Qui presentiamo un protocollo di respirometria ad alta risoluzione per analizzare la bioenergetica nei moscerini della frutta mutanti PINK1B9-null. Il metodo utilizza il protocollo SUIT (Substrate-Uncoupler-Inhibitor-Titration).
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Articolo metodologico
Analisi della funzione mitocondriale in un mutante PINK1B9-null di Drosophila melanogaster utilizzando la respirometria ad alta risoluzione
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le malattie neurodegenerative, tra cui il morbo di Parkinson (PD), e i disturbi cellulari come il cancro sono alcuni dei disturbi che interrompono il metabolismo energetico con compromissione delle funzioni mitocondriali. I mitocondri sono organelli che controllano sia il metabolismo energetico che i processi cellulari coinvolti nella sopravvivenza e nella morte cellulare. Per questo motivo, gli approcci per valutare la funzione mitocondriale possono offrire importanti informazioni sulle condizioni cellulari nei processi patologici e fisiologici. A questo proposito, i protocolli di respirometria ad alta risoluzione (HRR) consentono di valutare l'intera funzione della catena respiratoria mitocondriale o l'attività di specifici complessi mitocondriali. Inoltre, lo studio della fisiologia mitocondriale e della bioenergetica richiede modelli trattabili geneticamente e sperimentalmente come la Drosophila melanogaster.
Questo modello presenta diversi vantaggi, come la sua somiglianza con la fisiologia umana, il suo rapido ciclo di vita, la facilità di manutenzione, l'economicità, l'elevata capacità di produzione e un numero ridotto di preoccupazioni etiche. Questi attributi lo rendono uno strumento inestimabile per sezionare processi cellulari complessi. Il presente lavoro spiega come analizzare la funzione mitocondriale utilizzando il mutante Drosophila melanogaster PINK1B9-null. Il gene pink1 è responsabile della codifica della chinasi putativa 1 indotta da PTEN, attraverso un processo riconosciuto come mitofagia, che è cruciale per la rimozione dei mitocondri disfunzionali dalla rete mitocondriale. Le mutazioni di questo gene sono state associate a una forma familiare autosomica recessiva ad esordio precoce di Parkinson. Questo modello può essere utilizzato per studiare la disfunzione mitocondriale coinvolta nella fisiopatologia del Parkinson.
Introduzione
I mitocondri sono organelli cellulari che controllano importanti funzioni, tra cui la regolazione apoptotica, l'omeostasi del calcio e la partecipazione a percorsi biosintetici. Possedendo materiale genetico autonomo, sono in grado di contribuire ai processi di mantenimento e riparazione cellulare. La loro struttura ospita la catena di trasporto degli elettroni e la fosforilazione ossidativa, entrambe cruciali per l'energia cellulare 1,2,3. In particolare, il controllo dell'energia è ottenuto attraverso la produzione di adenosina trifosfato (ATP) tramite fosforilazione ossida....
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Protocollo
Abbiamo usato i ceppi w1118 (bianco) e w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 (indicato come Pink1B9) (ID FlyBase: FBgn0029891) dal centro di stoccaggio di Bloomington Drosophila (numero ID: 34749). In questo studio, i mutanti maschi di D. melanogaster PINK1B9-null sono stati confrontati con i maschi di D. melanogaster del ceppo w1118, che viene utilizzato come gruppo di controllo (background genetico). Altri parametri devono essere analizzati in concomitanza con gli esperimenti di respirometria per garantire che i moscerini abbiano il genotipo corretto (Pink1B9/Y), ....
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Risultati
Qui, abbiamo che il flusso di O2 negli stati OXPHOS CI (P = 0,0341) e OXPHOS CI&II (P = 0,0392) è ridotto nei moscerini nulli PINK1B9 rispetto ai moscerini di controllo (Figura 4). Questo risultato è stato osservato anche nei risultati precedenti del nostro gruppo29,30.
CI e CII sono componenti chiave del sistema di trasporto degli elettroni (ETS), in cui.......
