Articolo metodologico

Miglioramento dell'affidabilità della biobanca dei tumori alla prostata con una migliore tecnica di campionamento e caratterizzazione istologica

DOI:

10.3791/65635

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17 novembre 2023

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1Department of Pathology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 2Department of Urology, Hospital Universitario y Politécnico La Fe, 3Biobanco La Fe, Instituto de Investigación Sanitaria La Fe, 4Department of Medicine, Jaume I University of Castellon, 5Department of Surgery, University of Valencia, 6Department of Pathology, University of Valencia

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo descrive un metodo per facilitare la raccolta di campioni da campioni di prostatectomia radicale. L'obiettivo è quello di mappare, caratterizzare e sezionare con micro-macro campioni di tessuto dai campioni in base a criteri anatomopatologici prima di conservarli in una biobanca.

Abstract

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L'acquisizione di campioni di tessuto tumorale freschi e ben caratterizzati è fondamentale per condurre studi "omici" di alta qualità. Tuttavia, può essere particolarmente impegnativo nel contesto del cancro alla prostata (PC) a causa della natura unica di questo organo e dell'elevata eterogeneità associata a questo tumore. D'altra parte, anche caratterizzare istopatologicamente i campioni prima della loro conservazione senza causare alterazioni tissutali significative è una sfida intrigante. In questo contesto, presentiamo un nuovo metodo per l'acquisizione, la mappatura, la caratterizzazione e la micro-dissezione del tessuto prostatico resecato basato su criteri anatomopatologici.

A differenza dei protocolli pubblicati in precedenza, questo metodo riduce il tempo necessario per l'analisi istopatologica del campione prostatico senza comprometterne la struttura, che è fondamentale per la valutazione dei margini chirurgici. Inoltre, consente la delineazione e la dissezione micro-macro di campioni di tessuto prostatico fresco, con particolare attenzione alle aree tumorali istologiche definite da criteri patologici come il punteggio di Gleason, le lesioni precursori (neoplasia intraepiteliale prostatica di alto grado - PIN) e le lesioni infiammatorie (prostatite). Questi campioni vengono poi conservati in una Biobanca per successive analisi di ricerca.

Introduzione

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Il cancro alla prostata (PC) è il 2° tumore più frequente negli uomini e la 5° causa di morte in tutto il mondo1. Il trattamento e la prognosi del paziente dipendono dalla stadiazione e dal grado (punteggio di Gleason) del tumore, come evidenziato dai tassi di sopravvivenza a 5 anni più elevati dei tumori localizzati e di basso grado (grado 6 di Gleason) (99%) rispetto ai tumori di Gleason di alto grado e metastatici (31%)2.

La recidiva locale di PC e il fallimento del trattamento sono stati collegati alla caratteristica elevata eterogeneità genetica intratumorale di questo tumore di tipo3. Inoltre, la PC è considerata una malattia multifocale con diversi focolai tumorali che presentano diverse caratteristiche morfologiche, istologiche e molecolari4, che possono originare indipendentemente o derivare da un antenato comune delle cellule tumorali5. Studi precedenti hanno dimostrato che l'evoluzione del tumore differisce tra i pazienti in base a specifici driver genetici che possono promuovere metastasi o confinare la linea cellulare alla prostata5. Pertanto, la caratterizzazione molecolare dei diversi focolai tumorali è fondamentale non solo per fornire una diagnosi e una prognosi più accurate, ma anche per personalizzare un trattamento efficace e personalizzato per il paziente.

