Un sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per un sistema di coltura cellulare automatizzato. Questo sistema di coltura automatizzato riduce il lavoro e avvantaggia gli utenti, compresi i ricercatori che non hanno familiarità con la manipolazione delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), dal mantenimento delle cellule iPS alla differenziazione in vari tipi di cellule.

Abstract

Ci si aspetta che le cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC) con capacità infinita di autoproliferazione abbiano applicazioni in numerosi campi, tra cui la delucidazione delle patologie delle malattie rare, lo sviluppo di nuovi farmaci e la medicina rigenerativa che mira a ripristinare gli organi danneggiati. Ciononostante, l'implementazione sociale delle hiPSC è ancora limitata. Ciò è in parte dovuto alla difficoltà di riprodurre la differenziazione in coltura, anche con conoscenze avanzate e sofisticate competenze tecniche, a causa dell'elevata sensibilità delle iPSC ai minimi cambiamenti ambientali. L'applicazione di un sistema di coltura automatizzato può risolvere questo problema. Esperimenti con un'elevata riproducibilità indipendente dall'abilità di un ricercatore possono essere previsti secondo una procedura condivisa tra vari istituti. Sebbene in precedenza siano stati sviluppati diversi sistemi di coltura automatizzati in grado di mantenere le colture di iPSC e indurre la differenziazione, questi sistemi sono pesanti, grandi e costosi perché fanno uso di bracci robotici umanizzati e multi-articolati. Per migliorare i problemi di cui sopra, abbiamo sviluppato un nuovo sistema che utilizza un semplice sistema di guide di scorrimento dell'asse x-y-z, che consente di essere più compatto, più leggero e più economico. Inoltre, l'utente può facilmente modificare i parametri nel nuovo sistema per sviluppare nuove attività di movimentazione. Una volta stabilita un'attività, tutto ciò che l'utente deve fare è preparare l'iPSC, fornire in anticipo i reagenti e i materiali di consumo necessari per l'attività desiderata, selezionare il numero dell'attività e specificare l'ora. Abbiamo confermato che il sistema potrebbe mantenere le iPSC in uno stato indifferenziato attraverso diversi passaggi senza cellule feeder e differenziarsi in vari tipi di cellule, tra cui cardiomiociti, epatociti, progenitori neurali e cheratinociti. Il sistema consentirà esperimenti altamente riproducibili tra le istituzioni senza la necessità di ricercatori qualificati e faciliterà l'implementazione sociale delle hiPSC in una gamma più ampia di campi di ricerca, diminuendo gli ostacoli per i nuovi ingressi.

Introduzione

Questo articolo ha lo scopo di fornire procedure di gestione effettive e dettagliate per un sistema di coltura automatizzato per cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC), che abbiamo prodotto collaborando con un'azienda, e di mostrare risultati rappresentativi.

Dalla pubblicazione dell'articolo nel 2007, l'iPSC ha attirato l'attenzione di tutto il mondo¹. A causa della sua maggiore caratteristica di essere in grado di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula somatica, ci si aspetta che venga applicato in vari campi come la medicina rigenerativa, chiarendo le cause delle malattie intrattabili e sviluppando nuovi farmaci terapeutici ^2,3. Inoltre, l'utilizzo di cellule somatiche umane derivate da iPSC potrebbe ridurre gli esperimenti sugli animali, che sono soggetti a significative restrizioni etiche. Sebbene siano costantemente necessarie numerose iPSC omogenee per la ricerca di nuovi metodi con le iPSC, è troppo laborioso gestirle. Inoltre, la gestione dell'iPSC è difficile a causa della sua elevata sensibilità, anche a sottili cambiamenti culturali e ambientali.

Per risolvere questo problema, ci si aspetta che i sistemi di coltura automatizzati eseguano attività al posto degli esseri umani. Alcuni gruppi hanno sviluppato alcuni sistemi automatizzati di coltura di cellule staminali pluripotenti umane per il mantenimento e la differenziazione cellulare e hanno pubblicato i loro risultati ^4,5,6. Questi sistemi equipaggiano uno o più bracci robotici multiarticolati. I bracci robotici non hanno solo il merito di imitare fortemente i movimenti del braccio umano, ma anche il demerito in quanto richiedono costi più elevati per il braccio (o i bracci), un imballaggio del sistema più grande e più pesante e sforzi di formazione che richiedono tempo da parte degli ingegneri per ottenere i movimenti mirati ^7,8. Al fine di facilitare l'introduzione dell'apparato in un maggior numero di strutture di ricerca nei punti di consumo economico, spaziale e delle risorse umane, abbiamo sviluppato un nuovo sistema di coltura automatizzato per il mantenimento e la differenziazione delle iPSC in vari tipi di cellule⁹.

