Produzione e ottimizzazione di LTE, un sistema di espressione proteica libera derivato da Leishmania tarantolae per la produzione di proteine ricombinanti

Sommario

L'estratto traslazionale di Leishmania (LTE) è un sistema di espressione proteica eucariotico privo di cellule derivato dal parassita unicellulare Leishmania tarentolae. Questo protocollo ottimizzato rende l'LTE semplice ed economico da produrre. È adatto per varie applicazioni incentrate sull'espressione multiparallela e sullo studio di proteine eucariotiche complesse e delle loro interazioni.

Abstract

Questo protocollo delinea la produzione e l'ottimizzazione di un sistema di espressione proteica eucariotica (CFPS) derivato dal flagellato unicellulare Leishmania tarentolae, denominato Leishmania Translational Extract o LTE. Sebbene questo organismo si sia originariamente evoluto come parassita dei gechi, può essere coltivato facilmente ed economicamente in fiasche o bioreattori. A differenza della Leishmania major, non è patogena per l'uomo e non richiede particolari precauzioni di laboratorio. Un altro vantaggio dell'utilizzo di Leishmania per la CFPS è che l'aggiunta di un singolo oligonucleotide antisenso alla CFPS, mirata a una sequenza leader di splicing conservata sull'estremità 5' di tutti gli RNA codificanti proteine, può sopprimere l'espressione proteica endogena. Forniamo procedure per la disgregazione cellulare e il trattamento del lisato, che sono state semplificate e migliorate rispetto alle versioni precedenti. Queste procedure iniziano con semplici colture in fiaschetta. Inoltre, spieghiamo come introdurre informazioni genetiche utilizzando vettori contenenti siti di inizio della traduzione specie-indipendenti (SITS) e come eseguire l'ottimizzazione dei lotti e il controllo di qualità per garantire una qualità costante dell'espressione proteica.

Introduzione

Negli anni '60, i sistemi di espressione proteica libera da cellule hanno svolto un ruolo fondamentale nella scoperta del codice genetico¹. Tuttavia, i sistemi di espressione proteica liberi da cellule procariotiche, basati principalmente su E. coli, attualmente dominano sia le applicazioni di laboratorio che quelle commerciali. Sebbene i sistemi basati su E. coli offrano vantaggi quali economicità, scalabilità e alte rese di espressione, devono affrontare sfide quando producono proteine multidominio nelle loro forme attive e facilitano l'assemblaggio di complessi proteici ^2,3. Al giorno d'oggi, le forme comunemente usate di sintesi proteica eucariotica libera da cellule (CFPS) includono l'estratto di germe di grano (WGE), il lisato di reticolociti di coniglio (RRL) e il lisato di cellule di insetto (ICL)^4,5,6. Questo lavoro introduce un sistema alternativo privo di cellule eucariotiche che è sia semplice che scalabile, basato sul parassita flagellato unicellulare Leishmania tarentolae.

Leishmania tarentolae può essere coltivata facilmente in fiasche utilizzando terreni economici e può anche essere ingrandita in bioreattori per ottenere una maggiore densità cellulare. La presenza di mRNA endogeni nel lisato cellulare, che potrebbero altrimenti competere con i messaggi introdotti, può essere neutralizzata utilizzando oligonucleotidi antisenso che hanno come bersaglio la sequenza⁷ conservata dello splicing dell'mRNA di Leishmania. A differenza del suo parente stretto Leishmania major, che causa malattie umane, L. tarentolae infetta il geco moresco (Tarentolae mauritanica), rendendolo adatto alla coltivazione in ambienti di laboratorio PC2 senza la necessità di particolari precauzioni. È stato precedentemente utilizzato come organismo transgenico per l'espressione proteica in vivo⁸.

Per facilitare il priming del modello nei sistemi privi di cellule, sono state progettate sequenze universali basate su strutture polimeriche di RNA che migliorano l'inizio traduzionale⁹. Queste sequenze di traduzione specie-indipendenti (SITS) sono applicabili sia ai sistemi procariotici che eucariotici e sono adatte per introdurre informazioni genetiche nell'LTE. Sebbene questo protocollo non fornisca una spiegazione dettagliata della costruzione del vettore per l'espressione proteica libera da cellule LTE, l'ottimizzazione e il controllo di qualità richiedono vettori adeguati contenenti fusioni di fluorofori delle proteine desiderate di interesse a valle del sito SITS. A tale scopo, sono stati depositati appropriati vettori LTE nel repository genico Addgene, come il vettore pCellFree_G03, che codifica una fusione N-terminale di eGFP con la proteina desiderata di interesse utilizzando i siti di clonazione Gateway.

L'LTE ha dimostrato il suo valore in un'ampia gamma di applicazioni che richiedono l'espressione di proteine, tra cui l'analisi dell'autoassemblaggio delle proteine^10,16, la produzione di proteine di membrana integrali umane¹⁷, la ricerca su candidati farmaci antivirali¹⁸, lo sviluppo di enzimi biotecnologicamente utili¹⁹, la prototipazione di biosensori proteici^20,21 e lo studio di farmaci biologici da anchilostomi²². L'LTE è stato anche determinante nella mappatura delle reti di interazione proteina-proteina nei campi della virologia e delle strutture cellulari^21,32. L'LTE è stato confrontato per funzionare in modo simile ad altri sistemi privi di cellule eucariotiche nell'esprimere proteine a lunghezza intera, monodisperse e non aggregate³³, il tutto offrendo una produzione più economica e scalabile.

