Tecniche di manipolazione e marcatura per l'impianto di giovani American Shad con un nuovo microtrasmettitore acustico

L'agone americano (Alosa sapidissima) è una specie ittica anadroma originaria della costa orientale degli Stati Uniti. La ridotta disponibilità di habitat e l'aumento dello sviluppo di dighe idroelettriche hanno provocato un declino della popolazione di aloni in tutto il loro areale nativo ^1,2. L'agone giovanile e altre alosine, durante la loro migrazione verso l'oceano, possono essere particolarmente suscettibili a lesioni e mortalità quando passano attraverso strutture idroelettriche ^3,4,5. Comprendere il passaggio e i tassi di sopravvivenza dell'agone giovanile nelle dighe idroelettriche è fondamentale per informare la riautorizzazione di queste strutture e gli sforzi di ripristino per la specie. Tuttavia, mancano tecniche di marcatura efficaci per valutare il passaggio e i tassi di sopravvivenza dell'agone americano mentre migrano verso l'oceano. Gli shad marcati con trasmettitori per studi di telemetria dovrebbero essere rappresentativi della popolazione di inferenza non marcata e non dovrebbero essere influenzati negativamente dal tag o dal processo di marcatura ^6,7.

Per contribuire a migliorare la capacità di tracciare l'agone giovanile, il Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) ha sviluppato un nuovo microtrasmettitore acustico per lo studio dell'agone americano e di altre specie ittiche con tipi di corpo compressiformi simili. Una delle sfide comuni nello studio dell'agone americano e di altre alosine è la loro sensibilità alla manipolazione, al trasporto e all'etichettatura rispetto ad altre specie. Ad esempio, Raquel et ^al.8 hanno scoperto che la mortalità per la movimentazione e il trasporto su strada erano costantemente più alte per il novellame di alosa americana rispetto alle altre cinque specie di novellame nel loro studio. Dei pochi studi pubblicati che hanno valutato gli sforzi per marcare l'agone americano giovane, è stata riportata un'ampia gamma di sopravvivenza, da un minimo del 2% dopo 7 giorni⁹ e fino al 100% dopo 48 ore dopo la marcatura¹⁰ e sono disponibili pochissime informazioni sulla sopravvivenza a lungo termine e sulla ritenzione del trasmettitore per l'agone giovane marcato.

Le sfide nel gestire e marcare con successo specie sensibili come l'agone americano hanno messo in luce le lacune di conoscenza sulla loro migrazione, comportamento e uso dell'habitat. La capacità di tracciare il movimento attraverso le dighe idroelettriche farebbe notevolmente progredire la comprensione del passaggio e dei tassi di sopravvivenza dell'agone americano. Aiuterebbe a prendere decisioni informate sulla gestione degli impianti idroelettrici esistenti e su nuovi progetti per sistemi che riducano al minimo gli effetti sulle specie ittiche e sulle fasi di vita non studiate in precedenza. Con lo sviluppo di nuove tecnologie di trasmissione, la comprensione degli effetti del trasmettitore e del processo di marcatura è fondamentale per ridurre al minimo le distorsioni e valutare con precisione il passaggio e la sopravvivenza. Gli obiettivi di questo studio erano quelli di valutare la sopravvivenza a 60 giorni dei giovani di alosa americana marcati con un nuovo microtrasmettitore acustico e di fornire un protocollo di manipolazione e marcatura che riducesse gli effetti negativi della marcatura sull'agone, rendendoli così più paragonabili alle loro controparti non marcate.

PNNL è accreditato dall'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio. L'agone americano è stato gestito in conformità con le linee guida federali per la cura e l'uso degli animali da laboratorio¹¹ e i protocolli per il nostro studio sono stati condotti in conformità e approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali del PNNL.