La nostra logica per il nuovo sistema era quella di adottare un sistema di binari ad assi X-Y-Z invece di bracci robotici multiarticolati⁹. Per sostituire le complesse funzioni simili a quelle di una mano dei bracci robotici, abbiamo applicato una nuova idea a questo sistema, in grado di modificare automaticamente tre tipi di punte funzionali specifiche del braccio. Qui, indichiamo anche come gli utenti possono facilmente creare pianificazioni delle attività con semplici ordini sul software a causa della mancanza di requisiti per i contributi degli ingegneri durante tutto il processo.

Uno dei sistemi di coltura robotica ha dimostrato la realizzazione di corpi embrioidi utilizzando piastre a 96 pozzetti come aggregati cellulari 3D per la differenziazione⁴. Il sistema qui riportato non è in grado di gestire piastre a 96 pozzetti. Uno ha ottenuto l'attuale grado di buone pratiche di fabbricazione (cGMP) utilizzando una linea cellulare, sebbene non fosse una cellula staminale pluripotente umana⁵. Il sistema di coltura automatizzato qui descritto è stato ora sviluppato con l'obiettivo specifico di aiutare gli esperimenti di laboratorio (Figura 1). Tuttavia, dispone di sistemi sufficienti per mantenere puliti livelli equivalenti a quelli di un armadio di sicurezza di livello IV.

Protocollo

Il Comitato Etico dell'Università di Medicina del Kansai ha approvato la generazione e l'uso delle iPSC sane derivate da volontari denominate KMUR001 (approvazione n. 2020197). Il donatore, che è stato reclutato apertamente, ha fornito un consenso informato formale e ha accettato l'uso scientifico delle cellule.

NOTA: L'interfaccia corrente (il software speciale denominato "ccssHMI" in esecuzione con il sistema operativo Windows XP) è la schermata operativa fondamentale. Sotto la suddetta interfaccia, sono disposte una serie di schede, che consentono agli utenti di avviare varie operazioni.

1. Operazioni di carico

1. Fare clic sul pulsante Caricamento nella schermata superiore del software. Fare clic sul pulsante Avvio preparazione caricamento .
2. Posizionare il/i piatto/i o il/i piatto/i da inserire nell'apparecchio in posizione nell'apparecchio.
   NOTA: Le informazioni necessarie per l'identificazione del piatto devono essere scritte su ciascun coperchio.
3. Chiudere manualmente il finestrino anteriore scorrevole e premere il pulsante meccanico di conferma di sicurezza.
4. Selezionare il tipo e la quantità di piatti o piatti nel software.
5. Fare clic sul pulsante Preparazione caricamento completata . Fare clic sul pulsante Avvio caricamento .
6. Dopo che una parabola è stata caricata nel sistema, selezionare le informazioni sulla parabola, ad esempio con celle iPS o senza celle iPS, sul software. Registra le note su ogni piatto nel software.
7. Fare clic sul pulsante Registrazione alla fine per completare l'operazione di caricamento.

2. Operazione di scarico

1. Fare clic sul pulsante Scarica nella schermata superiore del software. Selezionare il/i piatto/i da rimuovere nel software.
2. Dopo aver selezionato il/i piatto/i, fare clic sul pulsante Avvio preparazione scarico . Fare clic sul pulsante Avvio scarico .
3. Dopo che i piatti sono stati trasferiti dall'incubatrice al banco di lavoro nel sistema, premere il pulsante Rimozione piatto .
4. Aprire manualmente il finestrino scorrevole anteriore ed estrarre il/i piatto/i. Chiudere manualmente il finestrino anteriore scorrevole e premere il pulsante meccanico di conferma di sicurezza.

