Questo protocollo presenta un metodo completo ed efficiente per la produzione di organoidi renali da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) utilizzando condizioni di coltura in sospensione. L'enfasi principale di questo studio risiede nella determinazione della densità cellulare iniziale e della concentrazione dell'agonista WNT, avvantaggiando così i ricercatori interessati alla ricerca sugli organoidi renali.
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Articolo metodologico
Generazione di organoidi renali in sospensione da cellule staminali pluripotenti indotte
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli organoidi renali possono essere generati da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) attraverso vari approcci. Questi organoidi sono molto promettenti per la modellazione delle malattie, lo screening dei farmaci e le potenziali applicazioni terapeutiche. Questo articolo presenta una procedura passo-passo per creare organoidi renali da iPSC, a partire dalla striscia primitiva posteriore (PS) fino al mesoderma intermedio (IM). L'approccio si basa sul terreno APEL 2, che è un mezzo definito, privo di componenti animali. È integrato con un'alta concentrazione di agonista WNT (CHIR99021) per una durata di 4 giorni, seguita da fattore di crescita dei fibroblasti 9 (FGF9)/eparina e una bassa concentrazione di CHIR99021 per altri 3 giorni. Durante questo processo, viene data enfasi alla selezione della densità cellulare ottimale e della concentrazione di CHIR99021 all'inizio delle iPSC, poiché questi fattori sono fondamentali per il successo della generazione di organoidi renali. Un aspetto importante di questo protocollo è la coltura in sospensione in una placca a bassa aderenza, che consente all'IM di svilupparsi gradualmente in strutture nefroniche, comprendenti strutture tubulari glomerulari, tubolari prossimali e distali, tutte presentate in un formato visivamente comprensibile. Nel complesso, questo protocollo dettagliato offre una tecnica efficiente e specifica per produrre organoidi renali da diverse iPSC, garantendo risultati positivi e coerenti.
Introduzione
Il rene svolge un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi fisiologica, a seconda della sua unità funzionale. I nefroni, che espellono i prodotti di scarto, possono regolare la composizione dei fluidi corporei. La malattia renale cronica (CKD), causata da mutazioni ereditarie o da altri fattori ad alto rischio, progredisce fino alla malattia renale allo stadio terminale (ESKD)1,2. L'ESKD è apparentemente dovuta alla limitata capacità di rigenerazione dei nefroni. Pertanto, è necessaria una terapia sostitutiva renale. La differenziazione diretta delle iPSC umane consente la generazione in vitro di organoidi renali 3D specifici per il paziente, che possono essere utilizzati per studiare lo sviluppo renale, modellare malattie specifiche del paziente ed eseguire lo screening dei farmaci nefrotossici 3,4.
Durante lo sviluppo embrionale, i reni originano dal mesoderma intermedio (IM), che si differenzia dalla stria primitiva (PS). La classica via di segnalazione WNT può indurre un'ulteriore differenziazione dell'IM con la partecipazione coordinata di FGF (FGF9, FGF20) e BMP (segnalazione Bmp7 attraverso JNK)5,6,7. Producono due importanti popolazioni cellulari di cellule progenitrici nefriche (NPC): la gemma ureterale (UB) e il mesenchima metanefrico (MM), formando rispettivamente i dotti collettori e il nefrone 8,9. Ogni nefrone è costituito da segmenti glomerulari e tubolari, come i tubuli prossimali e distali, e l'ansa di Henle10,11. Secondo la teoria sopra menzionata, i protocolli attualmente pubblicati imitano le cascate di segnale e la stimolazione del fattore di crescita per indurre gli organoidi renali 5,12.
Negli ultimi anni, sono stati sviluppati molti protocolli per differenziare le iPSC umane in organoidi renali 5,6,7,12. Takasato et al.7 hanno ottimizzato la durata del trattamento con CHIR (agonista WNT) prima della sostituzione con FGF9. Secondo il loro protocollo, l'esposizione a CHIR per 4 giorni, seguita da FGF9 per 3 giorni, è il modo più efficace per indurre IM da iPSC. I filtri Transwell sono stati utilizzati come formato di coltura nella loro procedura; Tuttavia, questo metodo è difficile per i principianti. Pertanto, Kumar et al.13 hanno cercato di cambiare il formato della cultura e hanno scelto di sospendere la cultura. Hanno dissociato le cellule aderenti il giorno 7 per la semina in piastre a bassa aderenza per aiutarle ad assemblarsi in corpi embrioidi (EB) che contengono strutture simili a nefroni. Tuttavia, l'effetto batch di questi metodi era evidente, specialmente in diverse iPSC. Inoltre, diverse pubblicazioni hanno riportato che la concentrazione di CHIR variava da 7 μM a 12 μM 5,13,14.