In questo contesto, la ricerca biomedica e gli approcci multi-omici integrativi stanno offrendo opportunità senza precedenti per classificare i tumori in diversi sottotipi, identificare biomarcatori diagnostici e prognostici e scoprire marcatori correlati alla risposta al trattamento. Inoltre, questi approcci contribuiscono a una migliore comprensione della biologia di questa malattia 6,7. I campioni biologici, siano essi tessuti o biofluidi, possono essere analizzati utilizzando varie piattaforme multi-omiche (genomica, trascrittomica, proteomica, metabolomica, ecc.) per scoprire le caratteristiche biologiche alla base della fisiopatologia del cancro, affrontando così le attuali limitazioni legate all'eterogeneità genetica e fenotipica6. Tuttavia, è importante considerare che la qualità dei dati derivati dagli studi omici dipende dalla qualità dei campioni raccolti dai tumori, dalla loro accurata caratterizzazione e dalla successiva elaborazione e conservazione8.

In questo contesto, l'ottenimento di tessuto PC fresco per la ricerca presenta una sfida metodologica a causa della difficoltà di successo del campionamento del tumore9. I metodi precedenti prevedevano il campionamento casuale dopo la prostatectomia radicale, producendo scarsi risultati10. Tuttavia, gli approcci più recenti incorporano protocolli mirati basati sia sulla risonanza magnetica (MRI) che sui dati della biopsia, con conseguente miglioramento dell'efficacia nella raccolta di campioni tumorali11.

D'altra parte, anche la caratterizzazione istopatologica dei campioni prima della loro conservazione senza alterazioni tissutali significative rappresenta una sfida interessante. Di conseguenza, in molti casi, la determinazione istopatologica dei campioni viene eseguita dopo la loro analisi (ad esempio, analisi metabolomica HR 1H NMR)12. Questa pratica comporta spese inutili, dispendio di tempo e la perdita di un numero significativo di campioni che vengono eventualmente esclusi dall'analisi (ad esempio, campioni che, a seguito di analisi istopatologiche, risultano non essere campioni tumorali). In altri casi, la caratterizzazione istopatologica dei campioni viene eseguita prima della loro analisi. In effetti, alcuni studi precedenti hanno tentato di standardizzare i metodi per fornire campioni di ricerca rappresentativi di alta qualità da campioni di prostatectomia radicale per la genomica e la metabolomica13,14. Tuttavia, l'efficienza del campionamento è significativamente più elevata se eseguito da sezioni già confermate istologicamente (88%) che distruggono il tessuto, rispetto a quando eseguito da sezioni non confermate (45%)1.

Qui, viene presentata una nuova metodologia per superare queste limitazioni, con l'obiettivo di ottenere campioni di PC freschi e ben caratterizzati prima della conservazione nella Biobanca. Questo metodo è stato sviluppato attraverso sforzi di collaborazione tra diversi servizi clinici (Urologia, Patologia e Biobanca dell'Ospedale La Fe). È importante sottolineare che le biobanche svolgono un ruolo essenziale nella raccolta, elaborazione, conservazione e conservazione di campioni biologici, garantendo al contempo l'alta qualità dei campioni e dei dati, nonché il rispetto dei requisiti etici e legali 8,15,16.

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Protocollo

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Questo metodo è stato sviluppato attraverso sforzi collaborativi che hanno coinvolto diversi servizi clinici (Urologia, Patologia e Biobanca dell'Ospedale La Fe). Lo studio è stato condotto in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e ha ricevuto l'approvazione dal Comitato Etico per la Ricerca Biomedica presso l'Instituto de Investigación Sanitaria Hospital Universitario y Politécnico La Fe (Valencia, Spagna). Tutti i campioni sono stati conservati presso la Biobanca dell'Ospedale La Fe (PT13/0010/0026). La procedura generale è illustrata in dettaglio nella Figura 1.