1. Preparazione di una vasca di recupero post-tagging

1. Quando l'acqua salata salmastra (7,5 ppt) non è prontamente disponibile, utilizzare un sistema statico per trattenere l'agone con un'adeguata aerazione e circolazione per 1-2 giorni prima del rilascio (Figura 1).
2. In un serbatoio statico circolare, installare un sistema di trasporto aereo per fornire aerazione. Collegare un tubo in PVC al lato del serbatoio in modo che un raccordo a T si trovi nella parte superiore, un altro raccordo a T sia vicino al centro e un raccordo schermato sia filettato sul fondo del tubo.
3. Quindi, collegare una pietra porosa a una linea dell'aria compressa e posizionare la pietra porosa sul fondo del tubo vicino allo schermo.
   NOTA: Lo schermo impedisce ai pesci di nuotare nel sistema di trasporto aereo.
4. Riempire il serbatoio con acqua fresca fino a quando la porta di uscita (raccordo a T centrale in PVC) del ponte aereo è sommersa a circa metà. Quindi, chiudi l'acqua.
   1. Quindi, accendi e aumenta l'alimentazione d'aria fino a quando l'acqua aerata che esce dalla porta crea un flusso direzionale per l'orientamento dei pesci.
5. Aggiungi sale marino commerciale per ottenere una soluzione di acqua salata salmastra da 7,5 ppt e mescola fino a quando non si scioglie.

2. Preparazione del secchio di origine dei pesci d'acqua salata e della soluzione anestetica dell'acqua salata

1. Misurare 7,5 g di sale marino ogni 0,5 L di acqua e sciogliere in un secchio.
   NOTA: Nella fase 3.5, viene aggiunto un volume uguale di acqua dolce contenente l'agone per creare una concentrazione finale di 7.5 ppt.
2. In un altro secchio, misurare e sciogliere 7,5 g di sale marino per ogni litro d'acqua.
   1. Aggiungere 120 mg di tricaina metansolfonato (MS-222) tamponato con 120 mg di bicarbonato di sodio per litro di acqua salata.
   2. Aggiungere aria supplementare ai secchi per anestesia.

3. Raccolta dell'agone con trasferimento acqua-acqua in acqua salata salmastra

1. Riempi parzialmente un altro secchio con acqua fresca e posizionalo lateralmente nel serbatoio della sorgente di pre-etichettatura.
2. Usa una rete o una mano per guidare delicatamente l'agone a nuotare nel secchio.
3. Una volta che un numero adeguato di pesci è nel secchio, gira il secchio in posizione verticale e fissalo con un coperchio perforato.
4. Versare l'acqua in eccesso attraverso il coperchio, mantenendo il pesce contenuto nella quantità target di acqua dolce (cioè la metà del volume del secchio finale di acqua salata da 7.5 ppt).
5. Versare delicatamente l'agone e l'acqua dolce nel secchio della fonte di acqua salata preparato al punto 2.1.
   NOTA: La salinità finale sarà di 7,5 ppt.
6. Fornire aria supplementare al secchio di origine del pesce pre-tag utilizzando una pompa ad aria per acquario e una pietra porosa per mantenere l'ossigeno disciolto a un livello accettabile (>il 90% di saturazione è l'ideale).

4. Impianto di un trasmettitore acustico in uno shad

1. Disinfettare i trasmettitori con etanolo al 70% per 20 minuti e risciacquare con acqua sterile prima dell'uso.
2. Utilizzando una rete da immersione a maglie lisce ed extra-fini (~0,4 mm), prelevare un pesce dal secchio di origine e metterlo nel secchio per anestesia. Shad dovrebbe perdere l'equilibrio e i riflessi spinali in ~2-3 minuti, a seconda della temperatura dell'acqua e di altri parametri di qualità dell'acqua.
3. Una volta completamente anestetizzato alla fase quattro¹², usa una mano guantata per posizionare delicatamente il pesce su un tavolo di misurazione bagnato per ottenere la sua lunghezza.
4. Sposta il pesce in una pesa piena d'acqua su una bilancia tarata per ottenere il suo peso.
5. Registra la lunghezza e il peso, il codice del tag acustico ed eventuali commenti sulle condizioni del pesce prima dell'etichettatura, come la perdita di squame o l'emorragia.
6. Mettere il pesce in un contenitore di trasferimento pieno di acqua salata anestetica e consegnarlo, insieme al trasmettitore acustico, al chirurgo dei pesci.
7. Posiziona il pesce, con il lato sinistro rivolto verso il basso, su un cuscinetto di schiuma bagnato e resistente all'acqua preparato con una scanalatura a V (Figura 2A).
   NOTA: La scanalatura a V impedisce al pesce di scivolare troppo durante la procedura e consente all'acqua di accumularsi intorno alla bocca del pesce in modo che possa aspirare attivamente l'acqua sulle branchie.
8. Fornire acqua dolce alla bocca del pesce tramite un tubo collegato a un serbatoio d'acqua alimentato a gravità.
9. Utilizzando una lama chirurgica in acciaio inossidabile #11 disinfettata o nuova di zecca, praticare un'incisione di 3 mm in verticale tra i miomeri vicino all'estremità distale della pinna pettorale.
10. Se necessario, rimuovere una squama sulla punta della lama se ostruisce la pelle del pesce.
    1. Inserire con cautela il trasmettitore nell'incisione e spingerlo posteriormente fino a quando l'intero tag non si trova all'interno della cavità corporea (Figura 2B).
    2. Se necessario, utilizzare l'estremità smussata del bisturi (o una pinza a punta fine) per inserire con cautela completamente l'etichetta.
11. Metti il pesce etichettato in un piccolo contenitore di acqua salata a 7,5 ppt con aerazione per consentire al pesce di riprendersi dall'anestesia.
12. Una volta che il pesce ha ritrovato l'equilibrio, effettuare un trasferimento acqua-acqua dal contenitore di recupero alla vasca di contenimento post-marcatura contenente 7,5 ppt di acqua salata.
13. Lasciare che i pesci marcati si riprendano in acqua salata per 1-2 giorni prima del rilascio.