3. Supplemento di materiali di consumo: pipette, provette e fluidi

1. Per rifornire materiali di consumo come pipette, provette e fluidi, fare clic sul pulsante Materiali di consumo nella schermata superiore del software, quindi selezionare l'articolo da rifornire.
   1. Pipette
      1. Fare clic sul pulsante Pipettatrice . Seleziona il pulsante Rifornisci .
      2. Selezionare un rack che l'utente desidera rifornire nel software. Fare clic sul pulsante Rifornisci inizio .
      3. Dopo aver verificato che il coperchio dell'area di conservazione delle pipette sul banco di lavoro sia aperto, aprire manualmente la finestra scorrevole anteriore e riempire le pipette secondo necessità.
      4. Chiudere manualmente il finestrino anteriore scorrevole e premere il pulsante meccanico di conferma di sicurezza. Fare clic sul pulsante Rifornimento completato .
      5. Fare clic sul pulsante Impostazione rifornimento e immettere le informazioni per il rifornimento, quindi fare clic sul pulsante Registrazione .
      6. Fare clic sul pulsante Rifornimento completato .
   2. Tubi
      1. Fare clic sul pulsante Tubo . Seleziona il pulsante Rifornisci .
      2. Selezionare un rack che l'utente desidera rifornire nel software. Fare clic sul pulsante Rifornisci inizio .
      3. Dopo aver verificato che il rack si è spostato in alto, fare clic sul pulsante Rifornisci provetta .
      4. Aprire manualmente il finestrino scorrevole anteriore e riempire i tubi secondo necessità.
      5. Chiudere manualmente il finestrino anteriore scorrevole e premere il pulsante meccanico di conferma di sicurezza.
      6. Fare clic sul pulsante Rifornimento completato .
      7. Fare clic sul pulsante Impostazione rifornimento e immettere le informazioni per il rifornimento, quindi fare clic sul pulsante Registrazione . Fare clic sul pulsante Chiudi .
   3. Medio
      1. Fare clic sul pulsante Medio . Seleziona il pulsante Rifornisci nel software.
      2. Selezionare uno dei tre rack che gli utenti desiderano rifornire. Fare clic sul pulsante Rifornisci inizio .
      3. Dopo aver verificato che il coperchio dell'area di stoccaggio del mezzo è stato aperto, aprire manualmente il finestrino scorrevole anteriore e riempire il fluido.
      4. Chiudere manualmente il finestrino anteriore scorrevole e premere il pulsante meccanico di conferma di sicurezza.
      5. Fare clic sul pulsante Rifornimento completato .
      6. Fare clic sul pulsante Rifornisci e immettere le informazioni relative al supporto, inclusi il nome e la quantità del supporto. Se necessario, immettere ulteriori commenti.
      7. Fare clic sul pulsante Registrazione .
      8. Fare clic sul pulsante Chiudi .

4. Selezione dell'attività

1. Fare clic sul pulsante Attività nella schermata superiore del software.
2. Selezionare il pulsante Impostazione attività . Selezionare l'attività desiderata dall'elenco delle attività e fare clic sul pulsante Passaggio successivo .
3. Specificare la data e l'ora in cui eseguire l'attività, quindi fare clic sul pulsante Registrazione . Selezionare un piatto o un piatto per eseguire l'attività, quindi fare clic sul pulsante Registrazione .
4. Dopo aver riconfermato l'attività selezionata, fare clic sul pulsante Registrazione . Verificare che l'attività sia stata registrata nella schermata successiva.
5. Se necessario, impostare l'attività successiva nello stesso modo.
6. Fare clic sul pulsante Avvia alla fine. Quindi, l'attività verrà avviata automaticamente alla data e all'ora specificate.
   NOTA: Subito dopo aver terminato ogni attività, le luci UV (situate su due lati della cappa) si accendono automaticamente e dopo 5-30 minuti, in conformità con l'impostazione ausiliaria, si spengono per mantenere la cappa in condizioni asettiche. Per interrompere, gli utenti possono fare clic sul pulsante Start .
7. Se gli utenti desiderano annullare un'attività pianificata in anticipo, fare clic sul pulsante Interrompi .
8. Dopo aver selezionato l'attività da interrompere, fare clic sul pulsante Modifica attività .
9. Fare clic sul pulsante Annulla attività . Verificare che l'attività sia stata eliminata nella schermata successiva.

5. Controlla le immagini delle celle

1. Ogni attività include osservazioni microscopiche (scattare foto) prima e dopo il lavoro di attività. Osservare fotograficamente i progressi della coltura cellulare incorporando un'attività di fotografia microscopica prima o dopo ogni attività.
2. Seleziona programmi di attività preimpostati, inclusa la selezione anticipata di più posizioni specifiche della piastra o della piastra del pozzetto per l'osservazione a punto fisso per monitorare la stessa posizione nel tempo.

6. Passage e differenziazione

1. Seguire i passaggi nelle sezioni 1-5 e impostare il sistema di coltura cellulare automatizzato per eseguire il passaggio e la differenziazione. Le impostazioni dello strumento per il passaging, la differenziazione dei cardiomiociti, la differenziazione degli epatociti, la differenziazione delle cellule precursori neurali e la differenziazione dei cheratinociti sono mostrate rispettivamente nella Tabella 1, Tabella 2, Tabella 3, Tabella 4 e Tabella 5.

Risultati

Mantenimento di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo
Abbiamo utilizzato tre linee hPSC (RIKEN-2F, 253G1 e KMUR001). Abbiamo ottimizzato il protocollo di manutenzione attraverso esperimenti giornalieri eseguiti manualmente e ulteriormente ottimizzato i programmi dettagliati attraverso i sette esperimenti preliminari eseguiti dal sistema. Ad esempio, le sollecitazioni di taglio causate dalle velocità del liquido del flusso dello spiedo da diverse pipette maneggiate dall'uomo e dal sistema sono molto diverse; Pertanto, abbiamo ottimizzato la durata della digestione enzimatica e il numero di pipettaggi per la dispersione cellulare da parte del sistema.

