Il modello murino dell'indicatore di azione dell'ormone tiroideo è stato sviluppato per consentire la quantificazione tessuto-specifica dell'azione locale dell'ormone tiroideo utilizzando il suo meccanismo di regolazione endogena. Recentemente, è stato dimostrato che il modello è adatto per caratterizzare sostanze chimiche interferenti endocrine che interagiscono con l'economia degli ormoni tiroidei, sia con metodologie ex vivo che in vivo .
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Articolo metodologico
Caratterizzazione in vivo degli effetti chimici di interferenza endocrina tramite l'indicatore di azione dell'ormone tiroideo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli ormoni tiroidei (TH) svolgono un ruolo fondamentale nel metabolismo cellulare e nella funzione dei tessuti. L'economia TH è suscettibile alle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino (EDC) che possono disturbare la produzione o l'azione ormonale. Molti inquinanti ambientali sono interferenti endocrini, che rappresentano una minaccia emergente sia per la salute umana che per la produzione agricola. Ciò ha portato a un aumento della domanda di sistemi di test adeguati per esaminare gli effetti di potenziali interferenti endocrini. Tuttavia, le metodologie attuali devono affrontare delle sfide. La maggior parte dei sistemi di test utilizza marcatori endogeni regolati da processi regolatori multipli, spesso complessi, che rendono difficile distinguere gli effetti diretti da quelli indiretti. Inoltre, i sistemi di test in vitro non hanno la complessità fisiologica del metabolismo e della farmacocinetica degli EDC nei mammiferi. Inoltre, l'esposizione agli interferenti endocrini ambientali di solito comporta una miscela di più composti, compresi i metaboliti generati in vivo , quindi la possibilità di interazioni non può essere ignorata. Questa complessità rende difficile la caratterizzazione degli EDC. Il topo THAI (Thyroid Hormone Action Indicator) è un modello transgenico che trasporta un sistema reporter luciferasi TH-responsivo, che consente la valutazione dell'azione TH tessuto-specifica. È possibile valutare gli effetti tessuto-specifici delle sostanze chimiche sull'azione locale del TH quantificando l'espressione reporter della luciferasi in campioni di tessuto. Inoltre, con l'imaging in vivo , il modello murino THAI consente studi longitudinali sugli effetti di potenziali interferenti endocrini negli animali vivi. Questo approccio fornisce un potente strumento per testare l'esposizione a lungo termine, le strutture di trattamento complesse o l'astinenza, in quanto consente di valutare i cambiamenti nell'azione locale del TH nel tempo nello stesso animale. Questo rapporto descrive il processo di misurazione dell'imaging in vivo su topi THAI. Il protocollo qui discusso si concentra sullo sviluppo e l'imaging di topi iper- e ipotiroidei, che possono servire come controlli. I ricercatori possono adattare o espandere i trattamenti presentati per soddisfare le loro esigenze specifiche, offrendo un approccio fondamentale per ulteriori indagini.
Introduzione
La segnalazione dell'ormone tiroideo (TH) è un regolatore fondamentale del metabolismo cellulare, essenziale per il normale sviluppo e la funzione ottimale dei tessuti in età adulta1. All'interno dei tessuti, l'azione del TH è finemente controllata da un complesso meccanismo molecolare, che consente il mantenimento tessuto-specifico dei livelli locali di TH. Questa autonomia dei diversi tessuti dai livelli circolanti di TH è di grande importanza 2,3,4.
Numerose sostanze chimiche hanno il potenziale di alterare le funzioni endocrine e si trovano nell'ambiente come inquinanti. È una preoccupazione crescente che queste molecole possano entrare nella catena alimentare attraverso le acque reflue e la produzione agricola, con un impatto sulla salute del bestiame e degli esseri umani 5,6,7.
