopo 0 minuti di misurazione della glicemia, avviare la pompa a siringa per glucosio. Innanzitutto, infondere 30 g/kg/min in bolo per 2 minuti (5,1 μL/min), quindi 10 g/kg/min (1,7 μL/min) per il resto della durata.
  5. Misurare il livello di glucosio nel sangue e modificare la velocità di infusione del glucosio ogni 5-10 minuti per 120 minuti. Creare uno stato stazionario in cui la velocità di infusione del glucosio non cambia e il livello di glucosio nel sangue è di 250-300 mg/dL, uno stato iperglicemico bloccato.

Risultati

Lo studio del clamp ipoglicemico è stato eseguito su topi maschi C57BL/6N (8 settimane di età, più di 25 g di peso corporeo) 3 ore a digiuno all'inizio dell'esperimento (Figura 4A,B). Il livello iniziale di glucosio nel sangue era di 136 mg/dL (t = -15 min). Se è inferiore a 90 mg/dL, potrebbe essere perché l'intervento chirurgico non è andato bene, o il catetere arterioso è stato inserito troppo in profondità, o i coaguli di sangue sono entrati nel flusso sanguigno. La condizione del topo dopo l'intervento chirurgico influisce sul metabolismo energetico nel topo. Il metabolismo fisiologico del glucosio non può essere misurato in cattive condizioni di salute. C57BL è più incline alla coagulazione dopo l'intervento chirurgico; i topi che hanno un peso corporeo più elevato, come i topi FVB o ICR, hanno meno probabilità di perdere peso a causa del lavaggio del coagulo dopo l'intervento chirurgico. Pertanto, è meglio per i principianti utilizzare i mouse FVB per esercitarsi nelle procedure di clamp. I topi C57BL richiedono cure più intensive. L'inserimento del catetere da 9 mm nell'arteria non ci ha dato alcun problema nella raccolta del sangue, anche nei topi FVB e ICR. L'insulina è stata iniziata a t = 0 min e i livelli di glucosio nel sangue sono diminuiti (Figura 4A). Il GIR non era stato stabile tra t = 0 min e t = 70 min. Successivamente, è diventato uno stato stazionario dopo 80 minuti.

Lo studio del clamp iperglicemico è stato eseguito anche in topi maschi C57BL/6N (8 settimane di età, più di 25 g di peso corporeo) a digiuno di 3 ore all'inizio dell'esperimento (Figura 4C,D). Dopo aver misurato la glicemia e raccolto campioni di sangue a t = -15 e t = -5 min, il glucosio è stato infuso da t = 0 min. Il livello di glucosio nel sangue è diventato di 250 mg/dL a t = 40 min. Lo stato stazionario è continuato da t = 30 min fino alla fine.

figure-results-1
Figura 1: Regolazione dei livelli di glucosio nel sangue. (A) Diagramma concettuale che illustra la regolazione della glicemia nell'organismo. (B,C) Regolazione del metabolismo del glucosio in (B) test di tolleranza al glucosio (GTT) e (C) test di tolleranza all'insulina (ITT). Diversi fattori regolano i livelli di glucosio nel sangue. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Preparazione dei tubi e fasi dell'intervento. (A) Immagini di tubi per l'arteria carotide e la vena giugulare. I numeri dei tubi corrispondono ai numeri dei passaggi del protocollo. (B) Metodo di preparazione dei tubi per l'intervento chirurgico. (C, D) Le posizioni numerate in cui i fili di seta sono legati per inserire il catetere nell'arteria (C) e nella vena (D). Posizioni dei fili di seta nel lato craniale (C-(1)) e caudale dell'arteria (C-(2)), e un altro nel mezzo di essi (C-(3)) (procedura 2-4). Posizioni dei fili di seta nel craniale (D-(1)) e caudale della vena (D-(2)), e un altro nel mezzo di essi (D-(3)) (procedura 2-6). (E) Diagramma delle cannule arteriose e venose che escono dalla parte posteriore Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Impostazione del morsetto. (A) Diagramma che mostra la configurazione di tubi, pompe, siringhe e mouse. (B) Foglio per registrare i livelli di glucosio nel sangue e la velocità di infusione del glucosio. 50 μL di sangue vengono raccolti a t = -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min e 120 min. La velocità di infusione di insulina è stata di 5,1 μL/min da t = 0 a 2 min ed è cambiata a 1,7 a t = 2 min. Il livello di glucosio nel sangue è stato misurato ogni 10 minuti. La glicemia è stata misurata ogni 5 minuti quando il suo livello non era stabile. La velocità di infusione del glucosio è stata modificata ogni volta che è stata misurata la glicemia. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Risultati rappresentativi del clamp ipoglicemico e del clamp iperglicemico. (A) Livelli di glucosio nel sangue e (B) velocità di infusione del glucosio del clamp ipoglicemico. (C) Livelli di glucosio nel sangue e (D) velocità di infusione del glucosio del morsetto iperglicemico. I dati rappresentano la media ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