Le cellule staminali pluripotenti indotte umane sono state mantenute su un piatto di 10 cm rivestito con una matrice di coltura cellulare da^0,5 μg/cm 2 con terreno di coltura hiPSC (ad esempio, Neutristem o StemFit AK02N). Per il passaggio, il sistema è stato programmato per lavare hiPSC tre volte con 5 mL di soluzione salina tampone fosfato senza calcio (PBS[-]), quindi trattare con 3 mL di enzima espresso TrypLE integrato con 10 μM dell'inibitore della Rho chinasi (Y-27632) per 15 minuti a 37 °C. Successivamente, il sistema ha aggiunto 9 mL di PBS(-) con lo 0,15% di frazione di albumina sierica bovina V (BSA) alla piastra e ha eseguito due serie di movimenti che hanno aspirato 10 mL di liquido contenente cellule e hanno erogato il liquido dalla punta della pipetta con un movimento a zig-zag attraverso la parte superiore della piastra, che è stata inclinata di 20° più vicino alla superficie della piastra. e ripetuto la sequenza di operazioni di cui sopra con la piastra inclinata di 20° sul lato opposto. Quindi, il sistema ha raccolto il terreno contenente le cellule in una provetta da 15 ml e lo ha tappato, dopodiché è stato centrifugato a 115 x g per 5 minuti per depositare le cellule. Successivamente, il sistema ha aspirato il surnatante e ha disperso il pellet cellulare in singole cellule utilizzando 10 mL di terreno di coltura con 10 μM Y-27632 pipettando 10 volte. Il sistema ha trasferito 1 mL di soluzione di blu di tripano in una nuova provetta da 15 mL, quindi ha aggiunto 1 mL della sospensione cellulare e li ha mescolati pipettando cinque volte. Successivamente, 100 μL della soluzione cellulare colorata con blu Trypan sono stati aspirati ed erogati nella finestra di ingresso dell'emocitometro monouso nel supporto. Il sistema ha spostato il supporto dell'emocitometro nell'area di osservazione microscopica e ha catturato una foto, che è stata immediatamente analizzata dal software, e la concentrazione cellulare ottenuta è stata applicata alla fase successiva. Per il mantenimento delle iPSC, il sistema ha seminato le cellule a una densità cellulare di 15.000 cellule/^cm2 in nuove piastre di plastica di 10 cm di diametro rivestite con matrice di coltura cellulare da 0,5 μg/cm² . Per gli esperimenti di differenziazione, il sistema ha seminato le cellule alla densità cellulare richiesta nel terreno preparato per ciascun tipo di cellula somatica in piastre a 6 pozzetti rivestite con una matrice di coltura cellulare diluita a 1/100. Infine, il sistema ha eseguito il bloccaggio incrociato cinque volte prima di trasferire le piastre nell'incubatrice. Nel sistema sono state caricate tre nuove piastre da 10 cm contenenti iPSC e tre piastre pre-rivestite con matrice di coltura cellulare e sono stati preparati anche altri elementi necessari secondo le rispettive procedure sopra menzionate. Un ciclo di coltura di mantenimento consiste in un'attività di passaggio il giorno 1 seguita da un cambio di terreno di coltura una volta al giorno per 3 giorni. Per tutta la durata dell'esperimento, questo ciclo è stato impostato per cinque cicli. Inoltre, i materiali di consumo sono stati riforniti a turno.

In base alla pianificazione ordinata, cinque cicli di coltura di manutenzione sono stati eseguiti con successo come pianificato dal sistema. Dalle fotografie delle cellule scattate automaticamente durante ogni compito, è stato confermato che le cellule proliferavano senza intoppi nel tempo. L'espansione della cella (n = 3) è stata calcolata e mostrata nella Figura 2. Per confermare se lo stato indifferenziato delle iPSC rimane invariato anche dopo la coltura di mantenimento nel sistema di coltura automatizzato, è stata eseguita l'analisi immunocitometorica (Oct3/4 e SSEA4) utilizzando i campioni rimanenti ad ogni passaggio (Figura 3A). Inoltre, dopo cinque cicli, le tre piastre sono state scaricate dal sistema ed è stata eseguita anche l'analisi immunoistochimica (Oct3/4, SSEA4 e Tra1-81) (Figura 3B). Entrambe le analisi che utilizzano l'immunocolorazione fluorescente hanno mostrato che lo stato indifferenziato delle cellule iPS è stato preservato. Il cariotipo delle iPSC è stato eseguito anche prima e dopo la coltura di mantenimento in un sistema di coltura automatizzato. Sebbene sia stata osservata un'anomalia in un allele del cromosoma 17 prima dell'inizio della coltura di mantenimento, non è stato osservato alcun cambiamento particolare da parte del sistema dopo 5 colture di mantenimento, inclusa l'anomalia (Figura 3C). Le impostazioni utilizzate per la manutenzione delle iPSC sono riepilogate nella Tabella 1.

