Analisi della funzione mitocondriale in un mutante PINK1B9-null di Drosophila melanogaster utilizzando la respirometria ad alta risoluzione

Summary

Qui presentiamo un protocollo di respirometria ad alta risoluzione per analizzare la bioenergetica nei moscerini della frutta mutanti PINK1^B9-null. Il metodo utilizza il protocollo SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).

Abstract

Le malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD), e i disturbi cellulari come il cancro sono alcuni dei disturbi che interrompono il metabolismo energetico con compromissione delle funzioni mitocondriali. I mitocondri sono organelli che controllano sia il metabolismo energetico che i processi cellulari coinvolti nella sopravvivenza e nella morte cellulare. Per questo motivo, gli approcci per valutare la funzione mitocondriale possono offrire importanti informazioni sulle condizioni cellulari nei processi patologici e fisiologici. A questo proposito, i protocolli di respirometria ad alta risoluzione (HRR) consentono di valutare l'intera funzione della catena respiratoria mitocondriale o l'attività di specifici complessi mitocondriali. Inoltre, lo studio della fisiologia mitocondriale e della bioenergetica richiede modelli trattabili geneticamente e sperimentalmente come la Drosophila melanogaster.

Questo modello presenta diversi vantaggi, come la sua somiglianza con la fisiologia umana, il suo rapido ciclo di vita, la facilità di manutenzione, l'economicità, l'elevata capacità di produzione e un numero ridotto di preoccupazioni etiche. Questi attributi lo rendono uno strumento inestimabile per sezionare processi cellulari complessi. Il presente lavoro spiega come analizzare la funzione mitocondriale utilizzando il mutante Drosophila melanogaster PINK1^B9-null. Il gene pink1 è responsabile della codifica della chinasi putativa 1 indotta da PTEN, attraverso un processo riconosciuto come mitofagia, che è cruciale per la rimozione dei mitocondri disfunzionali dalla rete mitocondriale. Le mutazioni di questo gene sono state associate a una forma familiare autosomica recessiva ad esordio precoce di Parkinson. Questo modello può essere utilizzato per studiare la disfunzione mitocondriale coinvolta nella fisiopatologia del Parkinson.

Introduction

I mitocondri sono organelli cellulari che controllano importanti funzioni, tra cui la regolazione apoptotica, l'omeostasi del calcio e la partecipazione a percorsi biosintetici. Possedendo materiale genetico autonomo, sono in grado di contribuire ai processi di mantenimento e riparazione cellulare. La loro struttura ospita la catena di trasporto degli elettroni e la fosforilazione ossidativa, entrambe cruciali per l'energia cellulare ^1,2,3. In particolare, il controllo dell'energia è ottenuto attraverso la produzione di adenosina trifosfato (ATP) tramite fosforilazione ossidativa (OXPHOS)². L'interruzione del metabolismo energetico con compromissione delle funzioni mitocondriali si verifica sia nella sopravvivenza che nella morte cellulare ^4,5, frequentemente associata a un'ampia gamma di patologie umane, come il cancro, e malattie neurodegenerative come il morbo di Parkinson (PD)^3,6.

La malattia di Parkinson è una malattia cronica, progressiva e neurologica. La causa principale di questa malattia è la morte delle cellule cerebrali, in particolare nella substantia nigra, che sono responsabili della produzione del neurotrasmettitore dopamina, che controlla il movimento ^6,7,8. La prima osservazione che collegava il parkinsonismo alla disfunzione mitocondriale è stata fatta nel 1988, in modelli sperimentali che utilizzavano tossine che inibiscono la catena respiratoria Complesso I⁹.

Attualmente, esistono diversi metodi per valutare la disfunzione mitocondriale 10,11,12,1 3; tuttavia, rispetto agli approcci convenzionali, la respirometria ad alta risoluzione (HRR) presenta sensibilità e vantaggi superiori ^13,14. Ad esempio, i protocolli HRR consentono di valutare la funzione dell'intera catena respiratoria mitocondriale o l'attività di specifici complessi mitocondriali^14,15. Le disfunzioni mitocondriali possono essere valutate in cellule intatte, mitocondri isolati o anche ex vivo 10,11,13,14.