Sono state condotte due serie di valutazioni per valutare l'efficacia dell'etichettatura dell'agone giovanile: studi preliminari nel 2020 e uno studio a lungo termine nel 2021. Valutazioni preliminari di laboratorio sono state condotte presso il PNNL nel novembre 2020 per determinare un metodo preferito per impiantare l'agone americano con un nuovo microtrasmettitore acustico. I prototipi di trasmettitori (n = 4, P1-P4) sono stati accoppiati con diverse posizioni di marcatura (gastrica, pettorale, pelvica e dorsale) per un totale combinato di 4 trattamenti di localizzazione acustica (n = 40 pesci per trattamento, Tabella 1). Tutti i pesci di prova sono stati assegnati in modo casuale a una vasca di trattamento e di contenimento. I pesci di prova sono stati tenuti in 2 vasche di contenimento con un numero uguale di pesci di ciascun trattamento (cioè 20 pesci per trattamento) per vasca per 14 giorni. Per i primi 2 giorni della valutazione, gli aloni sono stati tenuti in acqua salata salmastra (7,5 ppt) e lasciati riprendersi dall'etichettatura e dalla manipolazione. Quindi i serbatoi sono stati passati all'acqua dolce a flusso continuo per il resto del periodo di valutazione.

Per la valutazione preliminare, i pesci marcati e i controlli con pinne tagliate variavano in dimensioni comprese tra 50 e 80 mm di lunghezza della forcella. La sopravvivenza del giovane alosa e la ritenzione del tag sono risultate più elevate per i pesci impiantati tramite un'incisione pettorale rispetto alle altre tecniche di marcatura (Figura 3). Ulteriori valutazioni pilota hanno anche dimostrato che le tecniche di gestione come i trasferimenti da acqua ad acqua e la detenzione dei pesci in acqua salata salmastra prima e dopo eventi stressanti, come l'etichettatura, erano fondamentali per aumentare i tassi di sopravvivenza.

Utilizzando i protocolli di marcatura e manipolazione di successo della valutazione preliminare, nel 2021 è stato condotto uno studio di laboratorio presso il PNNL per valutare la sopravvivenza a lungo termine di 60 giorni e la ritenzione del tag di giovani aloni americani impiantati con un trasmettitore acustico utilizzando il metodo di marcatura dell'incisione pettorale. La valutazione a lungo termine ha utilizzato il trasmettitore fittizio P5 (Figura 4), un prototipo migliorato simile per forma e dimensioni al progetto P1 utilizzato nella valutazione preliminare. Le dimensioni e il peso medi del dummy P5 erano di 7,6 mm di lunghezza × 2,3 mm di diametro e un peso in aria di 0,058 g (deviazione standard 0,002 g), il che ha comportato un carico di tag del <1%. Il prototipo di trasmettitore acustico con componenti funzionali (Figura 4) ha dimensioni di 7,6 mm di lunghezza x 2,0 mm di diametro e un peso in aria di 0,050 g.