Differenziazione
Cardiomiociti
Il protocollo di differenziazione da una pubblicazione precedente è stato seguito qui¹⁰. Il sistema ha seminato hiPSC indifferenziate (KMUR001) ad una densità di 30.000 cellule/^cm2 su piastre a 6 pozzetti rivestite di matrice di coltura cellulare in terreno di coltura hiPSC integrato con 10 μM di Y-27632. Il sistema ha cambiato il terreno in terreno di coltura staminale pluripotente umana con 6 μM dell'inibitore GSK-3ß CHIR-99021, 20 ng/mL di Activina A e 10 ng/mL di BMP4 dopo 3 giorni (giorno di differenziazione 1). Il 3° giorno di differenziazione, il sistema è passato al terreno CDM3: RPMI 1640, albumina umana ricombinante da 500 μg/mL e acido L-ascorbico 2-fosfato da 213 μg/mL con 2 μM Wnt-C59. Il 5° giorno di differenziazione, il sistema è passato a un terreno CDM3 fresco; successivamente, ha ripetuto il passaggio a un nuovo mezzo CDM3 a giorni alterni. Le impostazioni utilizzate per la differenziazione cardiomiocitaria delle iPSC sono riassunte nella Tabella 2.

Epatociti
Il protocollo di differenziazione da una pubblicazione precedente è stato seguito qui¹¹. Il sistema ha seminato hiPSC indifferenziate (RIKEN2F) a una densità di 25.000 cellule/^cm2 su piastre a 6 pozzetti rivestite di matrice di coltura cellulare in terreno di coltura hiPSC integrato con 10 μM di Y-27632. Dopo 2 giorni (giorno 1 di differenziazione), il sistema ha cambiato il terreno in RPMI-1640 più il 2% di insulina B27 meno (RPMI-B27) contenente 100 ng/mL di Activina A, 6 μM CHIR-99021 e l'1% di integratore di glutammina (ad es. GlutaMAX) per 24 ore. Il giorno 2 di differenziazione, abbiamo cambiato il terreno in RPMI-B27 con 50 ng/mL di Activina A. Il giorno 5 di differenziazione, il sistema ha cambiato il terreno in RPMI-B27, contenente l'1% di integratore di glutammina e 10 ng/mL di BMP-4. Il 9° giorno di differenziazione, il sistema ha cambiato il terreno in terreno di maturazione degli epatociti: il terreno L-15 di Leibovitz contenente l'8,3% di brodo di triptosio fosfato, 10 μM di idrocortisone 21-emisuccinato, 50 μg/mL di L-ascorbato di sodio, 100 nM di desametasone, 0,58% di insulina-transferrina-selenio, 2 mM di integratore di glutammina, 8,3% di siero fetale bovino e 100 nM di rac-1,2-diesagacilglicerolo. Successivamente, il sistema ha ripetuto il cambio del terreno con un terreno nuovo a giorni alterni. Le impostazioni utilizzate per la differenziazione epatocitaria delle iPSC sono riassunte nella Tabella 3.

Cellule precursori neuronali
Il protocollo di differenziazione da una pubblicazione precedente è stato seguito qui¹². Il sistema ha seminato hiPSC indifferenziate (RIKEN2F) a una densità di 25.000 cellule/^cm2 su piastre a 6 pozzetti rivestite con matrice di membrana basale in terreno Eagle modificato (DMEM)/F12 e terreno neurobasale (1:1) di Dulbecco integrato con il 10% di sostituzione del siero knockout, 0,1 mM di aminoacidi non essenziali, 1 mM di integratore di glutammina con 10 μM di inibitore del recettore TGF-beta (SB431542), 10 μM di inibitore del segnale BMP (dorsomorfina), e 10 μM Y-27632 (giorno di differenziazione 1). Il giorno 5 di differenziazione, il sistema ha cambiato il terreno in DMEM/F12 e terreno neurobasale 1:1 integrato con 0,1 mM di aminoacidi non essenziali, 1 mM di integratore di glutammina, 1% di integratore di N-2, 1% di integratore di B-27, 50 μg/mL di acido ascorbico 2-fosfato, 10 μM SB431542 e 10 μM di dorsomorfina. Il giorno 9 di differenziazione, il sistema ha cambiato il terreno in DMEM/F12 e terreno neurobasale 1:1 integrato con 0,1 mM di aminoacidi non essenziali, 1 mM di integratore di glutammina, 1% di integratore di N-2, 1% di integratore di B-27, 50 μg/mL di acido ascorbico 2-fosfato e 1 μM di acido all-trans retinoico. Nei giorni di differenziazione 13-16, il sistema ha cambiato il terreno ogni giorno con DMEM/F12 e terreno neurobasale 1:1 integrato con 0,1 mM di aminoacidi non essenziali, 1 mM di glutammina, 1% di integratore di N-2, 1% di B-27, 50 μg/mL di acido ascorbico 2-fosfato e 10 ng/mL di bFGF e 10 ng/mL di EGF. Le impostazioni utilizzate per la differenziazione delle cellule precursori neurali delle iPSC sono riassunte nella Tabella 4.