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Figura 1: Schema generale della procedura. Rappresentazione schematica della procedura graduale descritta nella sezione relativa al protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Targeting tumorale

  1. Prima dell'intervento chirurgico, utilizzare la risonanza magnetica multiparametrica o biparametrica (mpMRI o bpMRI)17,18 per localizzare il tumore e mappare la sua posizione all'interno della ghiandola prostatica. Combinare le informazioni ottenute dalla risonanza magnetica con i risultati dell'ecografia transrettale o dell'esame rettale se quest'ultimo produce risultati discordanti.
  2. Per migliorare la localizzazione del tumore, rivedere i risultati delle biopsie prostatiche transrettali preoperatorie ecoguidate e guidate dalla risonanza magnetica.
    NOTA: Nella procedura diagnostica per il cancro alla prostata, le biopsie vengono prelevate direttamente dalla prostata tramite accesso transrettale. Queste biopsie includono il campionamento sistematico dalla prostata (che coinvolge cilindri distribuiti intorno alla ghiandola) e cilindri direttamente mirati a risultati sospetti alla risonanza magnetica. Per mirare al recupero di questi campioni, viene utilizzata l'ecografia transrettale, che viene combinata con i risultati della risonanza magnetica in modo cognitivo ("fusione cognitiva") o con un "vero software di fusione MRI-ultrasuoni" quando disponibile.

2. Prostatectomia radicale e raccolta della prostata

  1. Eseguire una prostatectomia radicale robotica assistita standardizzata attraverso un approccio transperitoneale, seguendo i passaggi delineati da Huynh et al.19.
    1. Iniziare con l'accesso addominale, l'insufflazione e il posizionamento della porta della fotocamera (vedere Tabella dei materiali). Posizionare le restanti cinque porte sotto la visione diretta. Impostare il pneumoperitoneo a 12 mm.
    2. Rilasciare la vescica incidendo il peritoneo e sezionare lo spazio perirettale.
    3. Aprire la fascia pelvica su ciascun lato.
    4. Eseguire una dissezione completa degli aspetti anteriore e laterale della prostata e della vescica.
    5. Effettuare l'apertura del collo vescicale, identificare e sezionare l'uretra prossimale per accedere agli aspetti posteriori della prostata e della vescica.
    6. Sezionare le vescicole seminali e lo spazio del retto19.
    7. Sezionare gli aspetti laterali della prostata, risparmiando i fasci neurovascolari.
    8. Garantire l'emostasi dei vasi nello spazio retropubico.
    9. Sezionare l'apice e sezionare l'uretra distale.
    10. Completare l'anastomosi vescico-uretrale.
    11. Estrarre la prostata ed eseguire la chiusura dell'incisione19.
  2. Raccogli la prostata fresca in un contenitore asciutto. È fondamentale non fissare o incorporare in paraffina il campione campione.
  3. Trasportare il campione chirurgico fresco, che include l'intera prostata, alla Biobanca per l'elaborazione del campione.