SoluzioneCalcoloPer mouse da 20 g
1 U/mL di insulina(2.647 x peso corporeo) μL52,9 μL
0,1% soluzione salina BSA300 μL - volume di insulina (μL)247,1 μL

Tabella 1: Un esempio di calcolo per la preparazione dell'infuso di insulina.

Discussione

Il metodo qui descritto è semplice e può essere eseguito con puntali per pipette, siringhe e altri oggetti che si trovano nei normali laboratori. Sebbene i ricercatori possano aver bisogno di acquistare tubi e pompe aggiuntivi, non sono necessarie attrezzature costose. Pertanto, questo protocollo di cateterismo e clamp è più facile da avviare rispetto ai precedenti rapporti 12,13,14.

La tecnica del clamp è stata sviluppata intorno al 1970 ed è stata utilizzata nei topi e negli esseri umani15. È un metodo utile per misurare con precisione il metabolismo del glucosio e si dice che sia il gold standard. Tuttavia, non è una tecnica comune utilizzata da molti ricercatori. La tecnica del clamp iperinsulinemico-euglicemico è stata riportata nei topi13 e nei ratti14, ma il metodo di cateterizzazione qui è diverso e i lettori possono scegliere quello più facile per i loro esperimenti. Uno degli scopi di questo documento è quello di ridurre l'ostacolo per l'avvio di un esperimento. Pertanto, abbiamo fornito informazioni dettagliate sui materiali dei cateteri fatti a mano, sulle procedure chirurgiche e su un esempio di corso temporale sperimentale. Questi sono informativi per il ricercatore che tenta di eseguire il clamp per la prima volta.

La secrezione di insulina nell'obesità e nel diabete è stadio-dipendente. Molti rapporti suggeriscono che la secrezione di insulina è aumentata nell'obesità per ridurre la glicemia nello stato di insulino-resistenza16, ma la funzione delle cellule β sarà danneggiata nel tipo 2 DM17,18. In effetti, è stato riportato che il numero e l'area delle isole pancreatiche e la secrezione di insulina sono aumentati nei modelli murini di obesità, come i topi alimentati con una dieta ricca di grassi19 o i topi carenti di leptina20. In questi modelli murini, che hanno un fenotipo evidente, le differenze possono essere determinate esaminando i livelli di insulina nel sangue 15-30 minuti dopo la somministrazione di glucosio nel GTT. Tuttavia, in alcuni casi, non è facile determinare le differenze nella secrezione di insulina. Ad esempio, se i topi transgenici (Tg) hanno un livello di glucosio nel sangue di 500 mg/dL mentre un topo WT ha 300 mg/dL ed entrambi i topi hanno lo stesso livello di insulina nel sangue, possiamo dire che la secrezione di insulina diminuisce in Tg? In questo caso, non possiamo confrontare la capacità di secrezione di insulina a meno che i livelli di glucosio nel sangue non siano gli stessi utilizzando il metodo qui introdotto. Questo è uno dei motivi per cui non esiste una teoria consolidata su quando la funzione delle cellule β inizia a deteriorarsi nel passaggio dall'obesità al diabete. Possiamo anche misurare la secrezione di insulina mediante coltura primaria del pancreas21 o ex vivo22. Tuttavia, rovinerà l'effetto del sistema nervoso centrale sul rilascio di insulina perché l'innervazione del nervo vago verrà rimossa. La secrezione di insulina post-assorbimento è ben nota, ma anche il cervello e il sistema nervoso autonomo regolano il rilascio di insulina23. L'esperimento per analizzare quest'ultimo dovrebbe essere eseguito in un prelievo di sangue non anestetizzato, sfrenato e indolore. Questo è anche il motivo per cui il nervo vago deve essere separato dall'arteria carotide nella fase 2.3.

