Qui, presentiamo un metodo robusto per la perfusione in situ del fegato di topo per studiare la regolazione acuta e diretta del metabolismo epatico senza disturbare l'architettura epatica ma in assenza di fattori extra-epatici.
Articolo metodologico
Qui, presentiamo un metodo robusto per la perfusione in situ del fegato di topo per studiare la regolazione acuta e diretta del metabolismo epatico senza disturbare l'architettura epatica ma in assenza di fattori extra-epatici.
Il fegato ha numerose funzioni, tra cui il metabolismo dei nutrienti. A differenza di altri modelli di ricerca epatica in vitro e in vivo, il fegato perfuso isolato consente lo studio della biologia e del metabolismo epatico in tutto il fegato con un'architettura epatica intatta, separata dall'influenza di fattori extra-epatici. Le perfusioni epatiche sono state originariamente sviluppate per i ratti, ma il metodo è stato adattato anche ai topi. Qui descriviamo un protocollo per la perfusione in situ del fegato di topo. Il fegato viene perfuso anterogradamente attraverso la vena porta con tampone bicarbonato di Krebs-Henseleit ossigenato e l'output viene raccolto dalla vena cava inferiore sopraepatica con clampaggio della vena cava inferiore infraepatica per chiudere il circuito. Utilizzando questo metodo, gli effetti epatici diretti di un composto in esame possono essere valutati con una risoluzione temporale dettagliata. La funzionalità epatica e la vitalità sono stabili per almeno 3 ore, consentendo l'inclusione di controlli interni nello stesso esperimento. Le possibilità sperimentali che utilizzano questo modello sono numerose e possono dedurre informazioni sulla fisiologia epatica e sulle malattie del fegato.
Il fegato è un organo essenziale nel metabolismo. Svolge un ruolo chiave nel controllo dell'equilibrio energetico di tutto il corpo regolando il metabolismo di glucosio, lipidi e aminoacidi. L'aumento delle malattie del fegato in tutto il mondo sta emergendo come un importante onere per la salute globale e sono necessarie maggiori conoscenze sulla fisiopatologia e sulle sue conseguenze per le funzioni epatiche.
Sono stati sviluppati vari modelli in vitro per la ricerca sul fegato a complemento degli studi in vivo. Gli epatociti primari isolati e coltivati da roditori ed esseri umani sono ampiamente utilizzati. Le cellule n....
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Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti con il permesso dell'Ispettorato danese per gli esperimenti sugli animali, del Ministero dell'Ambiente e dell'Alimentazione della Danimarca (permesso 2018-15-0201-01397) e del comitato etico locale in conformità con la direttiva UE 2010/63/UE, del National Institutes of Health (pubblicazione n. 85-3) e seguendo le linee guida della legislazione danese che disciplina la sperimentazione animale (1987). Questa è una procedura terminale e la causa della morte è il dissanguamento e la perforazione del diaframma in anestesia profonda.
1. Animali da esperimento
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È necessaria una linea di base costante per determinare se uno stimolo o un substrato porta al rilascio della molecola di interesse. La Figura 3A mostra un esempio di esperimento riuscito. La produzione di urea nel fegato perfuso viene misurata a intervalli di 2 minuti e indicata come media ± SEM. I periodi basali che precedono ciascuno dei due periodi di stimolazione sono costanti. La produzione media di urea durante i due periodi di stimolazione e le rispet.......
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Il fegato di topo perfuso isolato è un forte strumento di ricerca per lo studio delle dinamiche e dei meccanismi molecolari del metabolismo epatico. La possibilità di prelevare campioni minuto per minuto fornisce una valutazione dettagliata dell'effetto diretto di un composto in esame sul fegato. Rispetto agli studi in vivo, il fegato perfuso permette di studiare il metabolismo epatico in maniera isolata evitando fattori extra-epatici veicolati dal sangue e con un controllo completo sulle condizioni sperimentali.......
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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse relativi a questo articolo.
Gli studi e Nicolai J. Wewer Albrechtsen sono stati supportati dalla Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant - Endocrinology and Metabolism (Application No. NNF19OC0055001), European Foundation for the Study of Diabetes Future Leader Award (NNF21SA0072746) e Independent Research Fund Denmark, Sapere Aude (1052-00003B). Il Centro per la ricerca sulle proteine della Fondazione Novo Nordisk è sostenuto finanziariamente dalla Fondazione Novo Nordisk (accordo di sovvenzione NNF14CC0001). La Figura 1B è stata creata con biorender.com. Ringraziamo il Dr. Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) per le fruttuose discussioni sul fegato di topo perfuso.
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Rubinetto a 3 vie | BD | 394601 | |
| Dieta per l'allevamento Altromin | Spezialfutter | 1319 | |
| Cloruro di calcio diidrato (CaCl2· Cateteri 2H2O) | Sigma | C8106 | |
| (0,7 mm) | BD | 381812 | |
| Carta da filtro (dimensione dei pori 2,0 µ m) | Millipore | AP2029325 | |
| Kit glucosio | QuantiChromTM | DIGL-100 | Protocollo a bassa concentrazione |
| Ketamina | MSD Animal Health | 511485 | 90 mg/kg |
| Legatura (seta sterile nera) | Agnthos | 14739 | |
| Solfato di magnesio (MgSO4) | Sigma | 230391 | |
| Grasso non esterificato kit acidi | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| Tavolo operatorio, riscaldato su treppiede, tipo 873 | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Cloruro di potassio (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Diidrogeno fosfato di potassio (KH2PO4) | Merck | 1.04877 | |
| Pompa a rulli, con quattro canali | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Nastro adesivo Mediq | danmark | 4001910 | |
| Bicarbonato di sodio (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Sigma | S1679 | |
| Circolatore termostatico | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | Volume vasca 3 L, 230 V/50 Hz |
| Tubo | Tygon | E3603 | Diametro interno 1,59 mm, diametro esterno 3,18 mm |
| Sistema di perfusione universale | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | Unità di base uniper UP-100, tipo 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | Aminoacidi misti |
| Adattatore per morsetto per vasi | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| Morsetti per vasi | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | ||
| Xilazina | Rompun Vet | 530701 | 10 mg/kg |
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