Questo protocollo fornisce tecniche per coltivare e distruggere l'organismo ospite, preparare il lisato e integrare una soluzione di alimentazione (FS) per l'espressione proteica accoppiata di trascrizione/traduzione. Inoltre, include un protocollo per l'ottimizzazione dei lotti di produzione. Nella versione iniziale del sistema cell-free Leishmania, è stata osservata una variazione indesiderata da lotto a lotto nei livelli di espressione, nella frazione di proteine a lunghezza intera e nella presenza di aggregati proteici, portando allo smaltimento dei lotti³⁴. Per risolvere questo problema sono stati apportati successivi miglioramenti al protocollo²⁵. L'attuale protocollo si basa su questi miglioramenti, consentendo di ottimizzare i singoli lotti per il picco di espressione e dimensione delle proteine. Raggiunge questo obiettivo controllando attentamente il carico del disgregatore cellulare (misurato come densità ottica a 600 nm; OD_600nm) e normalizzando l'output di lisato risultante utilizzando l'assorbanza a 280 nm (Abs_280nm). Inoltre, incorpora un metodo per integrare parzialmente il lisato con rNTP e magnesio durante la produzione, con successiva ottimizzazione di questi componenti della soluzione alimentare durante le espressioni di prova. Sebbene questa ottimizzazione sia presentata come un'opzione nel protocollo, è fortemente raccomandata dagli autori.

Protocollo

Questo protocollo include ricette dettagliate e passaggi dei terreni che coinvolgono la coltura, la centrifugazione, la misurazione della fluorescenza GFP utilizzando un lettore di piastre multimodale, la misurazione della coltura OD_{600 nm} e la valutazione del lisato Abs_{280 nm}. Copre anche la configurazione e l'imaging dei gel proteici SDS-PAGE. I materiali richiesti o suggeriti per questo protocollo sono elencati nel foglio di calcolo dei materiali. È importante notare che le tipiche risorse di laboratorio come componenti di terreni, centrifughe, provette, spettrofotometri e configurazioni di elettroforesi su gel possono probabilmente essere utilizzate in modo intercambiabile, se non diversamente specificato. La Figura 1 fornisce un riepilogo del processo di produzione LTE.

Figura 1: Panoramica del protocollo di produzione LTE. Questo cartone animato fornisce un breve riassunto del protocollo di produzione LTE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Crescita delle colture di Leishmania tarentolae

1. Preparare almeno 3 L di terreno di coltura TBGG (Bactotriptone 12 g/L, Estratto di lievito 24 g/L, Glicerolo 8 mL/L, Glucosio 1 g/L, KH₂PO₄ 2,3 g/L, K₂HPO₄ 2,5 g/L, vedere la Tabella dei materiali). Sterilizzare il terreno utilizzando un filtro da 0,22 μm sotto vuoto o una configurazione simile.
2. Conservare il terreno a temperatura ambiente (RT), con le aggiunte finali (Hemin, antibiotici) aggiunte appena prima dell'inoculazione con L. tarentolae. L'emina (0,25% v/v in 50% trietanolammina) viene aggiunta allo 0,2% v/v, la penicillina (10.000 unità/mL) più la streptomicina (10.000 μg/mL) si mescolano allo 0,5% v/v.
   NOTA: Il punto di partenza di questo protocollo è una coltura mantenuta di 2 x 10 mL di L. tarentolae wild type. Le colture di mantenimento vengono coltivate a 27 °C in fiasche standard da 50 mL per colture tissutali con bassa agitazione (75 giri/min). Tali colture da 10 mL possono essere mantenute indefinitamente con ~1/20 diluizioni in sterili (TBGG + emina, penicillina, streptomicina) ogni 2-3 giorni. Si consiglia una cabina di biosicurezza standard in un laboratorio PC2; tuttavia, le contaminazioni batteriche tendono ad essere prevenute dagli antibiotici aggiunti, mentre le contaminazioni fungine sono generalmente superate da L. tarentolae.
3. Nell'arco di due giorni, espandere le colture di mantenimento di L. tarentolae a 200 ml (giorno 1) e poi a 2 litri (giorno 2) tramite diluizioni 1:10 con un volume crescente di TBGG + emina/antibiotici ogni giorno. Eseguire entrambe le diluizioni in palloni di vetro deflettori da 5 L sterilizzati in autoclave (riempiti fino a un massimo di 1 L). La seconda diluizione deve avvenire nel pomeriggio tra le 15 e le 18, con l'intenzione di iniziare la produzione di lisato il giorno successivo tra le 8 e le 11.
   NOTA: questo protocollo utilizza il volume iniziale minimo per la produzione di LTE (2 colture da 1 L). È anche possibile espandere la coltura fino a 10 L per la produzione di LTE incorporando un'ulteriore fase di espansione (ad esempio, Giorno 1: 100 mL; Giorno 2: 1 L; Giorno 3: 10 L). Sebbene questo protocollo utilizzi palloni deflettori (vedi Tabella dei materiali) per coltivare L. tarentolae, opzionalmente, possono essere utilizzati bioreattori convenzionali progettati per la crescita batterica con giranti Rushton, a condizione che la velocità di agitazione sia mantenuta al di sotto di 100 giri/min. Il miglioramento dell'aerazione e del controllo del pH nei bioreattori generalmente prolunga la crescita in fase logaritmica delle colture di L. tarentolae , consentendo di utilizzare un raccolto più elevato di_{600 nm} di 10 da utilizzare nella fase 1.4.
4. Registrare l'OD_600nm della coltura in triplicato tramite una diluizione 1:10 in TBGG direttamente nella cuvetta dello spettrofotometro. Un intervallo di partenza adatto per la produzione di lisato è OD_600nm = 4.0-8.0.
5. Fornire un tempo di incubazione aggiuntivo se OD_600nm < 4.0. Una coltura con OD_600nm > 8 è utilizzabile e si tradurrà in un volume maggiore di lisato di espressione cell-free, ma con una qualità inferiore a causa dell'inizio della fase di crescita tardiva. Posizionare i fiasche di coltura sul ghiaccio, in attesa dei passaggi successivi.
   NOTA: La misurazione accurata della coltura finale OD_600nm è fondamentale, in quanto viene utilizzata per calcolare il volume finale delle cellule concentrate prima dell'interruzione. Questo calcolo sostituisce un metodo di pesatura dei pellet utilizzato nelle versioni precedenti della produzione LTE per calibrare la concentrazione delle celle prima dell'interruzione³⁴, al fine di semplificare il protocollo. Assicurarsi di diluire in TBGG per la misurazione OD_600nm , altrimenti lo shock osmotico modifica la forma della cella, causando errori di misurazione. Pipettare la diluizione 1:10 per la misurazione OD_600nm (direttamente nella cuvetta) pochi secondi prima di eseguire la lettura spettrofotometrica, poiché le cellule di L. tarentolae si depositano rapidamente con un caratteristico aspetto torbido. Se il volume finale della coltura di espressione è considerato approssimativo, si raccomanda anche di pesare i palloni al momento del raccolto (con tara vuota adeguata) per ottenere un volume stimato migliore (a 1 g = 1 mL). Il diametro esterno massimo_{di 600 nm} possibile dalla crescita di L. tarentolae in fiasche deflette è 15-20, sebbene ciò non sia appropriato per la produzione di lisato a causa del raggiungimento della fase stazionaria.