Le disfunzioni mitocondriali sono strettamente associate a molti processi patologici e fisiologici. È quindi importante studiare la fisiologia mitocondriale e la bioenergetica utilizzando sistemi modello trattabili geneticamente e sperimentalmente. A questo proposito, la ricerca sulla Drosophila melanogaster, il moscerino della frutta, presenta diversi vantaggi. Questo modello condivide caratteristiche e processi cellulari fondamentali con gli esseri umani, tra cui l'uso del DNA come materiale genetico, organelli comuni e percorsi molecolari conservati coinvolti nello sviluppo, nell'immunità e nella segnalazione cellulare. Inoltre, i moscerini della frutta hanno un ciclo di vita rapido, una facile manutenzione, un basso costo, un'elevata produttività e meno problemi etici, costituendo così uno strumento prezioso per sezionare processi cellulari complessi 16,17,18,19,20.

Inoltre, un omologo del gene putativo chinasi 1 (pink1) indotto da PTEN è espresso in D. melanogaster. Svolge un ruolo cruciale nella rimozione dei mitocondri danneggiati attraverso il processo di mitofagia⁸. Nell'uomo, le mutazioni in questo gene predispongono gli individui a una forma familiare autosomica recessiva di PD associata a disfunzione mitocondriale 8,21,22,23. Di conseguenza, il moscerino della frutta è un potente modello animale per gli studi sulla fisiopatologia della malattia di Parkinson e lo screening di candidati farmaci incentrati sulla disfunzione mitocondriale e sulla bioenergetica. Pertanto, il presente lavoro spiega come analizzare la funzione mitocondriale in un modello di PD da D. melanogaster utilizzando la tecnica HRR in OROBOROS con il protocollo Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration (SUIT).

Protocol

Abbiamo usato i ceppi w¹¹¹⁸ (bianco) e w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (indicato come Pink1^B9) (ID FlyBase: FBgn0029891) dal centro di stoccaggio di Bloomington Drosophila (numero ID: 34749). In questo studio, i mutanti maschi di D. melanogaster PINK1^B9-null sono stati confrontati con i maschi di D. melanogaster del ceppo w¹¹¹⁸, che viene utilizzato come gruppo di controllo (background genetico). Altri parametri devono essere analizzati in concomitanza con gli esperimenti di respirometria per garantire che i moscerini abbiano il genotipo corretto (Pink1^B9/Y), come le deformità del torace e i problemi di locomozione, che sono ben descritti per i moscerini mutanti pink1^B9 24,25,26.

1. Animali e stabulazione

1. Conservare le mosche in bottiglie di vetro contenenti 10 ml di dieta standard (lievito 1,73%, farina di soia 0,9%, farina di mais 7,3%, agar 0,5%, sciroppo di mais 7,6% e acido propionico 0,48%) a temperatura e umidità costanti (rispettivamente 25 °C e 60%), con un ciclo luce/buio di 12 ore:12 ore.
2. Per ogni esperimento, utilizzare due mosche invecchiate 1-3 giorni dopo l'eclusione.
   NOTA: Le femmine vergini mutanti PINK1^B9-null sono state incrociate con maschi w¹¹¹⁸ per ottenere i maschi F1 con genotipo Pink1^B9/Y.

2. Preparazione del campione

1. Preparare il buffer MiR05 come descritto nella Tabella 1.
2. Anestetizzare le mosche su ghiaccio e trasferirle in provette per microcentrifuga (due mosche per provetta).
3. In ogni provetta, aggiungere 200 μL di tampone MiR05 refrigerato e omogeneizzare le mosche. Omogeneizzare manualmente, applicando una leggera pressione (circa 4-6 colpi del pestello) per evitare la disintegrazione dei mitocondri.

3. Calibrazione respirometrica ad alta risoluzione di sensori di ossigeno polarografici

NOTA: Le camere OROBOROS hanno un volume totale di circa 2 ml. La calibrazione è necessaria per garantire che il flusso di ossigeno sia vicino a 0 pmol per avviare il test.