Una delle sfide significative nell'affrontare questo problema è l'enorme numero di composti coinvolti, comprese le molecole autorizzate e già vietate, ma ancora persistentemente presenti. Negli ultimi anni sono stati compiuti sforzi sostanziali per sviluppare sistemi di prova per lo screening e l'identificazione del potenziale di disturbo di varie sostanze chimiche 8,9,10,11. Sebbene questi metodi eccellono nello screening ad alto rendimento di migliaia di composti e nell'identificazione di potenziali minacce, un'analisi dettagliata degli effetti specifici in vivo di queste molecole è essenziale per stabilire i rischi dell'esposizione umana. Pertanto, è necessario un approccio multiforme quando si studiano e caratterizzano le sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino (EDC).
Nel contesto della regolazione del TH, la comprensione delle conseguenze tessuto-specifiche dell'esposizione all'EDC richiede la quantificazione dell'azione locale del TH. Sebbene siano stati sviluppati diversi modelli in vivo per questo scopo, la maggior parte si basa su marcatori endogeni come misura di output. Pur essendo fisiologici, questi marcatori sono soggetti a numerosi meccanismi di regolazione, sia diretti che indiretti, che rendono più difficile la loro interpretazione. Pertanto, la caratterizzazione degli effetti dell'EDC sulla regolazione del TH a livello tissutale rimane una sfida significativa12,13.
Per affrontare le sfide della misurazione della segnalazione TH tessuto-specifica, è stato recentemente sviluppato il modello murino THAI (Thyroid Hormone Action Indicator). Questo modello consente di quantificare in modo specifico i cambiamenti nell'azione locale del TH in condizioni endogene. Un transgene della luciferasi è stato introdotto nel genoma del topo, che è altamente sensibile alla regolazione da parte dell'azioneTH 14. Questo modello si è dimostrato efficace nel rispondere a varie domande di ricerca che richiedono la quantificazione dei cambiamenti nella segnalazione TH tissutale locale 14,15,16,17,18.
Il riconoscimento di un potenziale utilizzo del modello THAI sta caratterizzando gli effetti tessuto-specifici degli EDC sulla segnalazione TH. Il modello è stato recentemente impiegato con successo per studiare gli effetti tessuto-specifici del tetrabromobisfenolo A e del diclazuril sulla segnalazione TH15. Qui, vengono presentati i protocolli di base per l'utilizzo di tecniche di imaging in vivo sul modello THAI come sistema di test per la caratterizzazione degli EDC che interrompono la funzione TH. Questo metodo sfrutta la natura bioluminescente della reazione luciferina-luciferasi. Essenzialmente, l'enzima luciferasi espresso transgenicamente catalizza l'ossidazione della luciferina somministrata, generando luce luminescente proporzionale alla quantità di luciferasi nel tessuto (Figura 1). Di conseguenza, la risposta biologica misurata è l'attività della luciferasi, che è stata validata come misura appropriata dell'azione locale del TH14. Mentre il modello THAI è applicabile per quantificare l'azione del TH praticamente in tutti i tessuti, l'imaging in vivo si concentra principalmente sull'azione del TH nell'intestino tenue (imaging ventrale) e nel tessuto adiposo bruno interscapolare (BAT, imaging dorsale)14.
Un vantaggio significativo della tecnica di imaging in vivo è che elimina la necessità di sacrificare animali per le misurazioni. Ciò consente ai ricercatori di progettare esperimenti longitudinali e di follow-up come studi autocontrollati, riducendo i pregiudizi tra i soggetti e il numero di animali utilizzati. Questo aspetto è particolarmente cruciale nella caratterizzazione degli EDC e la forza e la versatilità del metodo per questo scopo sono state precedentemente dimostrate14,15.
