Esperimenti di optogenetica ad alto rendimento nel lievito utilizzando la piattaforma automatizzata Lustro

Summary

Questo protocollo delinea i passaggi per l'utilizzo della piattaforma automatizzata Lustro per eseguire la caratterizzazione ad alto rendimento dei sistemi optogenetici nel lievito.

Abstract

L'optogenetica offre un controllo preciso sul comportamento cellulare utilizzando proteine sensibili alla luce geneticamente codificate. Tuttavia, l'ottimizzazione di questi sistemi per ottenere la funzionalità desiderata richiede spesso più cicli di progettazione-costruzione-test, che possono richiedere molto tempo e manodopera. Per affrontare questa sfida, abbiamo sviluppato Lustro, una piattaforma che combina la stimolazione della luce con l'automazione di laboratorio, consentendo uno screening efficiente ad alto rendimento e la caratterizzazione dei sistemi optogenetici.

Lustro utilizza una stazione di lavoro di automazione dotata di un dispositivo di illuminazione, un dispositivo di scuotimento e un lettore di piastre. Impiegando un braccio robotico, Lustro automatizza il movimento di una piastra a micropozzetti tra questi dispositivi, consentendo la stimolazione di ceppi optogenetici e la misurazione della loro risposta. Questo protocollo fornisce una guida passo-passo sull'utilizzo di Lustro per caratterizzare i sistemi optogenetici per il controllo dell'espressione genica nel lievito in gemmazione Saccharomyces cerevisiae. Il protocollo copre la configurazione dei componenti Lustro, compresa l'integrazione del dispositivo di illuminazione con la workstation di automazione. Fornisce inoltre istruzioni dettagliate per la programmazione del dispositivo di illuminazione, del lettore di piastre e del robot, garantendo un funzionamento regolare e l'acquisizione dei dati durante tutto il processo sperimentale.

Introduction

L'optogenetica è una potente tecnica che utilizza proteine sensibili alla luce per controllare il comportamento delle cellule con elevata precisione ^1,2,3. Tuttavia, la prototipazione di costrutti optogenetici e l'identificazione delle condizioni di illuminazione ottimali possono richiedere molto tempo, rendendo difficile l'ottimizzazione dei sistemi optogenetici ^4,5. I metodi ad alto rendimento per lo screening e la caratterizzazione rapida dell'attività dei sistemi optogenici possono accelerare il ciclo di progettaz....

Protocol

I ceppi di lievito utilizzati in questo studio sono documentati nella Tabella dei Materiali. Queste varietà mostrano una crescita robusta nell'intervallo di temperatura compreso tra 22 °C e 30 °C e possono essere coltivate in vari substrati di lievito standard.

1. Configurazione della postazione di lavoro di automazione

1. Dotare la stazione di lavoro automatizzata di un braccio di presa robotico (RGA, vedere la tabella dei materiali) in grado di spostare le piastre per micropozzetti (Figura 1).
2. Installare un agitatore riscaldatore per micropia....

Results

La Figura 4A mostra i valori di fluorescenza nel tempo per un ceppo optogenetico che esprime un reporter fluorescente controllato da un fattore di trascrizione diviso inducibile dalla luce. Le diverse condizioni di luce utilizzate nell'esperimento sono riflesse dalle variazioni del ciclo di lavoro, che rappresenta la percentuale di tempo in cui la luce è accesa. Si osserva che il livello complessivo di fluorescenza è proporzionale al ciclo di lavoro della stimolazione luminosa. La

Discussion

Il protocollo Lustro qui presentato automatizza i processi di coltivazione, illuminazione e misurazione, consentendo lo screening e la caratterizzazione ad alto rendimento dei sistemi optogenetici⁶. Ciò si ottiene integrando un dispositivo di illuminazione, un lettore di micropiastre e un dispositivo di scuotimento in una stazione di lavoro di automazione. Questo protocollo dimostra in modo specifico l'utilità di Lustro per lo screening di diversi costrutti optogenetici integrati nel lievito S.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastra inferiore in vetro a 96 pozzetti con  vetro di copertura #1.5	Cellvis	P96-1.5H-N
BioShake 3000-T olmo (agitatore riscaldatore)	QINSTRUMENTS
Fluent Automation Workstation	Tecan
LITOS (dispositivo di illuminazione alternativo)	Hohener, et al. Scientific Reports. 2022
optoPlate-96 (dispositivo di illuminazione)	Bugaj, et al. Protocolli della natura. 2019
Braccio di presa robotico	Tecan
Spark (lettore di piastre)	Tecan
Synthetic Complete media	SigmaAldrich	Y1250
Tecan Connect (app di avviso per l'utente)	Tecan
yMM1734 (BY4741 Mat&alfa; ura3Δ 0::5' Omologia di Ura3, pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagB-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' omologia  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1763 (BY4741 Mat&alfa; ura3Δ Omologia 0::5' Ura3, omologia pRPL18B-Gal4DBD-CRY2(535)-tENO1, pRPL18B-Gal4AD-CIB1-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' omologia  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
yMM1765 (BY4741 Matα ura3Δ Omologia 0::5' Ura3, omologia pRPL18B-Gal4DBD-eMagA-tENO1, pRPL18B-eMagBM-Gal4AD-tENO1, pGAL1-mScarlet-I-tENO1, Ura3, Ura 3' omologia  his3D1 leu2D0 lys2D0 gal80::KANMX gal4::spHIS5)	Harmer, et al. ACS Syn Bio. 2023
YPD Agar	SigmaAldrich	Y1500