È stato riportato che il diabete mellito causa iperglicemia a causa della resistenza all'insulina e dell'aumento delle secrezioni di glucagone24 e di altri ormoni controregolatori25. Inoltre, episodi ripetuti di ipoglicemia negli esseri umani con diabete dovuti a fallimenti del dosaggio di insulina o ad altre cause possono portare a una condizione chiamata ipoglicemia ricorrente, in cui i pazienti sono inclini all'ipoglicemia26. È stato suggerito che il tasso di caduta della glicemia nella pinza ipoglicemica influisca sul rilevamento periferico o centrale dell'ipoglicemia27. L'ipoglicemia a insorgenza lenta può essere appropriata per studiare il ruolo dei sensori glicemici nelle vene portale-mesenteriche, mentre una diminuzione molto rapida della glicemia può essere per lo studio dei sensori glicemici27. L'insulina 1 U/mL viene utilizzata nei topi magri C57BL. Ma sarà necessaria una maggiore concentrazione di insulina nei topi obesi perché hanno insulino-resistenza e 1 U/mL non è sufficiente per ridurre i livelli di glucosio nel sangue.

Nel modello a un compartimento del pool glicemico (Figura 1A), la quantità di glucosio assorbito può influenzare la velocità di apporto di glucosio14. Pertanto, il tasso di produzione di glucosio, uno dei principali obiettivi della misurazione del clamp iperinsulinemico-euglicemico, può essere influenzato dalla durata del digiuno. Tuttavia, un lungo periodo di digiuno può aumentare il rilascio di ormoni controregolatori. Quindi, i ricercatori impostano il tempo di digiuno in base al loro scopo di analisi. Un altro metodo di pinza prevede il prelievo di sangue dalla coda, che è semplice perché è necessario inserire solo una cannula endovenosa14. Tuttavia, il sangue viene raccolto in una contenzione, che provoca una moderata quantità di stress da contenimento e un aumento delle catecolamine plasmatiche e di altri ormoni dello stress14. Inoltre, è preferibile misurare le concentrazioni ormonali nel flusso sanguigno al centro del corpo piuttosto che nel sangue alle estremità. Pertanto, il prelievo di sangue dalle arterie nei topi che si muovono liberamente è il migliore per misurare fisiologicamente il metabolismo del glucosio. I topi non si muovono e la rotazione non è necessaria quando sono acclimatati all'ambiente sperimentale. Tuttavia, si consiglia di utilizzare una parte girevole per evitare che le linee di infusione e di campionamento si impigliano. Il tubo1.2 e il set di tubi1.4 (Figura 3A) non sono adatti per l'utilizzo di una parte girevole. Il sistema dovrebbe essere migliorato se il ricercatore è tenuto a utilizzare una girella. La reinfusione delle cellule del sangue non influenza lo stato stazionario stabilito della glicemia e dell'insulina. Il presente metodo può essere applicato anche a studi di metabolomica utilizzando isotopi. Ad esempio, se il glucosio 13viene continuamente infuso in vena, è possibile misurare il tasso di turnover metabolico sistemico e i metaboliti intermedi intracellulari28. Pertanto, questo è un metodo utile per analizzare il metabolismo del glucosio.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla Leading Initiative for Excellent Young Researchers (del MEXT); una sovvenzione per la ricerca scientifica (B) (sovvenzione numero JP21H02352); Agenzia giapponese per la ricerca e lo sviluppo medico (AMED-RPIME, numero di sovvenzione JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); la Uehara Memorial Foundation; Fondazione Astellas per la ricerca sui disturbi metabolici; Suzuken Memorial Foundation, Akiyama Life Science Foundation e Narishige Neuroscience Research Foundation. Ringraziamo anche Nur Farehan Asgar, Ph.D, per aver curato una bozza di questo manoscritto.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Colla adesivaHenkel AG & Co. KGaALOCTITE 454
Kit ELISA (peptide C)Morinaga Institute of Bilogical Science IncM1304Kit ELISA per peptide C di topo
Kit ELISA (insulina)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation633-03411Kit ELISA per insulina di topo LBIS (tipo U)
Pratico glucometroNipro Co.11-777Insulina Free Style Freedom Lite
(100U/ml)Eli Lilly & Co.428021014Humulin R (100U/ml)
MouseJapan SLC Inc.C57BL/6NCrSlcC57BL
SuturaNatsume seisakushoC-23S-560 No.2
a siringaInc.NE-1000
Sutura sinteticaVÖ MELHR-17
Tubing1AS ONE Corporation9-869-01LABORAN(R) Silicone
Tube Tubing2Fisher Scientific427400BD Intramedic PE Tubing Tubing3
IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.dimensione5Tubo in polietilene dimensione5
Sistemi di pompe sterilizzati

Riferimenti

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  26. Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
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  28. TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).

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