Abbiamo ipotizzato che la concentrazione della densità cellulare e del CHIR potesse influenzare la generazione di organoidi in diverse iPSC, e questo è stato verificato numerose volte nei nostri esperimenti. Il presente protocollo ha leggermente modificato il metodo di studio di Kumar et al.13 e ha fornito agli utenti una procedura passo-passo. La pianificazione e lo schema dell'approccio sono mostrati nella Figura 1.
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Protocollo
Le iPSC utilizzate per il presente studio sono state ottenute da una fonte commerciale. Le cellule sono state mantenute con terreno mTeSR su piastre rivestite a matrice di membrana basale disponibili in commercio (vedi Tabella dei materiali). La Tabella 1 contiene tutte le composizioni dei mezzi utilizzati nello studio.
1. Placcatura di iPSC per la differenziazione e l'induzione di striature primitive posteriori (PS)
- Lavare le iPSC sulla piastra a 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana con 2 mL di DPBS. Aspirare il DPBS con una pipetta.
- Aggiungere 1 mL della soluzione di distacco cellulare disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali) per staccare le iPSC e incubare a 37 °C per 5 minuti.
- Aggiungere 1 mL di mTeSR alle iPSC e assicurarsi che le cellule si siano sollevate dalla superficie di plastica.
- Centrifugare le cellule a 400 x g per 3 minuti a temperatura ambiente (RT). Risospendere il pellet cellulare e contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro.
- Seminare una gamma di densità cellulari su una piastra da 24 o 6 pozzetti rivestita con matrice di membrana e coltura con mTeSR integrato con 10 μM di inibitore della Rho chinasi (Y-27632) (vedere la tabella dei materiali). Coltivarli per una notte in un incubatore CO2 a 37 °C.
NOTA: Per indurre la PS, la concentrazione ottimale di CHIR99021 e le densità cellulari adatte variano a seconda delle diverse linee di iPSC. Seminare un intervallo di densità (ad esempio, 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,4 * 103 singole cellule per centimetro quadrato) e un intervallo di concentrazione di CHIR99021 da 7 μM-12 μM. Avviare la differenziazione di ciascuna densità e di ogni CHIR nello stesso giorno. Trovare la concentrazione ottimale di CHIR99021 e le densità cellulari adatte in una piastra da 24 pozzetti, quindi espandere la coltura in piastre da 6 pozzetti. Qui forniamo un protocollo basato su una piastra a 6 pozzetti. - Il giorno successivo, aspirare l'mTeSR e lavare le cellule con 2 mL di DPBS.
- Aggiungere 2 mL di terreno di trattamento di stadio I (terreno di differenziazione delle cellule staminali contenente 8-12 μM CHIR99021) (Tabella 1), indicato come Giorno 0.
- Coltivarli in un incubatore a 37 °C per 4 giorni, rinfrescare la fase I media ogni due giorni.
2. Indurre il mesoderma intermedio nefrogenico (IM)
- Il giorno 4, rimuovere il terreno di fase I e lavare con 2 ml di DPBS.
- Aggiungere 2 mL di terreno di stadi II alle cellule (terreno di differenziazione delle cellule staminali contenente 200 ng/mL di FGF9, 1 μg/mL di eparina e 1 μM CHIR99021) (Tabella 1).
- Coltivarli in un'incubatrice a 37 °C e rinfrescare il terreno ogni 2 giorni fino al giorno 7.
3. Generazione di organoidi renali in coltura in sospensione
NOTA: Durante il periodo di osservazione dal giorno 0 al giorno 7, lo stato delle cellule è critico. Se le cellule mostrano un'espansione di successo e si accumulano senza detriti cellulari significativi, dimostra la derivazione riuscita del mesoderma intermedio (IM), indicando la prontezza a procedere alla fase successiva. Tuttavia, se le cellule mostrano segni di apoptosi iniziale, seguita da necrosi o rottura, può essere indicativo di concentrazioni inappropriate di CHIR99021 o densità cellulare.
- Il giorno 7, rimuovere il terreno di stadio II e lavare le cellule con 2 mL di DPBS.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di distacco cellulare a ciascun pozzetto e incubare a 37 °C per 5 minuti fino a quando le cellule sono rifrangenti in condizioni di contrasto di fase.
- Pipettare 1 mL di terreno di fase II alle cellule, mescolare e assicurarsi che le cellule si siano sollevate dalla superficie.
- Raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 3 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 2 mL di terreno di stadio III (terreno di differenziazione delle cellule staminali contenente 200 ng/mL di FGF9, 1 μg/mL di eparina e 1 μM CHIR99021 in metilcellulosa (MC) allo 0,1% e 0,1% di polivinilalcol (PVA)) integrato con 10 μM di inibitore della Rho chinasi (Y-27632) (vedere Tabella dei materiali). Mescolate delicatamente.
- Mescolare la sospensione cellulare e il seme in una piastra a 6 pozzetti a bassa adesione in un rapporto di 1:3. Mettere la piastra su un agitatore orbitale (resistente alla CO 2, rotante a 60 giri/min) in un'incubatrice a 37 °C e al 5% di CO2 .
- 24 ore dopo, rimuovere l'inibitore della Rho chinasi (Y-27632) e aggiungere il terreno di coltura in stadio III (supplemento di terreno di differenziazione delle cellule staminali con 200 ng/mL FGF9, 1 μg/mL di eparina, 1 μM CHIR99021, 0,1% MC, 0,1% PVA). Cultura per 2 giorni. Modificare il supporto nella cultura della sospensione attenendosi alla procedura riportata di seguito.
- Tagliare la punta della pipetta da 1 mL con forbici asettiche.
- Agitare delicatamente la piastra a 6 pozzetti per disporre gli organoidi al centro della piastra.
- Aspirare gli organoidi con le pipette preparate in una provetta da 15 ml e lasciarli riposare per 5 minuti.
- Aspirare il surnatante e lasciare gli organoidi sul fondo della provetta.
- Aggiungere il terreno fresco per risospendere gli organoidi e riplaccare nuovamente in una piastra a 6 pozzetti a bassa adesione.
- Continuare ad agitare la piastra a bassa aderenza a 60 giri/min nell'incubatrice. Cambiare la media di fase III ogni due giorni fino al giorno 12.
- Il giorno 12, passare al terreno di stadimento IV (terreno di differenziazione delle cellule staminali contenente lo 0,1% di MC e lo 0,1% di PVA).
- Cambiare il terreno ogni due giorni fino al giorno 25. Gli organoidi possono svilupparsi gradualmente in strutture nefroniche mature dal giorno 12 al giorno 25.
4. Colorazione in immunofluorescenza di organoidi renali
- Raccogliere gli organoidi renali in una provetta da 15 ml e lavare con 2 mL di PBS.
- Dopo aver lasciato agire per 5-10 minuti, fissare gli organoidi renali in PFA al 2% appena preparati per 20 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il PFA e lavare gli organoidi con 1 mL di PBS contenente lo 0,3% di Triton X-100 (0,3% PBST), agitarlo uniformemente su uno shaker (con una velocità di rotazione non superiore a 60 giri/min) per 8 minuti, lasciarlo riposare per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante. Ripeti tre volte.
NOTA: Gli organoidi possono essere conservati in PBST allo 0,3% a 4° C per 2-4 settimane. - Incubare gli organoidi fissati con il 10% di siero d'asina in PBST (tampone bloccante) (vedi Tabella dei materiali) per una notte a 4 °C.
- Diluire gli anticorpi primari (elencati nella tabella dei materiali) in un tampone bloccante con un rapporto di 1:300.
- Incubare gli organoidi con anticorpi primari per una notte a 4 °C con agitazione.
NOTA: Assicurarsi che i glomeruli e i tubuli possano essere colorati contemporaneamente su un organoide. - Lavare gli organoidi con 1 mL di PBST allo 0,3%, agitare uniformemente su uno shaker (con una velocità di rotazione non superiore a 60 giri/min) per 8 minuti, lasciare riposare per 5 minuti, quindi rimuovere il surnatante. Ripeti tre volte.
- Incubare gli organoidi con anticorpi secondari (elencati nella tabella dei materiali) e DAPI per una notte a 4 °C con agitazione. Quindi ripetere il passaggio 4.7.
NOTA: Sia l'anticorpo secondario che il DAPI sono diluiti in soluzione bloccante, anticorpo secondario (1:400) e DAPI (1:1000). - Dopo la colorazione, disidratare gli organoidi con metanolo (25%, 50%, 75% e 100% per 5 minuti ciascuno), quindi permeare con alcool benzilico e benzoato benzilico (BABB, rapporto 1:2) (vedi Tabella dei materiali) per 5 minuti.
- Manipolare gli organoidi chiariti su un piatto con fondo di vetro (vedi Tabella dei materiali) ed esaminarli al microscopio confocale.
NOTA: Durante l'imaging, scegliere la capsula di Petri sul fondo della capsula di vetro e, durante la permeazione, mettere il BABB direttamente nella capsula di Petri per mantenere umido il fondo della capsula.