3. Trattamento della prostata e raccolta dei campioni

  1. Selezionare le zone prostatiche mirate per il campionamento in base alle informazioni sulla posizione del tumore recuperate dalla mpMRI preoperatoria, dai risultati della biopsia preoperatoria e dalla palpazione diretta del campione di prostatectomia. Registra queste informazioni su un modulo che includa i dati di identificazione del paziente, le aree della prostata finalmente campionate e il numero di campioni raccolti.
    NOTA: Quando i risultati della risonanza magnetica, i risultati della biopsia preoperatoria e la palpazione diretta del campione di prostatectomia sono concordanti, indirizzare tutti i campioni in quella o quelle posizioni (tra 4 e 6 cilindri). In caso di discordanza, aumentare il numero di cilindri e prendere di mira separatamente tutte le zone che sospettano di essere interessate da uno di questi metodi.
  2. Utilizzare un ago automatico monouso (chirurgo) per prelevare campioni cilindrici dalle aree selezionate (passaggio 1.1). Quindi, identificare (patologo) la zona esterna del cilindro, bloccare il cilindro con una pinza per tessuti, posizionarlo su un vetrino e contrassegnare la zona esterna con inchiostro per tessuti. Ripetere questo processo con tutti i cilindri presi.
  3. Posizionare i cilindri raccolti orizzontalmente su un disco portacampioni (vedi Tabella dei materiali) riempito con terreno di inclusione del criostato e trasferirli sulla piastra di raffreddamento del microtomo per il taglio.
  4. Una volta posizionato sulla piastra, fissare il disco portacampione al mandrino del campione e tagliarlo con movimenti attenti della ruota seguendo i passaggi successivi:
    1. Utilizzare il composto per la temperatura di taglio ottimale (composto OCT, vedere la Tabella dei materiali) per incorporare il campione di tessuto prima del sezionamento congelato su un microtomo-criostato.
    2. Successivamente, tagliare il campione utilizzando un microtomo criostatico a -25 °C. Raccogliere sottili sezioni di tessuto a forma di cilindro (10 μm) su vetrini da microscopio trattati. Assicurarsi di raccogliere solo pochi micron di tessuto per garantire una quantità adeguata di tessuto tumorale intatto per la conservazione nella Biobanca.
    3. Raccogli due o tre sezioni sottili per vetrino e colorale manualmente per controllare la colorazione finale. L'occhio del tecnico garantisce una colorazione ottimale e può essere eseguita qualsiasi ricolorazione necessaria. Segui questi passaggi
      1. Fissare i vetrini in etanolo al 96%, idratare in acqua distillata e colorare con ematossilina di Harris (vedi Tabella dei materiali) per 1 minuto per colorare i nuclei. Rimuovere l'ematossilina in eccesso risciacquando i vetrini con acqua distillata.
      2. Trattare i vetrini con idrossido di ammonio al 30% per trasformare l'ematossilina in blu. Rimuovere la soluzione in eccesso con risciacqui di acqua distillata.
      3. Colorare i vetrini con eosina (vedi Tabella dei materiali) per 30 s.
      4. Successivamente, disidratare i vetrini con titolazioni crescenti di alcol, pulirli con xilene (100%) e montarli con DPX (una miscela di stirene, un plastificante e xilene, utilizzato come mezzo di montaggio in resina sintetica che sostituisce lo xilene-balsamo, vedere la Tabella dei materiali). Durante questi passaggi, immergere i vetrini e rimuoverli dal barattolo di soluzione di Coplin.
      5. Infine, posizionare un vetrino coprioggetti sopra il tessuto colorato e utilizzare un mezzo con un indice di rifrazione adatto (vedi Tabella dei materiali) per la visualizzazione al microscopio.

4. Caratterizzazione del campione

  1. Analizzare il campione al microscopio ottico (patologo), discriminando le aree di carcinoma e determinando il punteggio di Gleason del tumore. Documentare tutti questi dati e contrassegnare le zone tumorali precise sui vetrini.
  2. Durante questa fase, etichettare il vetrino con la posizione precisa del tumore e il rispettivo punteggio di Gleason20. Inoltre, segnare la posizione della PIN (neoplasia intraepiteliale prostatica) in base all'identificazione morfologica.

5. Micro-macro-dissezione e conservazione del campione

  1. Contrassegnare chiaramente i diversi componenti istologici con marcatori distinti sul vetrino (patologo) e correlarli direttamente con il tessuto congelato sul disco.
  2. Quindi, utilizzando una lama chirurgica, macro-micro sezionare le aree del campione contrassegnate sul vetrino all'interno del disco OCT, dividendole in tessuto tumorale, peritumorale, PIN e normale tessuto prostatico.
  3. Quando il mezzo di inclusione inizia a scongelarsi, maneggiare il tessuto con una pinza e posizionarlo in criotubi correttamente etichettati.
    NOTA: Conservare con cura ogni frammento sezionato all'interno della provetta corrispondente, seguendo la diagnosi istologica delle crio-fette.
  4. Conservare le crioprovette marcate con campioni istologici completamente caratterizzati nella Biobanca a -80 °C per un successivo utilizzo in studi di ricerca.
    NOTA: I passaggi descritti in questa sezione possono essere eseguiti da un tecnico qualificato sotto la supervisione del patologo. Il campione chirurgico deve essere trasportato alla Biobanca il prima possibile per prevenire la degradazione dei tessuti e dell'acido nucleico. Secondo le guide di riferimento, bisogna cercare di evitare un tempo di ischemia prolungato (>30 min)21. I campioni possono essere conservati nella Biobanca a tempo indeterminato, purché vengano mantenuti i principi di qualità dei campioni.