2. Concentrazione delle colture di L. tarentolae

1. Le cellule della Leishmania devono essere lavate e concentrate circa 60 volte prima della disgregazione. Calcolare il volume target per la concentrazione cellulare in base a OD_600nm = 300 per il concentrato finale. L'equazione è V = volume del raccolto (mL) x (raccolto OD_600nm/300). Ad esempio, utilizzando una coltura da 2 L con un raccolto OD₆₀₀ = 5, il volume target è 33 mL.
   NOTA: L'obiettivo OD_600nm di 300 può essere modificato; la precedente produzione di LTE ha utilizzato valori compresi tra 150 e 350. Concentrazioni più elevate di cellule che vanno in disgregazione tenderanno a produrre reazioni finali di espressione libera da cellule con rese proteiche più elevate, ma con una maggiore tendenza delle proteine vulnerabili ad aggregarsi. OD_600nm = 300 rappresenta un obiettivo predefinito adatto per la produzione LTE.
2. Trasferire i fermenti raccolti in apposite bottiglie da centrifuga e centrifugarli a 2500 x g per 10 minuti a 4 °C. Decantare con cura il surnatante nei rifiuti di coltura.
   NOTA: È importante ridurre al minimo la perdita di cellule nel surnatante scartato, poiché influisce sul calcolo del carico di interruzione. Nei precedenti protocolli di produzione LTE, la concentrazione di cellule di L. tarentolae per l'interruzione è stata calibrata facendo girare il concentrato di cellule in una provetta per microcentrifuga di prova e misurando il peso del pellet rispetto al peso totale³⁴. Questo protocollo semplificato utilizza invece un target teorico di OD_{600 nm} per il concentrato, basato sul OD misurato del raccolto di_{600 nm}, e presuppone una bassa perdita cellulare durante la concentrazione e il lavaggio delle cellule.
3. Lavare il pellet cellulare in tampone SEB (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM di saccarosio, 100 mM di KOAc, 3 mM di Mg(OAc)₂, tenuto in ghiaccio) tre volte, centrifugando ogni volta a 2500 x g per 10 minuti a 4 °C. Per il primo lavaggio, risospendere ogni 1 litro di coltura pellettata in 100 ml di tampone SEB, quindi combinarli in un unico pallone da centrifuga. Per il secondo lavaggio, utilizzare anche 100 ml di SEB per ogni 1 litro di coltura originale.
   NOTA: Per la risospensione finale del pellet, aggiungere il tampone SEB al 50% del volume di risospensione target finale (passaggio 2.1). Ciò consente di rabboccare con cura il concentrato raggruppato fino al volume target finale nella fase 2.4. Ogni risospensione deve essere il più delicata possibile per evitare la lisi prematura di L. tarentolae, ad esempio, facendo roteare delicatamente il SEB aggiunto attorno al pellet decantato o pipettando il SEB sul pellet che aderisce alla parete della provetta della centrifuga. Potrebbe essere più conveniente trasferire i surnatanti in provette da centrifuga più piccole per la fase finale.
4. Versare il concentrato risospeso in un cilindro volumetrico di vetro lavato adatto, quindi rabboccare il volume fino al volume target (passaggio 2.1) utilizzando un ulteriore SEB freddo e mescolare delicatamente.