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Protocollo
Il presente protocollo è stato esaminato e approvato dal Comitato per il benessere degli animali presso l'Istituto di medicina sperimentale (PE/EA/1490-7/2017, PE/EA/106-2/2021). I dati presentati provengono da14 topi THAI maschi di 3 mesi con background FVB/Ant (n = 3-6/gruppo). Gli animali tailandesi tendono ad avere macchie altamente pigmentate sulla pelle che possono distorcere le misurazioni. Quindi, cerca macchie pigmentate sulla pelle dell'area ritratta dopo la rimozione del pelo. Gli animali non richiedono condizioni di stabulazione speciali, a meno che l'esperimento non lo richieda specificamente (ad esempio, una dieta speciale).
1. Trattamento dell'ipertiroidismo
NOTA: Un protocollo generale per indurre l'ipertiroidismo nei topi è fornito qui. La guida ATA19 offre spiegazioni dettagliate sullo sfondo dei metodi con le alternative menzionate.
- Sciogliere T3 (3,5,3'-triiodotironina, vedi Tabella dei Materiali) in 40 mM di NaOH per creare una soluzione madre con una concentrazione compresa tra 5-10 mg/mL.
- Diluire la soluzione madre con soluzione fisiologica fino a una concentrazione finale di 0,1 μg/μL.
- Iniettare la soluzione diluita di T3 per via intraperitoneale (i.p.) in animali svegli ad un volume di 10 μL per grammo di peso corporeo (bwg). Dopo 24 ore, gli animali saranno considerati ipertiroidei.
NOTA: Il trattamento T3 può essere sostituito da qualsiasi altro tipo di trattamento. Il trattamento non influisce sul protocollo di imaging in vivo .
2. Trattamento dell'ipotiroidismo
NOTA: Qui, viene fornito solo un protocollo generale per indurre l'ipotiroidismo nei topi. La guida ATA19 descrive spiegazioni dettagliate sullo sfondo dei metodi con le alternative menzionate.
- Passare a una dieta a base di cibo senza iodio e aggiungere KClO4 e metimazolo all'acqua potabile (0,01 % metimazolo, 0,05 % KClO4 %) (vedi tabella dei materiali).
- Sostituisci regolarmente la soluzione da bere (ogni 2-3 giorni) con una soluzione da bere fresca perché il metimazolo è sensibile alla luce e si degrada rapidamente.
- Mantenere il regime di trattamento per almeno 2 settimane, non più di 4 settimane. Gli animali perderanno peso e mostreranno disagio. Se gli animali si muovono a malapena, hanno perso gran parte del pelo o sono a malapena coscienti, utilizzare un endpoint umano e terminarli con qualsiasi metodo (seguendo protocolli approvati a livello istituzionale).
- Continuare il trattamento con l'ipotiroidismo se combinato con altri trattamenti per prevenire il potenziale recupero dall'ipotiroidismo.
3. Imaging in vivo
- Avviare il software compatibile con il sistema di imaging in vivo (vedere la tabella dei materiali).
- Effettuare l'accesso e attendere il caricamento del pannello "Imaging Wizard". Si tratta di un pannello più piccolo in basso a sinistra della finestra.
- Nella "Procedura guidata di imaging" avviare il raffreddamento della fotocamera facendo clic su Inizializza nel pannello "Procedura guidata immagine". In questo modo lo strumento esegue un protocollo di configurazione, attende il completamento. Il pannello "Imaging Wizard" diventa blu e si accende una luce verde nel pannello quando la temperatura della fotocamera è sufficientemente bassa e lo strumento è pronto.
- Impostare la temperatura del termoforo a 30-37 °C per mantenere caldi gli animali misurati.
NOTA: Continuare con il protocollo attendendo che la temperatura della fotocamera sia ottimale. - Non tenere o trattare animali vicino allo strumento. Evitare che quantità eccessive di capelli circolino nell'aria intorno allo strumento.
- Anestetizzare 1-3 animali con iniezione di ketamina-xilazina per via endovenosa (ketamina 50 mg/kg di peso corporeo, xilazina 10 mg/kg di peso corporeo, vedere Tabella dei materiali). In alternativa, se è installato un sistema anestetico con isoflurano, seguire i protocolli istituzionalmente approvati per utilizzare l'anestesia con isoflurano, sostituendo la miscela ketamina-xilazina.