1. Avviando la calibrazione, aggiungere 2 mL di MiR05 alla camera. Coprire la camera con il tappo senza lasciare bolle d'aria; Quindi, tirare con cautela il tappo per formare un'unica bolla d'aria.
2. Aprire il software OROBOROS Dat.Lab. Immettere una temperatura di 25 °C nel campo Temperatura blocco e fare clic su Connetti a Oxygraph-2k (Figura 1A).
3. Fare clic e selezionare la cartella in cui salvare la calibrazione e fare clic su Salva.
4. Quando si apre una nuova finestra, assegna un nome all'esperimento e ai campioni (se stai calibrando, inserisci semplicemente il nome calibrazione) e fai clic su Salva.
5. Andare al menu Layout e scegliere la prima opzione: 01 Calibrazione Exp. Gr.3 - Temp come mostrato in Figura 1B.
6. Attendere che il programma venga reindirizzato al layout di calibrazione, attendere che la linea rossa mostri una linea retta standard con punti intorno a 0 pmol. Quindi, selezionare due punti: uno per la camera A e l'altro per la camera B (Figura 1C) quando la linea rossa è esattamente a zero.
   NOTA: I punti selezionati devono avere un flusso di ossigeno (linea rossa) intorno a 0.
   1. Per contrassegnare i punti di entrambe le camere, selezionare la concentrazione di O₂ a destra dello schermo, selezionare il punto contrassegnato e copiare sia i valori di temperatura che di pressione atmosferica relativi al punto. Incollare questi valori nelle caselle sottostanti e fare clic su Calibra e copia negli Appunti nell'angolo in basso a destra dello schermo, come mostrato nella Figura 2.
   2. Eseguire questa procedura per entrambe le camere (A e B), quindi accedere al menu File e selezionare Salva e disconnetti.
      NOTA: Dopo il processo di calibrazione, il programma reindirizzerà l'utente alla schermata iniziale in modo che il software sia pronto per avviare il test HRR. Per questo test, utilizzeremo il protocollo SUIT.