Cheratinociti
Il protocollo di differenziazione da una pubblicazione precedente è stato seguito qui¹³. Il sistema ha seminato hiPSC indifferenziate (253G1) ad una densità di 15.000 cellule/^cm2 in piastre a 6 pozzetti rivestite con matrice di coltura cellulare in terreno di coltura hiPSC con 10 μM Y-27632. Dopo 2 giorni (giorno 1 di differenziazione), il sistema ha cambiato il terreno in terreno Eagle modificato (DMEM)/F12 di Dulbecco e terreno neurobasale (1:1) con 0,1 mM di aminoacidi non essenziali, 1 mM di glutammina, 55 μM di 2-mercaptoetanolo, 1% di integratore di N-2, 2% di supplemento di B-27, 50 μg/mL di acido ascorbico 2-fosfato, 0,05% di albumina sierica bovina e 100 ng/mL di FGF-basico. Il giorno 3 di differenziazione, e successivamente, il terreno è stato cambiato in terreno cheratinocita umano (senza supplemento per il giorno 3 e con un supplemento il/dopo il giorno 5) con l'aggiunta di 0,5 μg/mL di idrocortisone, 1 μM di acido all-trans-retinoico, 25 ng/mL di hBMP-4, 2,4 μg/mL di adenina, 1,37 ng/mL di triiodotironina, 0,3 mM di acido ascorbico-2-fosfato, e 2 μM di forskolina, ogni 2 giorni dal sistema. Le impostazioni utilizzate per la differenziazione dei cheratinociti delle iPSC sono riassunte nella Tabella 5.

Come accennato in precedenza, l'intero processo è stato eseguito utilizzando solo apparecchiature di coltura automatizzate, dalla semina delle cellule iPS alla successiva serie di protocolli di differenziamento. È stata valutata l'espressione di marcatori caratteristici in ciascuna cellula (Figura 4). È stato dimostrato che la differenziazione può essere indotta utilizzando solo un sistema di coltura automatizzato.

Figura 1: Riepilogo del sistema di coltura automatizzato. (A) Immagine del sistema che mostra le dimensioni e lo schizzo del layout 1. (B) Immagine del banco di lavoro e schizzo del layout 2. (C) Utensili manuali: piatto, tubo e pipetta. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Bando et ^al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Attività di passaggio e crescita cellulare. (A) Il quadrato illustra ogni processo. (B) Espansione di iPSC calcolata utilizzando ogni conteggio automatizzato delle cellule nei tre esperimenti indipendenti. (C) Immagini rappresentative catturate automaticamente da un passaggio all'altro. Barre graduate = 400 μm e 100 μm (inserto). Questa cifra è stata modificata con il permesso di Bando et ^al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Mantenimento automatizzato a lungo termine di iPSC. (A) Tutte le analisi immunocitometriche dei tre esperimenti indipendenti per Oct-3/4 e SSEA-4. Ogni istogramma blu indica l'assenza di controllo anticorpale primario. Ogni istogramma rosso rappresenta il segnale specifico dell'antigene indicato. (B) Immagini rappresentative di cellule colorate immunoistochimicamente per Oct-3/4, SSEA-4 e Tra 1-81. Barre di scala = 50 μm. (C) Cariotipo della RIKEN2F-iPSC dopo il quinto passaggio. Questa cifra è stata modificata con il permesso di Bando et ^al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Colorazione immunoistochimica. Quadri immunoistochimici di epatociti (barre di scala = 100 μm), cardiomiociti (barre di scala = 100 μm), cellule progenitrici neuronali (barre di scala = 100 μm) e cheratinociti (barre di scala = 200 μm). Questa cifra è stata modificata con il permesso di Bando et ^al.9. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Preparazione del passaggio e impostazioni del sistema. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Preparazioni per la differenziazione dei cardiomiociti e impostazioni del sistema. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Preparazioni per la differenziazione degli epatociti e impostazioni del sistema. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: Preparazioni per la differenziazione delle cellule precursori neurali e impostazioni del sistema. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 5: Preparazioni per la differenziazione dei cheratinociti e impostazioni del sistema. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Discussione

Un passaggio critico del protocollo è che se un utente rileva errori, fare clic sul pulsante Annulla, Interrompi o Ripristina in qualsiasi momento e ricominciare dal primo passaggio. Il software può evitare errori umani, tra cui la doppia prenotazione, l'apertura delle porte mentre le attività del sistema sono attive e la mancanza di rifornimento. Un altro punto critico per una differenziazione efficace ed efficiente nella cellula somatica desiderata è la corretta selezione delle linee di cellule staminali pluripotenti, perché ogni cellula staminale pluripotente ha un bias incontrollabile nelle sue proprietà di differenziazione^14,15.