Al momento del test, il giovane alosa americana utilizzato nella valutazione a lungo termine era stato tenuto in cattività per 4 mesi. Mentre l'esperimento è stato progettato per avere un numero uguale di pesci da trattamento e di controllo tenuti in due vasche per un periodo di 60 giorni, il numero di aloni rimanenti al momento della marcatura era basso. Pertanto, più shad sono stati assegnati in modo casuale al gruppo di trattamento marcato rispetto al gruppo di controllo per ottenere una migliore comprensione dell'efficacia a lungo termine della tecnica di marcatura su shad. Ciascuna delle due vasche conteneva 27 pesci da trattamento e 9 o 10 pesci di controllo. Tuttavia, poiché la sopravvivenza dal serbatoio A (13,8%) è stata significativamente peggiore rispetto al serbatoio B (78,4%; Test esatto di Fisher, p < 0,001) e non c'è stata alcuna differenza di sopravvivenza tra i gruppi marcati e di controllo all'interno di ciascun serbatoio, solo i risultati per il serbatoio B sono inclusi qui.

Gli shad (lunghezza forcella 69-105 mm; peso 3,9-11,7 g) sono stati marcati con il trasmettitore P5 utilizzando l'incisione pettorale (n = 27) o assegnati al gruppo di controllo (n = 10). I pesci di controllo sono stati manipolati utilizzando le stesse procedure, tra cui il posizionamento sul cuscinetto chirurgico per ~ 20 secondi, ma non hanno ricevuto una clip per pinne o un'incisione né sono stati impiantati con un trasmettitore. Dopo l'etichettatura, entrambi i gruppi di trattamento sono stati tenuti in acqua salata salmastra (7,5 ppt) per 1 giorno e poi sono passati all'acqua fluviale per il resto dello studio. La sopravvivenza a 60 giorni è stata dell'81,5% per il gruppo marcato e del 70% per i controlli non marcati (Figura 5). La sopravvivenza per i pesci marcati in questa valutazione è stata definita sia come sopravvivenza che come mantenimento dei tag perché l'espulsione dei tag non può essere differenziata da un evento di mortalità in uno studio di telemetria. Non c'è stata alcuna differenza significativa nella sopravvivenza tra i due gruppi (test esatto di Fisher, P = 0,884); Tuttavia, la capacità di rilevare una differenza è stata del 38,4% a causa delle piccole dimensioni del campione. Sebbene la capacità di rilevare una differenza tra i trattamenti fosse bassa, i risultati della valutazione a lungo termine mostrano che questo protocollo di manipolazione e marcatura può essere utilizzato con moderato successo per impiantare l'agone americano con trasmettitori acustici.

Figura 1: Serbatoio di recupero post-marcatura riempito con acqua salata salmastra. Un sistema di trasporto aereo fornisce ossigeno al serbatoio statico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Impianto di un trasmettitore acustico di un giovane shad americano. Giovane shad americano (A) con un'incisione pettorale e (B) con il trasmettitore P5 fittizio inserito nell'incisione. Si noti che la bocca dell'agone è parzialmente immersa nell'acqua che scorre dal tubo blu. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 3: Percentuale di sopravvivenza su una valutazione preliminare di 14 giorni con un gruppo di controlli non marcati e quattro gruppi marcati di giovani di aloni americani. I trattamenti marcati consistevano in quattro posizioni di marcatura (gastrica, pettorale, pelvica e dorsale) ciascuna abbinata a un prototipo di trasmettitore unico (P1-P4). La sopravvivenza del pesce marcato è stata definita sia come sopravvivenza che come conservazione del tag. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 4: Trasmettitori acustici e fittizi per l'etichettatura di giovani shad americani. (A) Microtrasmettitore acustico funzionale e (B) il prototipo di trasmettitore fittizio P5, che è stato utilizzato nello studio di sopravvivenza in laboratorio 60 d. Si noti che i numeri da 4 a 7 sul righello rappresentano i centimetri. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Figura 5: Percentuale di sopravvivenza dell'agone americano in uno studio a lungo termine di 60 giorni. Gli shad giovani sono stati sbloccati (Controlli senza marcatura; linea continua) o marcati (Tagged [P5 pettorale]; linea tratteggiata) con un trasmettitore fittizio. La sopravvivenza del gruppo marcato è stata definita sia come sopravvivenza che come ritenzione del tag. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. 

Tabella 1: Marcatura e informazioni di sopravvivenza per l'agone americano impiantato con trasmettitori prototipo (P1-P4) o marcato con clip per pinne caudali superiori e caudali inferiori (controllo) come parte della valutazione preliminare. La posizione del tag per il gruppo di controllo non è applicabile (NA) poiché questi pesci hanno ricevuto solo clip per pinne (Clip). Si noti che il tipo di tag P4 era un design a galleggiamento neutro. La deviazione standard (SD) della media è indicata tra parentesi.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.