3. Lisi del concentrato di L. tarentolae

1. Trasferire il concentrato di cellule nel dispositivo di cavitazione dell'azoto (vedi Tabella dei materiali) preraffreddato a 4 °C, pressurizzarlo a 70 bar di azoto e incubare per 45 minuti su ghiaccio.
   NOTA: Sebbene gli interferenti per cavitazione da azoto non siano comuni articoli di laboratorio, sono consigliati per la produzione di LTE. Sono stati provati metodi alternativi come il congelamento-scongelamento cellulare e gli interferenti di tipo French-press; Tuttavia, l'attività di espressione proteica era del <50% rispetto all'utilizzo del metodo di cavitazione dell'azoto. Il dispositivo di cavitazione dell'azoto deve essere pulito accuratamente prima dell'uso e tra una corsa e l'altra, in modo simile a tutti i recipienti riutilizzati che entrano in contatto con il lisato cellulare da questa fase in poi (come il pallone ricevente). Un regime di pulizia adeguato prevede il lavaggio con detergenti da laboratorio seguito da un accurato risciacquo con acqua deionizzata.
2. Aprire lo sfiato del dispositivo di cavitazione dell'azoto ed espellere il lisato risultante in un contenitore adeguatamente robusto, come un pallone ricevitore a vuoto su ghiaccio. Inclinare il pallone del ricevitore per assicurarsi che tutto il lisato risultante si depositi e possa essere pipettato in una nuova provetta da centrifuga o in un recipiente simile.
   ATTENZIONE: Gli interferenti per cavitazione con azoto si basano sulla brusca transizione del concentrato di celle da 70 bar di azoto alla pressione ambiente, ottenuta attraverso un forte flusso di prima liquido e poi di azoto attraverso la valvola di uscita del dispositivo. Lo sfiato deve essere effettuato con adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) in una cappa di sicurezza chimica. C'è il rischio di rompere il recipiente di destinazione e di perdere il lisato, motivo per cui utilizziamo un robusto ricevitore del vuoto invece di un pallone generico. Se la valvola di uscita del dispositivo è un tubo, evitare di posizionare il tubo direttamente all'interno del ricevitore per evitare un eccessivo accumulo di pressione nel punto di sfiato.

4. Centrifugazione del lisato cellulare

1. Trasferire il lisato in provette da centrifuga con forza g adeguate e centrifugare a 10.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante in provette da centrifuga fresche e simili.
2. Centrifugare il lisato a 30.000 x g per 15 minuti a 4 °C, quindi rimuovere il surnatante finale in una nuova provetta da centrifuga o in un contenitore simile posto su ghiaccio. Stimare il volume totale.

5. Filtrazione su gel del lisato cellulare

NOTA: La filtrazione su gel viene utilizzata per rimuovere il saccarosio incluso nel tampone SEB. Mentre il saccarosio aiuta a stabilizzare il macchinario cellulare durante la disgregazione cellulare, diminuisce la resa se trattenuto nelle reazioni di espressione proteica.

1. Installare un numero sufficiente di colonne di filtrazione su gel alimentate a gravità PD-10 (vedere la Tabella dei materiali) in un formato rack che consenta loro di gocciolare in un vassoio di raccolta o in un contenitore simile sottostante, assicurando che possano filtrare l'intero volume del lisato a 2,5 ml per colonna. Pre-equilibrare le colonne facendo passare in anticipo 10 mL di tampone EB a 4 °C (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)₂).
   NOTA: Tutte le fasi da questo punto in poi traggono vantaggio dall'essere condotte in una cella frigorifera a 4 °C. Tuttavia, è adatto anche per conservare tutti i lisati e i reagenti su una vaschetta del ghiaccio da banco. Un'eccezione è la fase di filtrazione su gel, in cui gli autori posizionano un rack di colonne all'interno di un frigorifero a 4 °C durante il rebuffering. Nelle versioni originali di questo protocollo, le nuove colonne di filtrazione su gel venivano "bloccate" inizialmente tamponando il lisato e scartando il primo output. Sebbene ciò non sia ritenuto necessario, le colonne devono essere lavate con tampone EB e conservate a 4 °C tra i lotti di lisato. Il primo lisato di output può avere un'attività di espressione proteica inferiore rispetto agli output successivi a causa di una certa ritenzione di fondo dei componenti del lisato sulla nuova colonna.
2. Aggiungere 2,5 ml di lisato a ciascuna colonna e attendere che passi nella colonna. Aggiungere altri 0,5 mL di EB per depositare il lisato nella colonna mentre si scarta l'eluato.
3. Eluire il lisato filtrato in gel aggiungendo altri 2,5 ml di EB a ciascuna colonna, raccogliendo l'output posizionando un vassoio fresco e pulito o un altro recipiente sotto le colonne.

6. Integrazione di lisato cellulare

1. Utilizzare lo spettrofotometro nanodrop (vedere la tabella dei materiali) per misurare l'Abs_280nm del lisato filtrato in gel. Se supera i 60, diluirlo per raggiungere Abs_280nm = 60 utilizzando un ulteriore tampone EB a 4 °C.
   NOTA: Mentre il controllo dell'input della densità cellulare nella rottura utilizzando OD_600nm determina approssimativamente la forza di uscita del lisato, la normalizzazione dell'Abs_280nm dopo la rottura e l'elaborazione del lisato migliora ulteriormente la coerenza del batch delle prestazioni del lisato. Il lisato Abs_280nm può essere regolato su e giù, con conseguenze per la resa e l'aggregazione dell'espressione proteica (vedi sezione Discussione). Se il lisato non integrato indica un Abs_280nm < 60, potrebbe essere necessario includere più biomassa Leishmania nella fase di disgregazione, cioè aumentare il carico del disgregatore cellulare a_{OD 600nm} > 300 nel passaggio 2.1.
2. Aggiungere 5x Feeding Solution (5x FS, Tabella 1) al lisato in un rapporto 2:5 e mescolare accuratamente a vortice. Aliquotarlo in contenitori idonei (ad es. provette per microfuge da 1,5 mL) e congelarlo in azoto liquido. Se si seguono i passaggi facoltativi 7.1-7.3 per l'ottimizzazione delle espressioni LTE riportati di seguito, utilizzare il rNTP.Mg ridotto 5x FS della Tabella 1 invece del 5x FS predefinito. Includere 5 aliquote da 100 μl per il congelamento da utilizzare negli esperimenti di ottimizzazione.
   NOTA: Il congelamento con il 5x FS predefinito in un rapporto 2:5 crea LTE integrato pronto per l'espressione, utilizzato a 7 μL/10 μL di espressione (quindi, il 5x FS diventa 1x FS nella reazione finale). Tuttavia, gli autori raccomandano di seguire gli ulteriori passaggi opzionali in cui 0,6 volte la quantità predefinita di rNTP e magnesio è fornita nel 5x FS. Questo è seguito da una fase di ottimizzazione in cui viene aggiunta una miscela equimolare dei due (denominata rNTP.Mg) per completare le reazioni di prova a un valore ottimizzato. Il parziale 5x FS contiene anche un oligonucleotide che interrompe l'espressione endogena dell'mRNA (vedi sezione Introduzione). La sequenza dell'oligonucleotide è CAATAAAGTACAGAAACTGATACTTATATAGCGTT.

