In questo articolo, presentiamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e la coltura di cellule ciliate cocleari primarie dai topi. Inizialmente, l'organo di Corti è stato sezionato da coclee murine neonatali (di 3-5 giorni) al microscopio. Successivamente, le cellule sono state digerite enzimaticamente in una sospensione unicellulare e identificate utilizzando l'immunofluorescenza dopo diversi giorni in coltura.
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Articolo metodologico
Isolamento e coltura di cellule ciliate cocleari primarie da topi neonatali
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule ciliate cocleari sono i recettori sensoriali del sistema uditivo. Queste cellule si trovano nell'organo di Corti, l'organo sensoriale responsabile dell'udito, all'interno del labirinto osseo dell'orecchio interno. Le cellule ciliate cocleari sono costituite da due tipi anatomicamente e funzionalmente distinti: cellule ciliate esterne e interne. Il danno a uno di essi provoca la perdita dell'udito. In particolare, poiché le cellule ciliate interne non possono rigenerarsi e il loro danno è permanente. Pertanto, la coltivazione in vitro di cellule ciliate primarie è indispensabile per studiare gli effetti protettivi o rigenerativi delle cellule ciliate cocleari. Questo studio mirava a scoprire un metodo per isolare e coltivare le cellule ciliate di topo.
Dopo la rimozione manuale della parete laterale cocleare, l'epitelio uditivo è stato meticolosamente sezionato dal miolo cocleare al microscopio, incubato in una miscela composta da tripsina-EDTA allo 0,25% per 10 minuti a 37 °C e delicatamente sospeso nel terreno di coltura utilizzando un puntale per pipette da 200 μL. La sospensione cellulare è stata fatta passare attraverso un filtro cellulare, il filtrato è stato centrifugato e le cellule sono state coltivate in piastre a 24 pozzetti. Le cellule ciliate sono state identificate in base alla loro capacità di esprimere un complesso di meccanotrasduzione, la miosina-VIIa, che è coinvolta nelle tensioni motorie, e tramite marcatura selettiva della F-actina utilizzando falloidina. Le cellule hanno raggiunto l'>90% di confluenza dopo 4 giorni in coltura. Questo metodo può migliorare la nostra comprensione delle caratteristiche biologiche delle cellule ciliate coltivate in vitro e dimostrare l'efficienza delle colture di cellule ciliate cocleari, stabilendo una solida base metodologica per ulteriori ricerche uditive.
Introduzione
Le cellule ciliate cocleari svolgono un ruolo importante nel rilevamento del suono e nella trasmissione del segnale al nervo uditivo. Le cellule ciliate sono cellule meccanicistiche che funzionano come recettori sensoriali primari e convertono le vibrazioni sonore in segnali elettrici nei vertebrati. L'epitelio sensoriale dell'orecchio interno dei mammiferi comprende una singola fila di cellule ciliate interne e tre file di cellule ciliate esterne. In diverse aree di base della membrana, le cellule ciliate percepiscono i suoni a frequenze diverse (tra 20 e 2.000 Hz)1. La funzione delle cellule ciliate esterne è un processo di amplificazione mec....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati (n. 2021-847) dal Comitato per l'uso e la cura degli animali dell'Università di Xi'an Jiaotong.
1. Sterilizzazione e preparazione del materiale
- Sterilizzare gli strumenti di dissezione utilizzando la disinfezione a vapore ad alta temperatura e ad alta pressione e asciugarli in un'incubatrice a 50 °C per una notte.
- Preparare in anticipo 100 mL di terreno di coltura contenente il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 10 mg/mL di penicillina/streptomicina (aggiungere 10 mL di FBS e 10 μL di soluzione madre di penicillina a 90 mL di terreno di Dulbecco Mo....
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Risultati
Seguendo questo protocollo, abbiamo seminato le cellule isolate. I semi primari di cellule ciliate cocleari sono stati considerati efficaci se le cellule non galleggiavano nel terreno di coltura e non si diffondevano entro 24 ore. Abbiamo determinato il numero di cellule ciliate dopo che hanno aderito e si sono diffuse in aggregati piatti sul fondo del piatto. Dopo 1 giorno, le cellule ciliate vive sono state strettamente aderenti al fondo della piastra di coltura e le cellule non aderenti sono state rimosse mediante ris.......
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Discussione
Rispetto alla linea cellulare HEI-OC1, le colture primarie di cellule ciliate hanno replicato in modo più accurato lo stato fisiologico delle cellule in vivo. Pertanto, il metodo di coltura primaria uditiva stabilito isolando cellule viventi dagli organi cocleari e coltivandole immediatamente sembra essere uno strumento prezioso per una ricerca approfondita sui sistemi uditivi. Alcune tecniche sono fondamentali per una cultura di successo. In primo luogo, ridurre al minimo la durata della separazione dell'organo di Corti.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 to YG)
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piatto per coltura cellulare BioLite da 100 mm | Thermo Fisher Scientific | 130182 | che utilizza per la coltura |
| Piatto per coltura cellulare Nunc da 35 mm | Thermo Fisher Scientific | 150318 | che utilizza per la coltura |
| Palato a 6 pozzetti | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | che utilizza per la coltura |
| 70 &; filtri cellulari m | BD Company | 352350 | utilizzando per filtro |
| Alexa Fluor 488 Falloidina | Thermo Fisher Scientific | A12379 | colorazione immunofluorescente |
| Anti-coniglio IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientifc | A11008 | colorazione immunofluorescente |
| giorno 3-5 neonatale murino | fornito da Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco' s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | utilizzando per la coltura |
| Fetale Siero Bovino | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | utilizzando per la coltura |
| Pinze | Dumont | 5# | utilizzando per la dissezione |
| Microscopio anatomico Leica | Germania | S9i | utilizzando per la dissezione |
| Penicillina/streptomicina | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | utilizzando per la coltura |
| Coniglio plyclonal a Miosina VIIa | Abcam azienda | ab92996 | colorazione immunofluorescente |
| Forbice | Belevor | 10cm/04.0524.10 | utilizzando per la dissezione |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | colorazione immunofluorescente |
| Trypsin | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | l'uso per la coltura |
Riferimenti
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581(2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E.
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Ristampe e permessi