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Risultati

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I risultati rivelano che questa tecnica ha permesso di ottenere materiale tumorale nel 61% dei casi studiati (25 casi su 41) (Tabella 1).

Tabella 1: Dati istopatologici dei campioni di studio. Riepilogo dei dati istopatologici per i campioni utilizzati nello studio. Il cilindro diagnostico si riferisce al campione di biopsia prostatica ottenuto a scopo diagnostico, mentre il cilindro processato corrisponde al cilindro ottenuto dal campione di prostatectomia a ...

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Discussione

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In qualsiasi studio di ricerca, l'ottenimento di campioni di qualità è un requisito essenziale per ridurre le distorsioni sistematiche e ottenere risultati affidabili22. Pertanto, il controllo di variabili preanalitiche come la temperatura alla quale i campioni vengono processati e conservati, il tempo trascorso dalla raccolta del campione alla conservazione, l'uso di materiali sterilizzati o gli effetti che l'aggiunta di conservanti o altri additivi può avere sui campioni deve essere considerato ...

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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A.L. riconosce un contratto post-dottorato "Margarita Salas" (numero 21-076) e MAM-T un contratto di ricerca "Maria Zambrano" (numero MAZ/2021/03 UP2021-021). Entrambi i contratti sono stati finanziati dall'Unione Europea-Next generation EU.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Pinza CadiereIntuitivePN1052082-US 10/2021Numero di parte: 471049. 18 utilizzi.
Vetrini convenzionaliKnittel Glass2021Microtomo criostato rettificato/ Estremità smerigliata
Thermo Fisher Scientific---Criostato CryoStar NX50
CryotubesGreiner Bio-One GmbHRif.: 122280.CRYO S. PP, con tappo a vite, sterile.
Sistema chirurgico Da VinciIntuitivePN1052082-US 10/2021XI modello
dissezioneBayer---Due pinzette e una lama chirurgica 
DPX Eukitt Medizin- und Labortechnik GmbH6.00.01.0001.06.01.01
EosinAgilent157252
Pinze bipolari fenestrateIntuitivePN1052082-US 10/2021Codice articolo: 471205. 14 vite.
Forza bipolareIntuitivoPN1052082-US 10/2021Codice prodotto: 471405. 12 utilizzi.
CongelatoriThermo ScientificMODELLO 907. -80 º C
EmatossilinaAgilent157251
Vetrini per immunoistochimicaAgilent-DakoK802021-2
Cacciavite per aghi grandeIntuitivoPN1052082-US 10/2021Numero di parte: 471006. 15 utilizzi.
Pinza bipolare MarylandIntuitivePN1052082-US 10/2021Numero di parte: 471172. 14 utilizzi.
MicroscopioOlympus---Olympus cx40
Lame per microtomoPFM Medicala35
Forbici curve monopolariIntuitivePN1052082-US 10/2021Numero di parte: 470179. 10 utilizzi.
Composto OCTNEG-50LOT.117340
PlusSpeed S Dispositivo per biopsia monouso con punta smussataPeter Pflugbeil GmbH PSS-1825-S
Forcipe ProGaspIntuitivoPN1052082-US 10/2021Numero di parte: 471093. 18 utilizzi.
Porta campioni DiscoDavidson Cryo Chuck. BradleyProdotti30 mm
Inchiostro velinaPelikan2021Inchiostro 4001 nero brillante (301168)
XylolQuimipurRef. 169
Strumenti di

Riferimenti

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Prostate Cancer TissueTumor SamplingMolecular CharacterizationBiobank StorageGleason ScoreIntratumoral HeterogeneityMicrodissection TechniquePersonalized Medicine

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