NOTA: I topi ipotiroidei sono più sensibili alla ketamina-xilazina; Utilizzare metà dose. - Utilizzare un gel per la protezione degli occhi durante l'anestesia.
- Controllare il riflesso del pedale pizzicando i poggiapiedi. Nessun riflesso del pedale conferma lo stato di anestesia piana chirurgica.
- Dopo che l'anestesia ha fatto effetto, rimuovere il pelo dalle parti del corpo ritratte utilizzando il metodo di rimozione del pelo più adatto (epilatore, rasatura, crema, ecc.). Assicurarsi che non sia rimasta pelliccia sulle parti del corpo ritratte per evitare la dispersione della luce luminescente.
- Sciogliere la Na-luciferina (vedere Tabella dei materiali) in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) ad una concentrazione di 15 mg/mL. La luciferina è sensibile alla luce; Evitare l'esposizione diretta alla luce. Conservare la soluzione in tubi ambrati o avvolgerla in un foglio di alluminio.
- Trattare gli animali rasati con una soluzione di luciferina 10 μL/bwg i.p.
- Posiziona gli animali nello strumento con il punto centrale della fotocamera contrassegnato da un "+" sul pad. Assicurarsi che il posizionamento corretto controlli le linee della griglia e confermi con una singola acquisizione "Foto" se non si è sicuri.
- Attendere 15 minuti dopo la somministrazione del substrato prima di effettuare la prima misurazione. Durante questo periodo, impostare il tempo di imaging nel pannello "Image Wizard" su 3 min per la luminescenza e selezionare le caselle per Foto e Luminescenza. La 'Foto' deve coincidere con la luminescenza per identificare la sorgente del segnale misurato.
NOTA: Sono necessari 15 minuti per un assorbimento ottimale del substrato e una distribuzione tissutale ottimale. Il segnale luminescente si stabilizza 15-20 minuti dopo la somministrazione di luciferina. Il segnale inizia a diminuire lentamente dopo il plateau. - Effettuare la prima misurazione facendo clic su Misura nel pannello "Imaging Wizard".
- Se vengono eseguite sia l'imaging ventrale che quello dorsale, riorganizzare gli animali in modo che la seconda parte del corpo venga visualizzata immediatamente dopo aver concluso la prima.
- Al termine dell'imaging, riportare gli animali nelle loro gabbie e continuare l'esperimento con il gruppo di animali successivo.
- Lascia che gli animali si riprendano, il che in genere richiede 1-2 ore al massimo. Posiziona un tubo pieno di acqua calda vicino agli animali per facilitare il recupero e monitora i segni vitali come la respirazione e la perfusione.
- Decidi il destino degli animali misurati. Nei dati presentati in questo articolo, gli animali misurati sono stati sottoposti a eutanasia seguendo protocolli approvati a livello istituzionale per le misurazioni ex vivo . Tuttavia, questo non è necessario. Considera se l'eutanasia o gli esperimenti di follow-up sono etici.
4. Analisi dei dati
- Aprire il file "ClickInfo" nel software. Sul lato destro della finestra si aprirà un pannello denominato "Tavolozza degli strumenti" per l'analisi e la modifica delle immagini.
- Converti la scala in radianza nell'angolo in alto a sinistra dell'immagine.
- Fare clic su "Regolazione immagine".
- Decidi il binning ottimale e la scala di colori delle immagini. Fai in modo che tutte le immagini utilizzino le stesse impostazioni.
- Fare clic su "Strumenti ROI" nella "Tavolozza degli strumenti".
- Seleziona le aree di interesse cliccando su "Posiziona ROI" negli "Strumenti ROI". Anche l'utilizzo di ROI di dimensioni uguali o di ROI di dimensioni diverse può essere significativo a seconda del disegno sperimentale.