4. Protocollo SUIT

1. Al termine della calibrazione, rimuovere i tappi e aprire le camere.
2. Lavare i tappi (tenendo la punta che non tocca il campione) e le camere con etanolo al 100%, etanolo al 70% e acqua distillata, in quest'ordine.
   NOTA: Ripetere il processo per ogni cambio di campione.
3. Omogeneizzare le mosche in 200 μL di tampone, posizionare tutto il contenuto del campione nella camera utilizzando una micropipetta e riposizionare il tappo nella camera, facendo attenzione a non creare bolle d'aria.
   NOTA: Se si formano bolle d'aria, rimuovere delicatamente il tappo e aggiungere 100 μL di tampone MIR05.
4. Fare clic sul menu Layout e selezionare l'opzione 05 Flusso per volume corretto, come mostrato nella Figura 1B.
5. Attendi di essere reindirizzato a una nuova finestra. Fare clic su Salva per selezionare la cartella in cui salvare l'esperimento.
6. Attendi l'apertura di un'altra nuova finestra. Assegna all'esperimento un nome nello spazio Codice sperimentale. Quindi, assegnare un nome a ciascun campione nelle rispettive camere A e B nel campo Campione e impostare il campo Unità su unità.
   NOTA: È possibile scegliere anche altre unità, ad esempio Milioni di cellule o mg.
7. Considerando che questo protocollo utilizza due mosche (2 unità) e il volume della camera è di 2 mL, nel campo Concentrazione , definirne 1 per mL (Figura 1D).
   NOTA: In questo caso, la quantità del campione è stata normalizzata in base al numero di mosche; tuttavia, questa normalizzazione può essere eseguita dal contenuto proteico del campione, dalla quantificazione del DNA mitocondriale o dall'attività della citrato sintasi.
8. Quando il segnale del flusso di ossigeno (linea rossa) è fisso sul valore positivo, avviare il protocollo HRR con la titolazione di substrati, inibitori e disaccoppiatori (Figura 3). Tutti i reagenti e le apparecchiature successive sono riportati nella Tabella 1.
   1. Aggiungere digitonina (5 μg/mL) per permeabilizzare la membrana mitocondriale.
   2. Aggiungere substrati di piruvato (5 mM), malato (2 mM) e prolina (10 mM) e attendere che il flusso di ossigeno aumenti e si stabilizzi. Per contrassegnare l'evento per ogni aggiunta di reagente, premere il tasto F4 sulla tastiera e immettere il nome di ciascun reagente.
   3. Aggiungere ADP (5mM) per accoppiare la catena respiratoria mitocondriale e attendere l'aumento e la stabilizzazione del flusso di ossigeno.
   4. Aggiungere il succinato (10 mM) e attendere l'aumento e la stabilizzazione del flusso di ossigeno.
   5. Aggiungi l'oligomicina (2,5 μM) per inibire l'ATP sintasi e cerca una diminuzione del flusso di ossigeno.
   6. Attendere che la linea rossa si stabilizzi e disaccoppiare il trasferimento di elettroni mitocondriale utilizzando il cianuro di carbonil-4-(trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP) con titoli di 0,25 μM fino a raggiungere il massimo consumo di ossigeno, dimostrato dall'aumento della linea rossa. Dopo aver stabilizzato il flusso di ossigeno, iniziare ad aggiungere gli inibitori di ciascun complesso, uno alla volta.
   7. Aggiungere Rotenone (0,5 μM), un inibitore del complesso I. Attendere la diminuzione e la stabilizzazione del flusso di ossigeno per aggiungere l'inibitore successivo.
   8. Aggiungere malonato (5 mM), un inibitore del complesso II. Attendere la diminuzione e la stabilizzazione del flusso di ossigeno per aggiungere l'inibitore successivo.
   9. Infine, aggiungere l'antimicina (2,5 μM), un inibitore del complesso III. Attendere la diminuzione seguita dall'aumento e dalla stabilizzazione del flusso di ossigeno.
      NOTA: Il flusso di ossigeno dovrebbe stabilizzarsi a un valore positivo ma inferiore al valore dell'ultima inibizione dei complessi proteici mitocondriali.
9. Al termine dell'analisi, rimuovere tutto il contenuto delle camere utilizzando una micropipetta. Conservare a -20 °C per analisi future, se necessario.

5. Analisi dei dati

1. Utilizzare un pacchetto software statistico appropriato per l'analisi dei dati.
2. Eseguire test t per valutare le differenze tra i due gruppi. Per le situazioni che coinvolgono più trattamenti, utilizzare l'analisi della varianza (ANOVA) come test statistico ²⁷.
3. Estrarre i valori di flusso di O₂ dal grafico generato dal software. OXPHOS CI si riferisce al valore del flusso di O₂ dopo l'aggiunta di ADP. OXPHOS CII si ottiene sottraendo OXPHOS CI&CII - OXPHOS CI. OXPHOS CI&CII è il valore del flusso di O₂ estratto dopo l'aggiunta di succinato. ETS CI&CII è il valore di flusso di O₂ dopo l'aggiunta di FCCP. ETS CI = FCCP - Rotenone e ETS CII = Rotenone - Malonato.
4. Calcolare la sintesi di ATP come differenza tra OXPHOS (P) e LEAK (L) (P - L⁾²⁸.
5. Determinare il Respiratory Control Ratio (RCR) calcolando il rapporto OXPHOS/LEAK, dove RCR = P/^L.11

Results

Qui, abbiamo che il flusso di O₂ negli stati OXPHOS CI (P = 0,0341) e OXPHOS CI&II (P = 0,0392) è ridotto nei moscerini nulli PINK1^B9 rispetto ai moscerini di controllo (Figura 4). Questo risultato è stato osservato anche nei risultati precedenti del nostro gruppo^29,30.

CI e CII sono componenti chiave del sistema di trasporto degli elettroni (ETS), in cui...

