Applicazione dell'analisi citofluorimetrica per la misurazione di parametri mitocondriali multipli in organoidi cerebrali 3D

Sommario

Questo protocollo riporta un metodo unico di utilizzo di un citometro a flusso e di più anticorpi per la valutazione simultanea di più parametri funzionali mitocondriali, tra cui le variazioni del volume mitocondriale, la quantità delle subunità del complesso della catena respiratoria mitocondriale (MRC) e la replicazione del DNA mitocondriale (mtDNA).

Abstract

La disfunzione mitocondriale è un fattore primario o secondario comune a molti tipi di neurodegenerazione e le variazioni della massa mitocondriale, dei complessi della catena respiratoria mitocondriale (MRC) e del numero di copie del DNA mitocondriale (mtDNA) sono spesso presenti in questi processi. Gli organoidi cerebrali umani derivati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) umane ricapitolano la disposizione citoarchitettonica tridimensionale (3D) del cervello e offrono la possibilità di studiare i meccanismi della malattia e di esaminare nuove terapie in un sistema umano complesso. Qui, riportiamo un approccio unico basato sulla citometria a flusso per misurare più parametri mitocondriali in organoidi corticali derivati da iPSC. Questo rapporto descrive in dettaglio un protocollo per la generazione di organoidi cerebrali corticali da iPSC, la dissociazione a singola cellula degli organoidi generati, la fissazione, la colorazione e la successiva analisi citofluorimetrica per valutare più parametri mitocondriali. La doppia colorazione con anticorpi contro la subunità del complesso MRC NADH: subunità B10 dell'ubichinone ossidoreduttasi (NDUFB10) o fattore di trascrizione mitocondriale A (TFAM) insieme al canale 1 anio-selettivo voltaggio-dipendente (VDAC 1) consente di valutare la quantità di queste proteine per mitocondrio. Poiché la quantità di TFAM corrisponde alla quantità di mtDNA, fornisce una stima indiretta del numero di copie di mtDNA per contenuto mitocondriale. L'intera procedura può essere completata nell'arco di 2-3 ore. Fondamentalmente, consente la quantificazione simultanea di più parametri mitocondriali, inclusi i livelli totali e specifici relativi alla massa mitocondriale.

Introduzione

I mitocondri sono organelli cellulari essenziali e il sito principale della produzione di adenosina trifosfato (ATP). Oltre a fornire energia alle cellule, i mitocondri partecipano anche a molteplici processi cellulari, tra cui la trasmissione di informazioni cellulari, la differenziazione cellulare e l'apoptosi, e hanno la capacità di regolare la crescita cellulare e il ciclo cellulare. Cambiamenti nella funzione mitocondriale sono stati identificati in varie malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD)^1,2, il morbo di Alzheimer (AD)³....

Protocollo

1. Differenziazione delle iPSC in organoidi corticali

1. Preparazione di lastre rivestite a matrice
   1. Scongelare la fiala della matrice della membrana basale disponibile in commercio su ghiaccio durante la notte. Diluire in 1:100 a freddo Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12 (concentrazione finale 1%). Fare aliquote e conservarle a -20 °C (vedi Tabella dei materiali).
   2. Scongelare la soluzione della matrice di membrana a 4 °C (mantenerla fredda) e rivestire il numero richiesto di pozzetti (1 mL per un pozzetto in una piastra a 6 pozzetti). Incubare a....

Risultati

La Figura 1 fornisce una rappresentazione schematica del processo di differenziamento e delle strategie utilizzate per l'analisi citofluorimetrica. Le iPSC umane sono state coltivate in piastre a 96 pozzetti non aderenti per formare EB e poi trasferite in piastre a 6 pozzetti non aderenti per ottenere organoidi corticali completamente cresciuti. La composizione cellulare degli organoidi è stata convalidata utilizzando la microscopia confocale dopo immunocolorazione con i marcatori neuronali<.......