7. Controllo qualità e ottimizzazione dell'LTE integrato finale

NOTA: I passaggi minimi necessari per determinare l'appropriata aggiunta di rNTP.Mg al rNTP ridotto e al lisato integrato con magnesio prevedono l'espressione di eGFP o di un fluoroforo simile (ad esempio, sfGFP) senza un partner di fusione. Concentrazioni crescenti di rNTP.Mg vengono aggiunte alle reazioni per determinare il punto in cui il livello di espressione (misurato come eGFP RFU tramite un lettore di piastre multimodale) viene ottimizzato. Le terminazioni premature di eGFP, che non sono fluorescenti, diventano evidenti diminuendo l'RFU di eGFP a concentrazioni di rNTP.Mg troppo elevate. Tuttavia, i malfunzionamenti a corto prodotto di LTE si verificano più frequentemente nelle proteine espresse più grandi (>50 kDa). Pertanto, è possibile eseguire questa ottimizzazione utilizzando un modello più grande di eGFP, soprattutto se è disponibile in un vettore di espressione adatto, fornendo una fusione di fluorofori che si desidera venga prodotta da LTE per una particolare applicazione o studio (vedere la sezione Risultati rappresentativi).

1. Scongelare un'aliquota da 100 μL e impostare sei reazioni di espressione da 10 μL, ciascuna composta da 7 μL di lisato parzialmente integrato dalla fase 6.2, 1 μL di soluzione di rabbocco come da Tabella 2 e 2 μL di acqua ultrapura contenente una quantità sufficiente di DNA per raggiungere una concentrazione finale di 50 ng/μL nella reazione.
2. Incubare le reazioni per 2 ore a 25 °C e monitorare l'aumento della fluorescenza della GFP utilizzando un lettore di piastre multimodale.
   NOTA: I valori di configurazione adatti per GFP sono l'eccitazione a 485 nm (larghezza di banda 5 nm), l'emissione a 516 nm (larghezza di banda 5 nm), con un intervallo di lettura di 1 min per 2 ore.
3. Classificare i valori dell'espressione finale per determinare la concentrazione rNTP.Mg corrispondente alla RFU eGFP più alta. Se sono disponibili dati cinetici, un eccesso di rNTP.Mg sarà indicato anche da un aumento bifasico di eGFP RFU durante il periodo di espressione di 2 ore (vedere la sezione Risultati rappresentativi).
4. Una volta determinata la concentrazione di rNTP.Mg top-up ottimizzata, aggiungerla a tutte le ulteriori espressioni proteiche utilizzando il lotto di LTE che è stato parzialmente integrato nelle fasi precedenti.
   NOTA: Se l'aliquotazione al punto 6.2 viene eseguita con attenzione con volumi fissi, il rabbocco può essere aggiunto successivamente a ciascuna aliquota senza scongelamento, ad esempio con le aliquote poste su ghiaccio secco. Queste aliquote sono ora completamente integrate, poiché il rabbocco di rNTP.Mg corretto verrà miscelato attraverso ciascuna di esse quando vengono scongelate e miscelate per l'uso.

Risultati

Lo scopo dell'espressione proteica cell-free è quello di produrre proteine a lunghezza intera in una forma attiva ripiegata adatta a un'ampia gamma di applicazioni. L'LTE (Leishmania tarentolae extract) è stato precedentemente confrontato con altri sistemi di espressione liberi da cellule procariotiche ed eucariotiche, dimostrando un'elevata capacità di evitare il troncamento e l'aggregazione quando funziona in modo ottimale, in particolare rispetto all'espressione libera da cellule basata su E. coli ³³. Tuttavia, in precedenza ciò era accompagnato da una significativa variazione della qualità dell'output da lotto a lotto. Il metodo attuale incorpora ulteriori miglioramenti per garantire una qualità di produzione costante, principalmente attraverso l'integrazione parziale della soluzione di alimentazione necessaria prima del congelamento iniziale dell'LTE in aliquote. Segue l'ottimizzazione delle rNTP.Mg di input trascrizionali in una soluzione di top-up che può essere aggiunta ad ogni reazione successiva o utilizzata per completare direttamente le aliquote congelate. È interessante notare che le reazioni di ottimizzazione rappresentano anche l'uso tipico dell'LTE per esprimere praticamente le proteine, con reazioni effettuate a 25 °C per 2 ore.