5. Saggio di captazione del destrano in vitro
- Il giorno 25, incubare gli organoidi con 100 μg/mL di destrano marcato con fluorescenza (vedere la tabella dei materiali) per 4 ore in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2 .
- 4 ore dopo, passare a un terreno nuovo e acquisire immagini di colture cellulari vive utilizzando un microscopio a fluorescenza ad ampio campo.
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Risultati
La produzione di IM si ottiene attivando la segnalazione canonica WNT utilizzando l'inibitore GSK3 CHIR99021, seguito da FGF9/eparina. Dal giorno 0 al giorno 4, le iPSC si espandono rapidamente e assumono forme romboidali o triangolari. La confluenza raggiunge il 90%-100% e si accumula uniformemente fino al giorno 7. Al momento della coltura in sospensione, gli aggregati formano spontaneamente strutture nefroniche dopo essersi dissociati il giorno 7. Gli organoidi renali creati attraverso la coltura in sospensione mostra...
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Discussione
È stato descritto un protocollo dettagliato per la generazione di organoidi renali da iPSC, che comporta piccole modifiche al mezzo basale, alla densità cellulare iniziale e alla concentrazione di CHIR99021. In vari esperimenti, i fattori critici per il successo della generazione di organoidi renali sono risultati essere la differenziazione iniziale del mesoderma intermedio (IM) e lo stato cellulare il giorno 7. Inoltre, diverse linee di iPSC hanno mostrato variazioni nella proliferazione cellulare e nel potenziale di di...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno segnalato alcun potenziale conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Siamo estremamente grati a tutti i membri di Mao e Hu Lab, passati e presenti, per le interessanti discussioni e i grandi contributi al progetto. Ringraziamo il Centro Nazionale di Ricerca Clinica per la Salute del Bambino per il grande supporto. Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), dalla Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu), e la Fondazione per le Scienze Naturali della Provincia di Jiangsu (Sovvenzioni n. BK20210150 a Gang Wang).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastra per colture cellulari a 96 pozzetti, | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Anticorpi | |||
| Alcool benzilico | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzil benzoato | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Armadio di sicurezza biologica | Haier | Cat #HR40  A2 | |
| Biotina anti-umana LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Cellule mononucleate del sangue hiPS-B1 (iPSc, femmina) | N/A | N/A | |
| Agitatore di livello di anidride carbonica | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Sostanze chimiche, peptidi e proteine | |||
| CHIR99021 (attivatore della via Wnt) | STEMCELL Tecnologie | Cat #72054 | |
| Costar Piastra per coltura cellulare multipla a 6 pozzetti | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Piastra a 6 pozzetti con attacco ultrabasso | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| Soluzione colorante DAPI | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 senza HEPES | Servicebio | Gatto #G4610 | |
| asino Anti-pecora IgG H& L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Siero d'asino stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (senza calcio, magnesio, rosso fenolo) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-IgG anti-coniglio di capra (1:400)IgG anti-coniglio | #E032220 | capra | |
| 549-IgG anti-topo di capra (1:400)IgG anti-coniglio | #E032310 88 | ||
| Dylight 549 - IgG anti-coniglio di capra (1:400) | IgG | ||
| Dylight 649 (1:400)IgG | gatto Earthox | #E032620 | |
| sperimentali: Linee cellulari | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubatore | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Piatti di coltura con fondo in vetro | NEST | Cat #801002 | |
| Capra anti-umana CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Soluzione di eparina (Integratore per colture cellulari) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| FGF-9 ricombinante umano | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Microscopio invertito | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Microscopio confocale a scansione laser | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl Cellulosa | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro centrifuga | HENGNUO | Gatto #2-4B | |
| Topo anti-umano CD31 (1:300) | BD Biosciences | Gatto #555444 | |
| Topo anti-umano ECAD (1:300) | BD Biosciences | Gatto #610182 | |
| Topo anti-umano Integrina beta 1 (1:300) | Abcam | Gatto #ab30394 | |
| Topo anti-umano MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 ( Polivinilalcool 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplemento | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Fiale | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Altri | |||
| Coniglio anti-umano GATA3 (1:300) | Tecnologia di segnalazione cellulare | Gatto #5852S | |
| Coniglio anti-umano LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Coniglio anti-umano Sinaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Coniglio anti-umano WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Coniglio anti-topo PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Albumina sierica umana ricombinante (rHSA) | YEASEN | Gatto #20901ES03 | |
| Pecora anti-umano NPHS1 (1:300) | R& D | Systems Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dicloridrato) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