Discussione

Viene presentato un protocollo per la generazione di organoidi cerebrali corticali da iPSC umane e per l'esecuzione dell'analisi citofluorimetrica dei parametri mitocondriali in singole cellule isolate da questi organoidi. La composizione cellulare degli organoidi è stata verificata mediante microscopia confocale con colorazione immunoistochimica per marcatori cellulari neuronali e gliali. È stato dimostrato che la strategia di co-colorazione basata sulla citometria a flusso con anti-NDU.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpi che utilizzano la citometria
anti-DUFB10 Alexa Fluor 405	NOVUS biologici	NBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647	Tecnologia Santa cruz	sc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308
Kit di colorazione per cellule morte nel vicino infrarosso fissabile L/D	Life technologies	L10119
Anticorpi che utilizzano nella colorazione in
anti-Tuj1	Abcam	ab78078
anti-SOX2	Abcam	ab97959
Farina anti-Alexa 488	Thermo Fisher Scientific	A28175
Farina anti-Alexa 594	Thermo Fisher Scientific	A-21442
Celle commerciali
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)			Fornito da Gareth John Sullivan dell'Istituto di Scienze Mediche di Base presso il Università di Oslo, Norvegia
Essential 8 Medium (terreno di coltura iPSC)
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901
Essential 8 Integratore (50x) 2% (v/v)	Thermo Fisher Scientific	A1517101
Negozio a 4 gradi C e riscaldare a RT prima dell'uso.
Instruments
Incubatori a CO2 Heracell 150i Fisher	Scientific, USA
Agitatori orbitali - SSM1, SSL1	Stuart Equipment, UK
CCD Microscopio Fotocamera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germania
Bagno d'acqua Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Strumenti	Grant Instruments, USA
Sistema di aspirazione dei fluidi Controllo BVC	Vacuubrand, Germania
Leica TCS SP8 STED microscopio confocale	Leica Microsystems, Germania
Provetta di falco da 50 mL	Sigma-Aldrich	CLS430828
BD LSR Fortessa	BD Biosciences, USA
Flowjo Sampler Analysis	FlowJo LLC, USA
pipetta da 10 mL	Sigma-Aldrich	SIAL1100
pipetta da 1, 10, 100, 1000 mL	Sigma-Aldrich
40 µ m Cell stariner	Sigma-Aldrich	CLS431750
ultra-basso piastra a 96 pozzetti	S-BIO	MS-9096UZ
Contatore di cellule automatizzato Countess II	Thermo Fisher Scientific
Neural differentiation medium  (NDM+)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Neurobasal medium	Life technologies	2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
N2 supplement 0,5% (v/v)	Life technologies	17502-048
B27 supplement 1% (v/v)	Life tecnologie	17504-044
β-mercaptoetanolo 50 µ M	Sigma-aldrich	M3148
BDNF 20 ng/mL	Peprotech	450-02
Acido ascorbico 200 µ M	Sigma-Aldrich	A92902
Negozio a 4 gradi C per un massimo di 2 settimane
Mezzo di differenziazione neurale meno viatmin A (NDM-)
DMEM/F12	Tecnologie di vita	11330032
Mezzo neurobasale	Tecnologie di vita	2110349
Integratore di Glutamax 1% (v/v)	Integratore di Life technologies	35050
N2 0,5% (v/ v)	Life technologies	17502-048
Supplemento B27 W/O vit. A 1% (v/v)	Life technologies	12587010
β-Mercaptoetanolo 50 &; M	Sigma-aldrich	M3148
Negozio a 4 gradi C per un massimo di 8 giorni
Mezzo di induzione neurale (NIM)
DMEM/F12	Tecnologie di vita	11330032
Sostituzione del siero knockout 15% (v/v)	Tecnologie di vita	10828028
Integratore di Glutamax 1% (v/v)	Tecnologie di vita	35050
β- Mercaptoetanolo 100 &; M	Sigma-Aldrich	M3148
LDN-193189 100 nM	Stelo/Reprocell	04-0074
SB431542 10 µ M	Tocris	1614
XAV939 2 µ M	Sigma-Aldrich	X3004
Negozio a 4 gradi C per un massimo di 10 giorni
Neutralizzazione media
IMDM	Tecnologie di vita	21980032
FBS 10%	Sigma-Aldrich	12103C
Altri reagenti
DPBS (senza Ca2+/Mg2+)	Thermo Fisher Scientific	14190250
Siero bovino, Albumina	Europa Bioproducts	, EQBAH62-1000
Accutase	Life, tecnologie	A11105-01
Geltrex	Life,	A1413302
EDTA	, Life 15575038
DMEM / F12	avanzato, 12634010
Tessuto neurale kit di dissociazione	Miltenyi biotec	130-092-628
Y-27632 dicloridrato Inibitore della roccia	Biotechne Tocris	1254
Fluoromount-G™ Supporto di montaggio	SouthernBiotech	0100-20
PFA	Thermo Fisher Scientific	28908

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