Articolo metodologico

Dissezione e classificazione dello sviluppo ovarico in insetti femmina wild-type

DOI:

10.3791/65644

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14 luglio 2023

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1Institute of Plant Protection, Shandong Academy of Agricultural Sciences

In questo articolo

Sommario

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Il protocollo dimostra un metodo di dissezione semplice e facile, adatto per gli insetti femmina migratori di tipo selvatico catturati con trappole a proiettori. Questa tecnica può chiarire in modo significativo la stessa specie confrontando entrambi i tessuti riproduttivi, vale a dire il sacco di accoppiamento e lo sviluppo ovarico degli insetti femmina wild-type.

Abstract

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Gli insetti nocivi migratori pongono serie sfide alla produzione e alla sicurezza alimentare in tutto il mondo. I parassiti migratori possono essere monitorati e catturati utilizzando trappole a proiettori. Una delle tecniche più importanti per la previsione dei parassiti migratori è l'identificazione delle specie migratorie. Tuttavia, nella maggior parte dei casi, è difficile ottenere le informazioni solo in apparenza. Pertanto, l'utilizzo delle conoscenze acquisite dall'analisi sistematica del sistema riproduttivo femminile può aiutare a comprendere la morfologia anatomica combinata del sacco di accoppiamento ovarico e il grado di sviluppo ovarico degli insetti migratori wild-type catturati con trappole a proiettori. Per dimostrare l'applicabilità di questo metodo, lo stato di sviluppo ovarico e gli stadi di sviluppo del chicco d'uovo sono stati valutati direttamente in Helicoverpa armigera, Mythimna separata, Spodoptera litura e Spodoptera exigua per l'anatomia ovarica, e le sacche di accoppiamento ovarico sono state studiate in Agrotis ipsilon, Spaelotis valida, Helicoverpa armigera, Athetis lepigone, Mythimna separata, Spodoptera litura, Mamestra brassicae e Spodoptera exigua, per esplorare le loro relazioni. Questo lavoro mostra il metodo di dissezione specifico per prevedere gli insetti migratori wild-type, confrontando il sistema riproduttivo unico di diversi insetti migratori. Quindi, entrambi i tessuti, vale a dire l'ovaio e le sacche di accoppiamento, sono stati ulteriormente studiati. Questo metodo aiuta a prevedere la dinamica e lo sviluppo strutturale dei sistemi riproduttivi negli insetti migratori femmine wild-type.

Introduzione

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La migrazione degli insetti gioca un ruolo fondamentale nelle dinamiche di popolazione della distribuzione globale degli insetti per insetti come Helicoverpa armigera - il verme del cotone, Mythimna separate - il verme dell'esercito orientale, Spodoptera litura - il bruco del taro, Spodoptera exigua - il verme della barbabietola, che sono stati segnalati come gravi parassiti in Cina 1,2,3,4. Le lunghe distanze di viaggio, gli spostamenti stagionali, l'elevata fecondità dei parassiti migratori e i fattori ecologici hanno portato grandi difficoltà nella previsione, nella previsione e nel controllo di questi parassiti5. Il monitoraggio della migrazione dei parassiti è necessario per rivelare l'adattabilità e i cambiamenti comportamentali che facilitano i parassiti migratori in base ai cambiamenti climatici o ai cicli6. Per sostenere la loro crescita, riproduzione e sopravvivenza, gli insetti hanno acquisito un'adattabilità sequenziale durante l'evoluzione; Questa serie di vita adattativa ha generato molti cambiamenti nel sistema riproduttivo, come la strategia migratoria che porta al controllo dello sviluppo ovarico nel lungo processo migratorio.