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Discussione
L'HRR è una potente tecnica per studiare la respirazione mitocondriale e il metabolismo energetico in D. melanogaster e in altri organismi. Fornisce una valutazione dettagliata e quantitativa della funzione mitocondriale, consentendo ai ricercatori di ottenere informazioni sulla bioenergetica delle cellule. Il protocollo qui presentato descrive la valutazione della funzione della catena respiratoria mitocondriale e l'attività di specifici complessi mitocondriali utilizzando il protocollo SUIT in D. melanogas.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano l'agenzia brasiliana Coordenação de Aperfeiçoamento de Pesquisa Pessoal de Nível Superior (CAPES EPIDEMIAS 09 #88887.505377/2020). P.M. (#88887.512821/2020-00) e T.D. (#88887.512883/2020-00) sono beneficiari di assegni di ricerca.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma-Aldrich | A5285 | Adenosina 5′-difosfato sodio sal (numero CAS 72696-48-1); 95%; peso molecolare = 501,31 g/mol. |
| Á gar | Kasv | K25-1800 | Per uso batteriologico |
| Antimicina-A | Sigma-Aldrich | A8674 | Antimicina A da Streptomyces sp. (numero CAS 1397-94-0); peso molecolare 540 g/mol; |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A7030 | Albumina sierica bovina (numero CAS 9048-46-8); pH 7,0 ≥ 98% |
| Software Datlab | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20700 | Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D 5628 | Numero CAS 11024-24-1 |
| Acqua | |||
| distillataDrosophila melanogaster ceppo w[*] Pink1[B9]/FM7i, P{w[+mC]=ActGFP}JMR3 | Ottenuto dal centro di stoccaggio di Bloomington Drosophila | ||
| Drosophila melanogaster ceppo w1118 | Ottenuto dall'Università Federale di Santa Maria | ||
| EGTA | Sigma-Aldrich | E8145 | Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (numero CAS 13638-13-3); 97%; peso molecolare = 468,28 g/mol |
| FCCP | Sigma-Aldrich | C2920 C2920 | Cianuro di carbonile 4- (trifluorometossi)fenilidrazone (numero CAS 370-86-5); ≥ 98% (TLC), polvere |
| GraphPad Prism versione 8.0.1. | Software per l'acquisizione e l'analisi dei dati | ||
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etansolfonico acido (numero CAS 7365-45-9); 99,5% (titolazione), testato in coltura cellulare; peso molecolare = 238,30 g/mol |
| Respirometro ad alta risoluzione Oxygraph O2K | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 10022-02 | Kit respirometro O2K di avvio |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5379 | Fosfato monopotassico (numero CAS 7778-77-0); Reagente Plus, peso molecolare = 136,09 g/mol |
| KOH | Sigma-Aldrich | 211473 | Idrossido di potassio (numero CAS 1310-58-3); Reagente ACS, ≥ 85%, pellet |
| di acido malato | Sigma-Aldrich | M1296 | malonico (numero CAS 141-82-2); 99%, peso molecolare = 104,06 g/mol). Una soluzione viene regolata a pH a circa 7,0. |
| Acido malico | Sigma-Aldrich | M1000 | (S)-(&meno;)acido -2-idrossisuccinico (numero CAS 97-67-6); ≥ 95% ; peso molecolare = 134,09 g/mol |
| MES | Sigma-Aldrich | M3671 | acido 2-(N-morfolino)etansolfonico (numero CAS 4432-31-9); 99% (titolazione); peso molecolare = 195,24 g/mol |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | Cloruro di magnesio (numero CAS 7786-30-3); anidro, ≥ 98%, peso molecolare = 95,21 g/mol |
| Provette per microcentrifuga | Eppendorf | ||
| O2K-Titration Set | Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria | 20820-03 | Siringhe Hamilton con volumi diversi |
| Oligomicina | Sigma-Aldrich | O 4876 | Oligomicina da Streptomyces diastatochromogenes (numero CAS 1404-19-9); ≥ 90% oligomicine totali (HPLC) |
| Pistillo all'omogeneizzazione | |||
| Prolina | Sigma-Aldrich | P0380 | L-Prolina (numero CAS 147-85-3); polvere; 99%; peso molecolare = 115,13 g/mol |
| Piruvato | Sigma-Aldrich | P2256 | Piruvato di sodio (numero CAS 113-24-6), ≥ 99%; peso molecolare = 110,04 g/mol |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | Rotetone (numero CAS 83-79-4); 95%, peso molecolare 394,42 g/mol |
| Succinato | Sigma-Aldrich | S 2378 | Succinato di sodio bibasico esaidrato (numero CAS 6106-21-4); 99% |
| Saccarosio | Merck | 107.651.000 | Saccarosio per uso microbiologico (numero CAS 57-50-1) |
| Taurina | Sigma-Aldrich | T0625 | Numero CAS 107-35-7 |
Riferimenti
- Brand, M. D., Orr, A. L., Perevoshchikova, I. V., Quinlan, C. L. The role mitochondrial function and cellular bioenergetics in ageing and disease. Br J Dermatol. 169, 1-8 (2013).
- Ramaccini, D., et al. Mitochondrial function and dysfunction in dilated cardi....
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Ristampe e permessi