I dati derivanti dall'ottimizzazione della concentrazione di rNTP.Mg nelle reazioni libere da cellule forniscono un set di dati rappresentativo. I livelli di espressione in genere aumentano all'aumentare dell'input trascrizionale (rNTP.Mg), indicando un'espressione riuscita. Tuttavia, viene raggiunta una soglia in cui il sistema tende verso l'espressione non produttiva di prodotti troncati, in particolare nel caso di proteine più grandi (>50 kDa). Questa espressione non ottimale porta ad una perdita del segnale di fluorescenza con l'aumentare della rNTP.Mg, particolarmente evidente con le fusioni di fluorofori C-terminali, dove la traduzione del polipeptide non raggiunge il fluoroforo stesso. Per le fusioni N-terminali, mentre una riduzione delle RFU (Unità di Fluorescenza Relativa) complessive non si verifica necessariamente con un eccesso di rNTP.Mg, l'espressione fallita è visibilmente evidente sui gel SDS-PAGE come prodotti fluorescenti multipli di dimensioni decrescenti. Questo approccio sfrutta la capacità della GFP (Green Fluorescent Protein) di mantenere la fluorescenza anche quando visualizzata su un gel SDS-PAGE convenzionale, a condizione che i campioni non vengano riscaldati dopo la miscelazione. Invece, vengono miscelati con il tampone di caricamento del gel e caricati direttamente sul gel. Mentre i materiali e le apparecchiature in gel SDS-PAGE sono generalmente intercambiabili, l'imager per gel deve essere in grado di visualizzare la fluorescenza GFP. Una configurazione tipica per la visualizzazione GFP è fornita con eccitazione a 485 nm (larghezza di banda 5 nm), emissione a 516 nm (larghezza di banda 5 nm) e un intervallo di lettura di 1 minuto su 2 ore.

È possibile ottimizzare il sistema utilizzando la sola espressione di eGFP. Le Figure 2A, B (riquadro) illustrano gli output di espressione tipici delle reazioni di ottimizzazione per due lotti LTE, con RFU eGFP che aumenta con l'aumentare delle concentrazioni di rNTP.Mg, raggiungendo un livello ottimale di +0,6 volte rNTP.Mg (Figura 2A) e +0,3 volte rNTP.Mg (Figura 2B) per la massima RFU. La soluzione di alimentazione rNTP ridotta include 0,6 volte rNTP.Mg, per un totale di livelli di rNTP.Mg di 1,2 volte e 0,9 volte la quantità predefinita per questi batch LTE. La Figura 2C illustra la cinetica dell'aumento delle RFU durante la reazione per il lotto LTE nella Figura 2B, dimostrando una reazione bifasica con due fasi discrete per tutta la durata della reazione.

Figura 2: Ottimizzazione dell'aggiunta di top-up di rNTP.Mg in LTE con rNTP ridotto 5x FS. (A) Livelli di espressione di eGFP dopo 140 minuti di espressione da un plasmide di controllo a livelli di top-up variabili di rNTP.Mg nella reazione di espressione libera da cellule (n = 3, media ± SD tracciata). (B) Ottimizzazione di un diverso lotto di produzione LTE, che mostra un'espressione ridotta oltre una certa soglia di rNTP.Mg. (C) Cinetica dell'accumulo di eGFP nelle stesse reazioni di (B), con aumento del rNTP.Mg rabbocco. Questi dati rappresentano anche la cinetica tipica dell'accumulo di proteine nell'espressione batch di LTE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tuttavia, va notato che l'eGFP, essendo una piccola proteina (27 kDa) facile da ripiegare, è probabile che venga espressa, ripiegata e maturata indipendentemente dal sistema di espressione libero da cellule utilizzato. Il fallimento del sistema è più probabile quando si esprimono proteine di interesse più grandi, con prodotti troncati che diventano più evidenti a dimensioni superiori a 70 kDa³³. Pertanto, l'ottimizzazione del sistema con la/e proteina/e destinata/e all'uso effettivo è superiore, con l'eGFP ancora presente per la quantificazione ma come fusione N-terminale con la proteina di interesse.

La Figura 3 rappresenta una tipica ottimizzazione del livello di top-up rNTP.Mg quando si utilizza un modello proteico più grande incline a fornire prodotti troncati (eGFP-Sox18). Utilizzando un formato semi-nativo su gel SDS-PAGE (cioè senza riscaldamento dei campioni), è possibile visualizzare il progressivo fallimento dell'espressione. L'aggiunta ottimale di rNTP.Mg a +0,1x (combinata con la rNTP.Mg 0,6x nella soluzione di alimentazione parziale, per un totale di 0,7x) riduce chiaramente la frazione della banda proteica a lunghezza intera come parte dei prodotti di espressione fluorescenti totali, indicando un fallimento del sistema con un'aggiunta di rNTP.Mg eccessiva.

Come menzionato nel protocollo, è possibile saltare la fase di ottimizzazione della rNTP.Mg e aggiungere direttamente l'intera quantità di rNTP.Mg nella soluzione di alimentazione "predefinita" durante l'integrazione subito dopo la filtrazione del gel nella fase 6.2. In questo modo, il protocollo ripristina essenzialmente i metodi originali pubblicati per la creazione di LTE³⁴. Tuttavia, gli autori ritengono che la personalizzazione del sistema per prestazioni ottimali, come dimostrato nella Figura 3 (da corsia D a corsia E), superi la complessità aggiuntiva del protocollo e aumenti il valore dell'LTE come strumento di espressione proteica.