- Fare clic su "Misura ROI". Si aprirà una nuova finestra con i dati delle ROI inserite. Esporta i dati con il comando di Windows ctr + c-ctrl + v in un software organizzativo o statistico a scelta.
- I dati possono essere esportati come flusso totale o radianza media. Scegli quale variabile è la più rilevante nell'impostazione sperimentale corrente.
- Continuare l'analisi dei dati in accordo con il disegno sperimentale. Si raccomanda il calcolo individuale dei valori (di fondo trattati) come "effetto misurato in un animale".
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Risultati
Generalmente, la radianza misurata varia da magnitudini di 105 a 1010 p/s/cm2/sr. Tuttavia, i valori esatti possono variare tra animali all'interno della stessa immagine e tra immagini diverse. Pertanto, il confronto dei dati grezzi potrebbe essere fuorviante. È fondamentale stabilire segnali di controllo e di fondo in tutti gli esperimenti, rendendo altamente raccomandati i progetti autocontrollati.
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Discussione
Le minacce poste dalle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino (EDC) per la salute umana sono ben riconosciute; tuttavia, la ricerca sugli interferenti endocrini deve affrontare sfide formidabili. Queste sfide sono in parte una conseguenza della complessità del sistema endocrino. È stato identificato che molti interferenti endocrini alterano simultaneamente più sistemi endocrini22. Inoltre, nel contesto dell'economia dell'ormone tiroideo (TH), esiste un ulteriore livello di complessità...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Progetto n. RRF-2.3.1-21-2022-00011, intitolato Laboratorio Nazionale di Neuroscienze Traslazionali, è stato realizzato con il supporto fornito dal Recovery and Resilience Facility dell'Unione Europea nell'ambito del Programma Széchenyi Plan Plus.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 3,5,3'-triiodotironina (T3) | Merck | T2877 | |
| Animali, topi | Topo tailandese | ||
| Gel di protezione degli occhi | Oculotect | 1000 UI/g | |
| Tubo di falco | Thermo Fisher Scientific | 50 mL di volume | |
| Dieta a base di cibo senza iodio | Ricerca Diete | personalizzate | |
| IVIS Lumina II imaging in vivo sistema | Perkin | Elmer-Ketamine | |
| Vetcentre | E1857 | ||
| Living Image software 4.5 | Perkin Elmer-fornito | con lo strumento | |
| Cilindro | 250 mL | ||
| di metimazolo | Merck | M8506 | |
| Provette microfuge | Eppendorf | Per diluire i materiali di trattamento | |
| NaClO4 | Merck | 71852 | |
| Na-luciferina, substrato | Goldbio | 103404-75-7 | |
| NaOH | Merck | 101052833 | |
| Soluzione salina tampone fosfato | Chem Cruz | sc-362302 | |
| Pipetta | Gilson | Per diluire i materiali di trattamento | |
| Puntali per pipette | Axygen | Per diluire i materiali da trattamento | |
| Crema da barba/epilatore/rasoio | Preferenze personali | ||
| Siringa | B Braun | Volume 1 mL | |
| Ago per siringa | B Braun | 0,3 x 12 mm | |
| Xilazina | Vetcentre | E1852 |
Riferimenti
- Larsen, P. R., Davies, T. F., Hay, I. D. Williams Textbook of Endocrinology. Wilson, J. D., Foster, D. W., Kronenberg, H. M., Larsen, P. R. , W.B. Saunders Co. 389-515 (1998).
- Gereben, B., et al. Cellular and molecular basis of deiodinase-regulated thyroid hormone signaling. Endocr Rev. 29 (7), 898-938 (2008).
- Fekete, C., Lechan, R. M. Central regulation of hypothalamic-pituitary-thyroid axis under physiological and pathophysiological conditions. Endocr Rev. 35 (2), 159-194 (2014).