Discussion

L'HRR è una potente tecnica per studiare la respirazione mitocondriale e il metabolismo energetico in D. melanogaster e in altri organismi. Fornisce una valutazione dettagliata e quantitativa della funzione mitocondriale, consentendo ai ricercatori di ottenere informazioni sulla bioenergetica delle cellule. Il protocollo qui presentato descrive la valutazione della funzione della catena respiratoria mitocondriale e l'attività di specifici complessi mitocondriali utilizzando il protocollo SUIT in D. melanogas...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ADP	Sigma-Aldrich	A5285	Adenosina 5′-difosfato sodio sal (numero CAS 72696-48-1); 95%; peso molecolare = 501,31 g/mol.
Á gar	Kasv	K25-1800	Per uso batteriologico
Antimicina-A	Sigma-Aldrich	A8674	Antimicina A da Streptomyces sp. (numero CAS 1397-94-0); peso molecolare  540 g/mol;
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	Albumina sierica bovina (numero CAS 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98%
Software Datlab	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20700	Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati
Digitonin	Sigma-Aldrich	D 5628	Numero CAS 11024-24-1
Acqua
distillataDrosophila melanogaster ceppo w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3			Ottenuto dal centro di stoccaggio di Bloomington Drosophila
Drosophila melanogaster ceppo  w1118			Ottenuto  dall'Università Federale di Santa Maria
EGTA	Sigma-Aldrich	E8145	Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (numero CAS 13638-13-3); 97%; peso molecolare = 468,28 g/mol
FCCP	Sigma-Aldrich	C2920 C2920	Cianuro di carbonile 4- (trifluorometossi)fenilidrazone  (numero CAS 370-86-5); ≥ 98% (TLC), polvere
GraphPad Prism versione 8.0.1.			Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico acido (numero CAS 7365-45-9); 99,5% (titolazione), testato in coltura cellulare; peso molecolare = 238,30 g/mol
Respirometro ad alta risoluzione Oxygraph O2K	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	10022-02	Kit respirometro O2K di avvio
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P5379	Fosfato monopotassico (numero CAS 7778-77-0); Reagente Plus, peso molecolare = 136,09 g/mol
KOH	Sigma-Aldrich	211473	Idrossido di potassio (numero CAS 1310-58-3); Reagente ACS, ≥ 85%, pellet
di acido malato	Sigma-Aldrich	M1296	malonico (numero CAS 141-82-2); 99%, peso molecolare = 104,06 g/mol). Una soluzione viene regolata a pH a circa 7,0.
Acido malico	Sigma-Aldrich	M1000	(S)-(&meno;)acido -2-idrossisuccinico (numero CAS 97-67-6); ≥ 95% ; peso molecolare = 134,09 g/mol
MES	Sigma-Aldrich	M3671	acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (numero CAS 4432-31-9); 99% (titolazione); peso molecolare = 195,24 g/mol
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Cloruro di magnesio (numero CAS 7786-30-3); anidro, ≥ 98%, peso molecolare = 95,21 g/mol
Provette per microcentrifuga	Eppendorf
O2K-Titration Set	Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria	20820-03	Siringhe Hamilton con volumi diversi
Oligomicina	Sigma-Aldrich	O 4876	Oligomicina da  Streptomyces diastatochromogenes (numero CAS  1404-19-9); ≥ 90% oligomicine totali (HPLC)
Pistillo all'omogeneizzazione
Prolina	Sigma-Aldrich	P0380	L-Prolina (numero CAS 147-85-3); polvere; 99%; peso molecolare = 115,13 g/mol
Piruvato	Sigma-Aldrich	P2256	Piruvato di sodio (numero CAS 113-24-6), ≥ 99%; peso molecolare = 110,04 g/mol
Rotenone	Sigma-Aldrich	R8875	Rotetone (numero CAS 83-79-4); 95%, peso molecolare 394,42 g/mol
Succinato	Sigma-Aldrich	S 2378	Succinato di sodio bibasico esaidrato (numero CAS 6106-21-4); 99%
Saccarosio	Merck	107.651.000	Saccarosio per uso microbiologico (numero CAS 57-50-1)
Taurina	Sigma-Aldrich	T0625	Numero CAS 107-35-7