Questo sistema di coltura automatizzato per cellule staminali pluripotenti indotte è in grado di mantenerle e differenziarle in vari tipi di cellule somatiche. Le dimensioni di questo sistema sono di 200 cm (larghezza), 110 cm (profondità) e 233 cm (altezza), con un peso totale di 1,2 tonnellate. L'incubatrice integrata nel dispositivo può contenere contemporaneamente trentasei piatti da 10 cm e nove piastre multipozzetto.

I miglioramenti rispetto ai modelli precedenti sono che in primo luogo, come braccio di movimentazione, il sistema di guide dell'asse X-Y-Z è stato recentemente convertito da un braccio articolato a 6 assi, che funziona cambiando l'utensile della punta del braccio in tre parti diverse per piatti, tubi e pipette. Il braccio è sospeso al soffitto del sistema e si muove lungo l'asse X-Y-Z. In secondo luogo, è stato introdotto un sistema di conteggio delle cellule per colture di mantenimento senza alimentatore e protocolli di induzione della differenziazione che vengono eseguiti in modo continuo dal passaggio. Dopo aver miscelato la soluzione di sospensione a cellula singola con la soluzione blu di tripano, è stata trasferita in un emocitometro monouso per l'osservazione microscopica e l'imaging. Il software analizza automaticamente l'immagine ottenuta per contare il numero di cellule vive e calcolare il volume necessario per seminare il numero di cellule richiesto. L'accuratezza della conta cellulare ottenuta da questa analisi delle immagini è risultata coerente con quella ottenuta manualmente.

Il sistema di guide degli assi X-Y-Z è stato applicato per gestire ogni compito più rapidamente rispetto alla versione precedente (braccio articolato multiasse). Con questo sistema di coltura automatizzato, sono stati eseguiti cinque passaggi continui per 16 giorni e le iPSC sono state espanse di 625 ± 93 volte. Sebbene la prova di resistenza per il tempo di mantenimento delle celle senza celle di alimentazione fosse più breve rispetto alla nostra precedente dimostrazione con celle di alimentazione, l'espansione delle celle è stata più efficiente rispetto alla precedente dimostrazione⁶. La riduzione del tempo di attività sembrava contribuire a prevenire l'essiccazione del danno cellulare durante le attività.

Inoltre, i compiti di differenziazione dalla coltura di mantenimento alla differenziazione in cardiomiociti, epatociti, cellule precursori neuronali e cheratinociti sono stati eseguiti senza l'intervento umano. Dopo una serie di questi cicli, è stato confermato dall'immunocolorazione a fluorescenza che le cellule ottenute nel solo sistema di coltura automatizzato si erano differenziate nelle cellule desiderate. Pertanto, condividendo un programma di attività e utilizzando questo sistema, i ricercatori che non hanno familiarità con la gestione delle cellule iPS possono ottenere cellule somatiche derivate da iPSC per la propria ricerca. Inoltre, le differenze di riproducibilità tra i ricercatori o le strutture potrebbero essere eliminate il più possibile, e si potrebbe garantire che ogni volta si ottengano cellule di qualità omogenea.

Adottando un nuovo sistema ferroviario, l'attrezzatura potrebbe essere ridimensionata e ridotta di peso a 1,2 tonnellate, ~ 200 kg in meno rispetto a prima. Inoltre, i costi delle parti e dell'impostazione del programma potrebbero essere ridotti di circa 10.000 dollari USA. I costi di manutenzione e programmazione sono stati stimati in calo del 13%. Al fine di motivare un maggior numero di ricercatori a intraprendere facilmente la ricerca relativa alle cellule iPS, è anche importante mantenere bassi i costi delle apparecchiature⁶. Ci auguriamo che i sistemi di coltura automatici attuali e di prossima generazione siano uno dei contributi per aiutare a fornire iPSC e cellule differenziate derivate da iPSC di qualità più uniforme.