Figura 3: Effetto dell'aumento del top-up di rNTP.Mg sull'espressione di eGFP-Sox18 in LTE parzialmente integrato. Gel SDS-PAGE semi-nativo che descrive l'impatto dell'aumento del top-up di rNTP.Mg sull'espressione di eGFP-Sox18. Corsia A: +0,1x (rNTP.Mg) ricarica, Corsia B: +0,2x (rNTP.Mg), Corsia C: +0,3x (rNTP.Mg), Corsia D: +0,4x (rNTP.Mg). La fusione N-terminale di eGFP viene visualizzata mediante scansione a fluorescenza del gel. La banda principale nella corsia A rappresenta l'intera eGFP-Sox18. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Componente	Concentrazione delle scorte	5x soluzione di alimentazione	μL di materiale di partenza/mL 5x Soluzione di alimentazione
		Predefinito (rNTP ridotto)	Predefinito (rNTP ridotto)
Spermidina	100 mM	1,25 mM	12
DTT	500 mM	10 mM	20
Creatina Fosfato	1000 mM	200 mM	200
HEPES-KOH pH7.6	2500 mM	100 mM	40
PEG3000	0,5 V/V	0,05 V/V	100
Cocktail di inibitori della proteasi	120 volte	5 volte	43
Aminoacidi	3,6 mM (ea)	0,68 mM (cada)	190
ATP	100 mM	8,5 (5,1) mM	85 (51)
GTP	100 mM	3,2 (1,9) mM	32 (19)
UTP	100 mM	2,5 (1,5) mM	25 (15)
Programmazione	100 mM	2,5 (1,5) mM	25 (15)
Mg(OAc)2	1 milione	16,7 (10) mM	16,7 (10)
Oligo leader anti-splicing	1 milione	0,05 mM	50
T7 RNA polimerasi	5 mg/mL	0,5 mg/mL	100
Creatina Fosfochinasi	5 unità/μL	0,2 unità/μl	42
Acqua ultrapura			19 (93)

Tabella 1: Composizione di 5x soluzione di alimentazione (5x FS) per LTE. È necessario 1 mL di 5x FS per ogni 2,5 mL di lisato non integrato dopo la filtrazione su gel. L'integrazione con il 5x FS predefinito crea un LTE pronto per l'espressione da utilizzare nelle reazioni di espressione con un rapporto di 7 μL/10 μL. La ricetta rNTP.Mg ridotta (quantità in corsivo) è consigliata per l'ottimizzazione dell'espressione LTE e contiene 0,6 volte i livelli predefiniti di rNTP e magnesio. Questi possono essere regolati a livelli variabili (da 0,6 a 1,1 volte) nel successivo esperimento di ottimizzazione utilizzando le aggiunte descritte nella Tabella 2.

Ricarica rNTP	ATP (100 mM)	GTP (100 mM)	UTP (100 mM)	CTP (100 mM)	MgOAc (1 M)	Acqua ultrapura
(1 μL/10 μL rxn)	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL
+0x	0	0	0	0	0	200
Pagine +0,1x	3.4	1.3	1	1	0.7	193
Pagine +0,2x	6.8	2.5	2	2	1.3	185
Pagine +0,3x	10.2	3.8	3	3	2	178
Cifre +0,4x	13.6	5.1	4	4	2.7	171
Pagine +0,5x	17	6.4	5	5	3.3	163

Tabella 2: Composizione di (rNTP.Mg) soluzioni di ricarica per l'ottimizzazione LTE. Queste soluzioni vengono utilizzate per ottimizzare l'LTE aggiungendo 1 μL di soluzione di rabbocco per 10 μL di reazione di espressione proteica. Una volta determinato un livello di rabbocco nell'esperimento di ottimizzazione, può essere aggiunto in modo coerente a tutte le successive reazioni di espressione proteica utilizzando le stesse aliquote batch LTE. In alternativa, può essere aggiunto direttamente alle aliquote stesse con un'aggiunta di 1 μl per 7 μl (senza scongelamento). Dopo lo scongelamento e la miscelazione, questi lisati vengono utilizzati a 8 μL di LTE per 10 μL di espressione proteica, mantenendo il livello di topup rNTP.Mg stabilito durante l'ottimizzazione.

Discussione

I protocolli per la creazione di LTE sono stati pubblicati nell'ultimo decennio⁷ e sono stati sottoposti ad aggiornamenti periodici^25,34. Tuttavia, i neofiti della tecnica incontrano spesso una curva di apprendimento ripida, con conseguenti ritardi nel raggiungimento di un'espressione proteica di alta qualità e ad alto rendimento. Sfide simili sono state segnalate da altri gruppi di ricerca che lavorano con LTE³⁵, in particolare per quanto riguarda le variazioni significative da lotto a lotto. Il formato del protocollo basato su video può potenzialmente fornire ulteriori conoscenze di configurazione meno ovvie a vantaggio dei potenziali utenti³⁴. Sono state introdotte modifiche al protocollo, con l'obiettivo di aumentare le probabilità di successo, semplificare la procedura, ridurre i tempi e minimizzare gli errori legati alla complessità.

