Rilevamento del virus SARS-CoV-2 mediante amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa

Sommario

Qui forniamo un protocollo completo per standardizzare e implementare il metodo per rilevare il virus SARS-CoV-2 in campioni umani mediante amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa (RT-LAMP). Questo metodo, eseguito entro 60 minuti, potrebbe essere adattato a qualsiasi laboratorio o punto di cura a basso costo e utilizzando attrezzature poco costose.

Abstract

Il virus della sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ha avuto un impatto drammatico sulla salute umana. Continua a essere una minaccia per la società moderna perché molte persone muoiono a causa dell'infezione. La malattia viene diagnosticata utilizzando test sierologici e molecolari, come la reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-PCR). Quest'ultimo presenta diversi svantaggi perché richiede infrastrutture specializzate, attrezzature costose e personale qualificato. Qui, presentiamo un protocollo che delinea i passaggi necessari per rilevare il virus SARS-CoV-2 utilizzando l'amplificazione isotermica mediata da loop di trascrizione inversa (RT-LAMP) in campioni umani. Il protocollo include istruzioni per la progettazione di primer in silico, la preparazione dei reagenti, l'amplificazione e la visualizzazione. Una volta standardizzato, questo metodo può essere facilmente implementato e adattato a qualsiasi laboratorio o punto di cura entro 60 minuti a basso costo e utilizzando attrezzature poco costose. È adattabile al rilevamento di diversi agenti patogeni. Pertanto, può potenzialmente essere utilizzato sul campo e nei centri sanitari per effettuare una sorveglianza epidemiologica tempestiva.

Introduzione

La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) causa la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19). Il 30 gennaio 2020 l'Organizzazione mondiale della sanità ha dichiarato un'emergenza sanitaria pubblica di rilevanza internazionale e l'11 marzo 2020 una pandemia. La pandemia ha provocato oltre 760 milioni di casi e 6,87 milioni di decessi alla data di stesura di questo articolo¹.

L'impatto di questo virus ha evidenziato la necessità di strumenti di sorveglianza migliori, più accurati, più veloci e più ampiamente disponibili per migliorare l'individuazione e il controllo delle malattie infettive

Protocollo

I campioni utilizzati sono stati forniti dal laboratorio clinico dell'ospedale universitario Fundación Valle del Lili e corrispondevano all'RNA purificato di pazienti risultati positivi al COVID-19 utilizzando la tecnica RT-qPCR. Tutti i pazienti hanno fornito il consenso informato per la ricerca e questo studio è stato approvato dal comitato bioetico per gli studi sull'uomo dell'ospedale universitario Fundación Valle del Lili.

1. Progettazione e preparazione del primer RT-LAMP

NOTA: I primer LAMP possono essere utilizzati con una varietà di piattaforme, tra cui New England BioLabs (NEB) LAMP, Prim....

Risultati

L'implementazione del protocollo inizia con la progettazione del set di primer per ciascun gene bersaglio seguendo il protocollo sopra descritto. Nel giugno 2020, 5.000 genomi di SARS-CoV-2 sono stati ottenuti dal database NextStrain, con una rappresentatività del 10% dei genomi colombiani. Queste sequenze sono state allineate per ottenere la sequenza di consenso utilizzata nel processo di progettazione del primer. La tabella 1 mostra il set di primer scelto per i primer RdRp/Hel e RdRp. Il set di primer.......

Discussione

Sebbene l'RT-LAMP sia considerato una metodologia complementare per l'esecuzione della diagnostica molecolare, presenta anche alcune limitazioni e passaggi critici che devono essere considerati quando il protocollo viene standardizzato e implementato.

La standardizzazione LAMP per la rilevazione di SARS-CoV-2 ha valutato i seguenti parametri e componenti nella miscela master: (a) concentrazione e temperatura di allineamento dei primer; b) concentrazione degli enzimi; c) concentrazione di magne.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 kb Scala DNA	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Negozio a -20 ° C
50x TAE Tampone per elettroforesi	ThermoScientific	B49	Conservare a temperatura ambiente
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	Può essere utilizzato nel caso in cui non sia possibile acquistare la DNA polimerasi Q5 ad alta fedeltà. Per l'enzima, fare aliquote di un volume appropriato e conservare a -20 ° C fino all'uso.
Agarosio	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA polimerasi 8000 UI/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	Per l'enzima, fare aliquote di un volume appropriato e conservare a -20 ° C fino all'uso.
Set di soluzioni di deossinucleotide (dNTP)	New England BioLabs	N0446S	Store a -20 C
Dietilpirocarbonato	Sigma-Aldrich	159220-25G	Maneggiarlo con cautela sotto una cappa di aspirazione
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, pronto all'uso	ThermoScientific	SM0322	Conservare a -20 ° C
Idrossi naftolo blu sale disodico	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 DNA polimerasi ad alta fedeltà 2000 UI/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	Per l'enzima, fare aliquote di un volume appropriato e conservare a -20 gradi; C fino all'uso.
Trascrittasi inversa WarmStart RTx 15000 UI/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	Per l'enzima, fare aliquote di un volume appropriato e conservare a -20 ° C fino all'uso.