I principali limiti di questo sistema sono la limitata capacità del frigorifero di conservare provvisoriamente le colture e la sua debolezza nel gestire piccole quantità (<100 μL) di liquido. Inoltre, la mancanza di una sofisticata intelligenza artificiale disabilita l'ottimizzazione automatica in base alla condizione di puntualità della cella. La piccola limitazione è la necessità di puntali speciali per pipette forniti dai produttori del sistema ^4,5. Stiamo sviluppando la prossima generazione di sistemi di coltura che saranno in grado di gestire piccole quantità di liquido per preparazioni medie e includeranno un sistema di ottimizzazione del feedback basato sull'intelligenza artificiale ad alte prestazioni (apprendimento del sistema). Il nostro produttore collaboratore⁹ ha un know-how sufficiente per costruire sistemi su misura in base alle esigenze speciali degli utenti. Oltre a questo, presto saranno sul mercato sistemi di nuova generazione dotati di funzioni più generali e più ampie. Stiamo anche valutando un sistema di noleggio basato su abbonamento per fornire sistemi aggiornati a tutti gli utenti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,15% frazione di albumina sierica bovina V	Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Giappone	9048-46-8
1% GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
piastre di plastica da 10 cm	Corning Inc., NY, Stati Uniti	430167
253G1	RKEN Bioresource Research Center	HPS0002
2-mercaptoetanolo	Thermo Fisher Scientific	21985023
Actinina  topo	Abcam	ab9465
Activina A	Nacali Tesque	18585-81
Adenina	Thermo Fisher Scientific	A14906.30
Albumina  coniglio	Dako	A0001
Acido retinoico all-trans	Fuji Film Wako Chemical Inc.	186-01114
Sistema di coltura automatizzato	Panasonic
B-27 supplemento	Thermo Fisher Scientific	17504044
bFGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	062-06661
BMP4	Thermo Fisher Scientific	PHC9531
Albumina sierica bovina	Merck	810037
CHIR-99021	MCE, NJ, Stati Uniti #HY-10182	252917-06-9
Definito Cheratinocita-SFM	Thermo Fisher Scientific	10744019	Cheratinocita umana Media
Desametasone	Merck	266785
Dihexa	TRC, Ontario, Canada	13071-60-8	rac-1,2-diesciadecilglicerolo
Emocitometro monouso	CountessTM Vetrini per camera di conteggio cellulare, Thermo Fisher Scientific	C10228
Dorsomorfina	Thermo Fisher Scientific	1219168-18-9
Dulbecco' s modificato Eagle medium/F12	Fuji Film Wako Chemical Inc.
EGF	Fuji Film Wako Chemical Inc.	053-07751
Essenziale 8	Thermo Fisher Scientific	A1517001	Cellule staminali pluripotenti umane
Siero fetale bovino	Biowest, FL, Stati Uniti	S140T
FGF-basic	Nacalai Tesque Inc.	19155-07
Forskolin	Thermo Fisher Scientific	J63292.
Glutammina	Thermo Fisher Scientific 25030081		Integratore di glutammina
IgG di capra(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A11056
HNF-4A  capra	Santacruz	6556
Idrocortisone	Thermo Fisher Scientific	A16292.06
Idrocortisone 21-emiuccinato	Merck	H2882
iMatrix511 Seta	Nippi Inc., Tokyo, Giappone	892 021	Matrice di coltura cellulare
Insulina-transferrina-selenio	Thermo Fisher Scientific 41400045
Cheratina 1  topo	Santacruz	376224
Cheratina 10	coniglio BioLegend	19054
KMUR001	Kansai Medical University		iPSC derivate da pazienti
Siero sostitutivo knockout	Thermo Fisher Scientific	10828010
acido L-ascorbico 2-fosfato	A8960, Merck	A8960
Leibovitz' s L-15 medio	Fuji Film Wako Chemical Inc.	128-06075
Matrigel	Corning Inc.
IgG di topo(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21202
Integratore N-2	Thermo Fisher Scientific	17502048
Nestin topo	Santacruz	23927
Terreno neurobasale	Thermo Fisher Scientific	21103049
Neurofilamento  coniglio	Chemicon	AB1987
Neutristem	Sartrius AG, Gö ttingen, Germania	05-100-1A	terreno di coltura cellulare
Ott 3/4  topo	BD	611202
PBS(-)	Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Giappone	14249-24
IgG di coniglio(H+L) AlexaFluo488	Thermo Scientific	A21206
IgG di coniglio(H+L) AlexaFluo546	Thermo Scientific	A10040
Albumina umana ricombinante	A0237, Merck, Darmstadt, Germania	A9731
Inibitore della chinasi Rho, Y-27632	Sellec Inc., Tokyo, Giappone	129830-38-2
RIKEN 2F	RKEN Bioresource Research Center	HPS0014	hiPSC indifferenziate
RPMI 1640	Thermo Fisher Scientific #11875	12633020 SB431542
	Thermo Fisher Scientific	301836-41-9
Sodio L-ascorbato	Merck	A4034-100G
SSEA-4  mouse	Millipore MAB4304
StemFit AK02N	Ajinomoto, Tokyo, Giappone	Terreno di coltura cellulare	AK02
TnT coniglio	Abcam	ab92546
TRA 1-81 topo	Millipore	MAB4381
Triiodotironina	Thermo Fisher Scientific	H34068.06
TripLETM espresso enzima	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, Stati Uniti	12604013
Soluzione di tripano blu	Nacalai Tesque, Kyoto, Giappone	20577-34
Brodo di triptosio fosfato	Merck	T8782-500G
Wnt-C59	Bio-techne, NB, Regno Unito	5148
β   Tublin  mouse	Promega	G712A