Lo sviluppo ovarico è comune nei parassiti migratori, il che influisce sulla crescita della loro popolazione7. Pertanto, lo sviluppo ovarico è stato un argomento caldo della ricerca sui parassiti migratori per molto tempo. Una serie di studi ha portato a diversi indicatori di sviluppo ovarico e strategie di classificazione. Fino ad ora, sono stati utilizzati diversi metodi per analizzare lo sviluppo delle ovaie, ad esempio Loxostege sticticalis - la falena dei prati - lo sviluppo delle ovaie che include la fase iniziale di piume, il primo periodo di deposizione delle uova, il periodo di deposizione delle uova e la fine dell'ovideposizione8. Alcuni ricercatori dividono i livelli ovarici in base allo sviluppo del colore del tuorlo nei parassiti migratori dei lepidotteri, come S. exigua - il verme della barbabietola, Pseudaletia unipuncta - il vero verme dell'esercito e Cnaphalocrocis medinalis - la cartella delle foglie di riso, ecc.9,10,11,12. In studi precedenti, i livelli di sviluppo ovarico per i parassiti, come il verme del cotone e il rullo fogliare di riso, sono stati divisi in cinque fasi: fase di deposizione del tuorlo, fase di maturazione del chicco d'uovo, attesa matura per la nascita, periodo di picco dell'ovogenesi e fase di fine deposizione delle uova13,14. Lo sviluppo ovarico della piralide del mais è stato suddiviso in sei fasi di sviluppo: fase di deposizione del tuorlo, maturazione delle uova, disposizione pre-uova, fase di picco della deposizione delle uova e fase di deposizione delle uova finali15.

Inoltre, gli insetti dello stesso genere hanno diversi stadi di sviluppo, come i livelli di sviluppo ovarico di Spodoptera frugiperda - il verme dell'esercito autunnale - rientra in quattro livelli: fase di deposizione del tuorlo, attesa matura per il parto, picco di ovi-positività e fase di fine deposizione delle uova16. D'altra parte, lo sviluppo ovarico in Spodoptera exigua - la falena della barbabietola - ha cinque livelli: trasparente, vitellogenesi, maturazione delle uova, rilascio delle uova e livelli di deposizione tardivadelle uova 17.

Gli studi precedenti possono classificare lo sviluppo da uno a più livelli di sviluppo ovarico solo utilizzando la maturità del colore del tuorlo, l'ovideposizione e lo sviluppo dell'uovo, ma la classificazione non può essere fatta in base all'anatomia del sistema riproduttivo. Lo sviluppo di un'ovaia in base all'anatomia della morfogenesi è un'area meno studiata. In questo caso, il metodo di dissezione è stato progettato per prevedere le femmine migratrici nella popolazione utilizzando due tipi di tessuto ovarico, per elaborare le loro dinamiche riproduttive sulla base della morfogenesi anatomica dello stadio di sviluppo ovarico e del sacco di accoppiamento, fornendo prove dirette per distinguere le femmine selvatiche migratorie.

Alcuni studi hanno scoperto che le specie migratorie di insetti Noctuidae sono state spesso catturate dai proiettori18. L'ovario della maggior parte delle specie migratorie di insetti Noctuidae è nelle prime fasi di sviluppo durante la fase iniziale della migrazione e il livello ovarico aumenta con il progresso migratorio. In questo studio, viene descritto il metodo di dissezione per i gradi di sviluppo ovarico, per studiare i due tessuti riproduttivi di diversi parassiti della popolazione femminile, catturati dalla luce di ricerca. Questo metodo non solo fa progredire la ricerca per comprendere le dinamiche migratorie, ma anche le strutture nella classificazione degli insetti, nello studio della fisiologia degli insetti, nella previsione dei parassiti e nella previsione delle specie di parassiti femminili.

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Protocollo

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NOTA: Prestare attenzione alle misure di sicurezza prima di intrappolare insetti migratori di tipo selvatico, si consiglia di indossare indumenti di sicurezza (guanti, magliette a maniche lunghe e occhiali). Inoltre, spegnere la trappola quando non è in uso per evitare altri rischi per la sicurezza e il surriscaldamento della luce. È importante seguire i protocolli di sicurezza prima della dissezione, come indossare guanti, occhiali e camice da laboratorio per prevenire l'esposizione a fluidi corporei e sostanze chimiche.