Nella disgregazione cellulare, è fondamentale un controllo preciso sul caricamento delle cellule nel disgregatore cellulare di cavitazione dell'azoto³⁴. Raggiungere questo obiettivo può essere difficile a causa dell'elevata densità cellulare dopo la concentrazione e il lavaggio delle cellule. Nei protocolli originali sono stati utilizzati vari metodi, come la centrifugazione di un piccolo volume della coltura concentrata finale e la quantificazione del pellet di cellule frazionate. Tuttavia, in questo protocollo, viene adottato un approccio più semplice. Vengono misurati il volume di raccolta della coltura e l'OD_{600 nm} e queste misurazioni vengono utilizzate per calcolare un volume target per il concentrato cellulare in millilitri, con l'obiettivo di ottenere un OD finale desiderato di_{600 nm} di 300. Questo calcolo presuppone che non si verifichi alcuna perdita cellulare significativa durante il lavaggio. Se si sospetta una perdita cellulare, viene impiegato un metodo alternativo che prevede diluizioni seriali triplicate 1/10 delle cellule concentrate dopo il lavaggio, con conseguente diluizione di 1/1000. Ciò consente di misurare il diametro esterno effettivo del concentrato di_{600 nm}, assicurandosi che raggiunga il diametro esterno target di_{600 nm} = 300 prima di caricarlo nel disgregatore.

Anche con un attento controllo del carico di disgregatori cellulari, può verificarsi una significativa variabilità nel contenuto proteico del lisato post-interruzione, come indicato dall'Abs_280nm del lisato³⁴ non integrato filtrato su gel. Pertanto, viene introdotta una misurazione di Abs_280nm prima dell'integrazione di lisato e il lisato viene diluito per ottenere un Abs_280nm = 60. Poiché le reazioni di espressione proteica alla fine includono il lisato 0,5 v/v, ciò si traduce in un lisato di reazione standardizzato con Abs_280nm = 30. Le prestazioni del lisato configurate con un valore inferiore a_{280 nm} = 30 tendono a produrre reazioni di lunga durata e a bassa espressione, mentre valori superiori a_{280 nm} = 30 tendono a produrre un'espressione più elevata ma una maggiore tendenza all'aggregazione proteica in uscita.

L'ottimizzazione delle prestazioni del lisato comporta la regolazione degli input trascrizionali nella soluzione di alimentazione che integra il lisato, in particolare rNTP e magnesio, nelle fasi di reazione opzionali 7.0-7.3. È importante notare che gli rNTP e il magnesio hanno ruoli complessi e multipli in un sistema accoppiato di trascrizione-traduzione come LTE²⁵. Tuttavia, è stato dimostrato che l'LTE ha un'espressione di magnesio ottimale approssimativa a rNTP (mM) + 1,5. Poiché il lisato stesso contribuisce con 1,5 mM di Mg alla miscela di reazione finale, questo fornisce un modo semplice per variare e ottimizzare l'input di rNTP senza co-ottimizzare il Mg variando la rNTP.Mg equimolare.

Le prestazioni del lisato mostrano variazioni significative quando si aumenta l'rNTP.Mg, con l'espressione proteica generalmente in aumento fino a una soglia in cui l'ottimizzazione si inverte, con conseguenti malfunzionamenti dell'espressione sotto forma di prodotti corti invece di proteine a lunghezza intera²⁵. Pertanto, l'ottimizzazione finale del sistema per identificare questa soglia è vantaggiosa. Il protocollo LTE originale utilizzava una ricetta di soluzione di alimentazione fissa, con un'ottimizzazione di Mg suggerita³⁴. Questo approccio è stato successivamente modificato con un'ottimizzazione rNTP più estesa. Tuttavia, questo metodo richiedeva il congelamento a scatto del lisato in forma non integrata per consentire l'ottimizzazione su un'aliquota, che tendeva a diminuire i livelli di espressione del lisato. Questa riduzione è stata attribuita alla perdita delle proprietà crioprotettive della soluzione di alimentazione durante il congelamento a scatto del lisato non integrato immediatamente dopo la fase di filtrazione del gel. L'attuale protocollo raggiunge un equilibrio integrando con una soluzione alimentare contenente rNTP.Mg ridotto prima del congelamento, che può essere rabboccata fino al livello ottimizzato nel punto di espressione.

Si prevede che questi miglioramenti del protocollo aumenteranno l'utilità del sistema LTE per gli utenti inesperti, mitigando le fonti primarie di variazione e migliorando la coerenza dell'output dell'espressione proteica.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
PD-10 SuperDex 25 colonne	Cytiva		17085101 Colonne di filtrazione su gel
Disgregatore cellulare per cavitazione ad azoto	Parr Industries	4635 o 4639	Disgregatore cellulare
Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Additivo per colture
Penicillina/Streptomicina 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	Miscela
di antibioticiOptiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Piastra multipozzetto per espressioni 10ul
	di IDT	oligonucleotidi	. Oligo con sequenza CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Creatina Fosfochinasi	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzima
Tecan Spark	Tecan		o simile Platereader multimodale
Chemidoc MP Imager	Biorad		o simile SDS-PAGE gel Imager
4-12% Bis-Tris Gels	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE gels
Biofotometro	Eppendorf		o similare Spettrofotometro per cuvette
Nanodrop One	Thermofisher		Spettrofotometro Nanodrop
Centrifuga Avanti JXN-26	Beckman Coulter		o simile, con rotori/provette da 10K e 50K g
Microcentrifuga 5424R	Eppendorf		o similare, con provette
per microcentrifuga da 1,5 mlIncubatore per palloni Inova S44i	Eppendorf		o agitatore per incubatrice per fiasche da 5 litri Palloni di
coltura in vetro da 5 litri	Palloni di vetro
Bactotriptone	BD	211705	Terreno di crescita
Estratto di lievito	Merck	VM930053	Terreno di crescita
Glicerolo			Qualsiasi grado analitico
Glucosio			Qualsiasi grado analitico
KH2PO4			Qualsiasi grado analitico
K2HPO4			Qualsiasi grado analitico
ultrapura	Invitrogen	10977-015	O uscita da qualsiasi erogatore d'acqua di tipo MilliQ