- Bianco, A. C., et al. Paradigms of Dynamic Control of Thyroid Hormone Signaling. Endocr Rev. 40 (4), 1000-1047 (2019).
- Zoeller, R. T. Endocrine disrupting chemicals and thyroid hormone action. Adv Pharmacol. 92, 401-417 (2021).
- Guarnotta, V., Amodei, R., Frasca, F., Aversa, A., Giordano, C. Impact of chemical endocrine disruptors and hormone modulators on the endocrine system. Int J Mol Sci. 23 (10), 5710(2022).
- La Merrill, M. A., et al. Consensus on the key characteristics of endocrine-disrupting chemicals as a basis for hazard identification. Nat Rev Endocrinol. 16 (1), 45-57 (2020).
- Fini, J. B., et al. An in vivo multiwell-based fluorescent screen for monitoring vertebrate thyroid hormone disruption. Environ Sci Technol. 41 (16), 5908-5914 (2007).
- Mughal, B. B., Fini, J. B., Demeneix, B. A. Thyroid-disrupting chemicals and brain development: an update. Endocr Connect. 7 (4), 160-186 (2018).
- Dong, M., Li, Y., Zhu, M., Li, J., Qin, Z. Tetrabromobisphenol a disturbs brain development in both thyroid hormone-dependent and -independent manners in xenopus laevis. Molecules. 27 (1), 249(2021).
- Beck, K. R., Sommer, T. J., Schuster, D., Odermatt, A. Evaluation of tetrabromobisphenol A effects on human glucocorticoid and androgen receptors: A comparison of results from human- with yeast-based in vitro assays. Toxicology. 370, 70-77 (2016).
- Li, J., Li, Y., Zhu, M., Song, S., Qin, Z. A multiwell-based assay for screening thyroid hormone signaling disruptors using thibz expression as a sensitive endpoint in xenopus laevis. Molecules. 27 (3), 798(2022).
- Myosho, T., et al. Preself-feeding medaka fry provides a suitable screening system for in vivo assessment of thyroid hormone-disrupting potential. Environ Sci Technol. 56 (10), 6479-6490 (2022).
- Mohacsik, P., et al. A Transgenic mouse model for detection of tissue-specific thyroid hormone action. Endocrinology. 159 (2), 1159-1171 (2018).
- Sinko, R., et al. Tetrabromobisphenol A and diclazuril evoke tissue-specific changes of thyroid hormone signaling in male thyroid hormone action indicator Mice. Int J Mol Sci. 23 (23), 14782(2022).
- Sinko, R., et al. Different hypothalamic mechanisms control decreased circulating thyroid hormone levels in infection and fasting-induced non-thyroidal illness syndrome in male thyroid hormone action indicator mice. Thyroid. 33 (1), 109-118 (2023).
- Salas-Lucia, F., et al. Axonal T3 uptake and transport can trigger thyroid hormone signaling in the brain. Elife. 12, 82683(2023).
- Liu, S., et al. Triiodothyronine (T3) promotes brown fat hyperplasia via thyroid hormone receptor alpha mediated adipocyte progenitor cell proliferation. Nat Commun. 13 (1), 3394(2022).
- Bianco, A. C., et al. American thyroid association guide to investigating thyroid hormone economy and action in rodent and cell models. Thyroid. 24 (1), 88-168 (2014).
- Silva, J. E., Larsen, P. R. Adrenergic activation of triiodothyronine production in brown adipose tissue. Nature. 305 (5936), 712-713 (1983).
- Bianco, A. C., Silva, J. E. Intracellular conversion of thyroxine to triiodothyronine is required for the optimal thermogenic function of brown adipose tissue. J Clin Invest. 79 (1), 295-300 (1987).
- Caporale, N., et al. From cohorts to molecules: Adverse impacts of endocrine disrupting mixtures. Science. 375 (6582), 8244(2022).
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