1. Cattura di insetti migratori

  1. Inizia questo protocollo intrappolando gli insetti usando la lampada del proiettore. In questo protocollo, la fonte dell'insetto di prova è il distretto di Jiyang, città di Jinan, provincia di Shandong, Cina (36.977088° N, 116.982747° E).
  2. Utilizzare il corpo principale della lampada del proiettore, che è realizzato in acciaio non arrugginito, la scatola, che è un corpo rettangolare, e la lampada frontale alogena di tipo GT75, con una potenza di 1000 W. Posizionare la lampada frontale al centro come fonte di luce.
  3. Posizionare un canale di raccolta degli insetti a forma di imbuto all'interno e nella parte inferiore della luce, posizionare una scatola per la raccolta degli insetti con un diametro di 5 cm, seguita da un sacchetto di rete raccoglitore di insetti da 60 ordini (0,5 m x 0,5 m), che viene utilizzato per raccogliere gli insetti intrappolati dalla luce. La proiezione nota della luce è di circa 500 m dal suolo.
  4. Questo protocollo pone l'accento sulle dinamiche migratorie delle femmine selvatiche e sullo sviluppo delle ovaie; quindi, raccogliere diverse specie di insetti (qui la raccolta è stata fatta da aprile ad agosto, durante il 2021 e il 2022). Evita di raccogliere insetti di piccole dimensioni e feriti, seleziona parassiti di grandi dimensioni di dimensioni simili per questo esperimento.

2. Preparazione degli insetti

  1. Trasferire tutti gli insetti raccolti dal sacchetto di rete (0,5 m) alla gabbia di rete (30 cm x 30 cm), quindi fornire una capsula di Petri contenente una soluzione sterilizzata di acqua di miele al 10% (l'alimentazione è facoltativa). Posizionare la gabbia a 27 ± 2 °C, 65% ± 12% di umidità relativa e mantenere al buio per 8-12 ore.
  2. Seleziona le femmine selvatiche che sono volate all'interno della gabbia lo stesso giorno, trasferiscile con cura nelle singole provette della fiala e chiudi ogni provetta con un coperchio di cotone. Evitare la manipolazione diretta, che potrebbe danneggiare o ferire il parassita a causa di una pressione eccessiva.
    NOTA: Tutte le femmine selvatiche sono state catturate di notte e la dissezione è stata eseguita di giorno. Pertanto, ogni esperimento è stato eseguito nell'arco di un giorno.

3. Preparazione per il metodo di paralisi degli insetti (Figura 1)

  1. Posizionare il parassita femmina selezionato individualmente in un tubo della fiala di mosca al centro e anestetizzare la femmina usando il gas CO2 tenendo l'ago della pistola ad aria compressa per causare una lieve paralisi. Per confermare se il parassita è paralizzato o meno, spingilo delicatamente o toccalo usando una spazzola morbida. L'assenza di risposta a stimoli deboli e l'immobilità indicano una paralisi riuscita.
    NOTA: La bassa temperatura (-20 °C) può essere utilizzata anche come tecnica alternativa per paralizzare gli insetti.

4. Dissezione di insetti

  1. Mettere la femmina appena paralizzata nella capsula di Petri da dissezione contenente etanolo assoluto (10 ml). Per evitare l'influenza dei peli di cocciniglie e della polvere delle ali durante la dissezione, infiltrare l'insetto vivo o paralizzato con alcol assoluto e risciacquare con acqua pulita.
  2. Separare le ali dorsali dalla giunzione del torace e del corpo dell'addome, utilizzando due paia di pinze.
  3. Trasferire l'addome in una nuova capsula di Petri monouso, contenente una quantità adeguata di acqua (2-5 mm di profondità), e staccare delicatamente l'esoscheletro addominale lungo la linea ventrale dorsale dalla bocca appuntita alla coda, utilizzando una pinza da dissezione. Ripeti gli stessi passaggi sull'altro lato, quindi mettilo in acqua pulita per disperdere i tessuti intatti.
  4. Staccare con cura i tessuti adiposi dell'epidermide usando le pinze, quindi tirare e rilasciare delicatamente le ovaie.
  5. Usa una pinza da dissezione per rimuovere delicatamente le particelle di grasso e altri organi intorno alle ovaie. Generalmente, le ovaie del parassita sono per lo più ripiegate verso l'interno su entrambi i lati dell'addome, cercano di operare in un ambiente liquido mentre si aprono le ovaie e lentamente staccano il sacco di accoppiamento dal centro e raccolgono le particelle di grasso attaccate alle tube ovariche.
  6. Afferrare delicatamente l'ovaio e il sacco di accoppiamento dall'estremità posteriore verticale e aprirlo con cautela verso il basso. Per evitare danni durante lo spiegamento, trasferire l'ovaio in una capsula di Petri nuova o pulita contenente acqua. Tenere la punta dell'ovaio e aprire l'ovaio verso l'interno; Eseguire con attenzione questo passaggio per evitare danni agli ovarioli.

5. Analisi dei dati per l'anatomia dei tessuti ovarici

  1. In questa fase valutare lo sviluppo delle uova per ogni insetto, seguendo il colore e le dimensioni delle uova, per giudicarne la maturità. Quindi, giudica il grado ovarico in base allo sviluppo dell'ovulo.
    NOTA: La divisione dei vari livelli di sviluppo ovarico è principalmente suddivisa, prima della deposizione delle uova o dello sviluppo delle uova con il livello di precipitazione del tuorlo. Lo sviluppo del chicco d'uovo degli insetti è ulteriormente suddiviso in fasi per maggiore chiarezza, come la fase di comparsa del tuorlo, la fase di maturazione del tuorlo e la fase di morte del tuorlo. La maturità del chicco d'uovo dipende dalla pienezza, dal colore e dalle dimensioni dell'uovo per giudicarne la maturità.
  2. Dopo la dissezione, assicurarsi di separare i tessuti delle sacche di accoppiamento femminili dalle ovaie intatte e osservare la morfologia per distinguere la specie perché l'anatomia della maggior parte delle sacche di accoppiamento varia da specie a specie. Pertanto, utilizzare le sacche di accoppiamento per distinguere tra le specie.
  3. In questa fase, valuta l'anatomia ovarica e analizza il grado di sviluppo ovarico. Dividi i tessuti ovarici in cinque gradi (dal grado 1 al grado 5).
    1. Cerca i seguenti cambiamenti e la struttura per organizzare il tessuto: il primo grado (1) è una fase iniziale dello sviluppo (trasparente lattiginoso), addome pieno, corpo molle, grasso soffice, colore chiaro, difficile da sbucciare. Il secondo grado (2) è la fase di deposizione del tuorlo e, se necessario, classificare le ovaie separatamente dopo aver osservato il canale ovarico più lungo e più spesso. Il terzo grado (3) ha meno corpi grassi e solo pochi granuli attaccati all'ovaio. Il quarto grado (4) appare meno elastico e facile da rompere, e alcuni ovuli possono essere presenti al centro della tuba uterina. Il quinto grado (5) è facile da identificare con corpi meno o nessun corpo, ovaie atrofiche e fragili.
  4. Cattura le immagini utilizzando una fotocamera digitale secondo le esigenze sperimentali.

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Risultati

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Sviluppo delle uova
Il protocollo di cui sopra è stato applicato per analizzare lo sviluppo degli ovuli nell'ovaio. A questo scopo, in primo luogo, le uova sono state classificate generalmente in quattro stadi per distinguere lo stadio iniziale e maturo dello sviluppo delle uova tra tutte le specie, ad esempio verme bollworm, verme dell'esercito, bruco del taro e falena della barbabietola. Qui è stato osservato lo stadio iniziale del piumaggio (stadio trasparente bianco latte). La...

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Discussione

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I metodi di analisi ovarica sono utilizzati abitualmente nella protezione delle piante, per chiarire il movimento del volo e della popolazione degli insetti per la previsione 19,20,21 e per elaborare le variazioni fisiologiche negli insetti. È stato notato che la migrazione unica e la rapida capacità di dispersione dei parassiti agricoli comuni, come il verme dell'esercito, il bruco del taro e la falena della barbabietola, rendo...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

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Questo studio è stato supportato dall'importante progetto di innovazione scientifica e tecnologica (2020CXGC010802).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Fotocamera digitaleCanon (Cina) co., LTDEOS 800D
ContagocceQingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Etanolo assoluto (99,7%)Shanghai Hushi Laboratory Equipmentco., LTD
Pincipe Vetus Tools co., LTDST-14
GT75 tipo lampada alogena (1000 W)Shanghai Yadeng Industry co., LTD
Helicoverpa armigera, Mythimna separato, Spodoptera litura, Spodoptera exigua Jiyangdistrict, città di Jinan, provincia di Shandong, Cina
Cilindro graduato, becher, palloneQingdao jindian biochemical equipment co., LTD
Net bag Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD0,5 m
Gabbie a rete Qingdao jindian biochemical equipment co., LTD30 cm x 30 cm
piastre di PetriQingdao jindian biochemical equipment co., LTD Diametro 60 mm

Riferimenti

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