Qui, descriviamo l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo, consentendo lo studio della funzione del tessuto adiposo perivascolare e della sua relazione con le cellule vascolari.
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Articolo metodologico
Isolamento, coltura e induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il tessuto adiposo perivascolare (PVAT) è un deposito di tessuto adiposo che circonda i vasi sanguigni e presenta i fenotipi di adipociti bianchi, beige e marroni. Recenti scoperte hanno messo in luce il ruolo centrale del PVAT nella regolazione dell'omeostasi vascolare e nella partecipazione alla patogenesi delle malattie cardiovascolari. Una comprensione completa delle proprietà e della regolazione del PVAT è di grande importanza per lo sviluppo di future terapie. Le colture primarie di adipociti periaortici sono preziose per studiare la funzione PVAT e il crosstalk tra adipociti periaortici e cellule vascolari. Questo articolo presenta un protocollo economico e fattibile per l'isolamento, la coltura e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati dalla frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo periaortico di topo, che può essere utile per modellare l'adipogenesi o la lipogenesi in vitro. Il protocollo delinea l'elaborazione dei tessuti e la differenziazione cellulare per la coltura di adipociti periaortici da topi giovani. Questo protocollo fornirà la pietra angolare tecnologica a bordo banco per lo studio della funzione PVAT.
Introduzione
Si ritiene che il tessuto adiposo perivascolare (PVAT), una struttura perivascolare composta da una miscela di adipociti maturi e una frazione vascolare stromale (SVF), interagisca con la parete del vaso adiacente tramite il suo secretomaparacrino 1. Come regolatore critico dell'omeostasi vascolare, la disfunzione PVAT è implicata nella patogenesi delle malattie cardiovascolari 2,3,4. La SVF del tessuto adipocitario è costituita da diverse popolazioni cellulari previste, tra cui cellule endoteliali, cellule immunitarie, cellule del mesotelio, cellule n....
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Protocollo
I protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali presso l'Ospedale Toracico di Shanghai affiliato alla Scuola di Medicina dell'Università Jiao Tong di Shanghai (numero di approvazione: KS23010) ed erano conformi alle normative etiche pertinenti. I topi C57BL/6 maschi e femmine di età compresa tra 4 e 8 settimane sono da preferire per questo esperimento.
1. Preparazione di strumenti chirurgici, tamponi e terreni di coltura
- Sterilizzare in autoclave gli strumenti chirurgici (ad es. forbici chirurgiche e pinze standard) a 121 °C per 30 min. Disinfettare gli ....
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Risultati
Utilizzando questo protocollo sopra descritto, abbiamo isolato accuratamente i PVAT che circondano l'aorta toracica del topo (Figura 1A-D). Dopo aver lavato e tritato i PVAT in piccoli pezzi utilizzando forbici sterili (Figura 1E,F), i frammenti di tessuto sono stati digeriti in una soluzione digestiva contenente collagenasi di tipo 1 (1 mg/mL) e dispasi II (4 mg/mL) e incubati a 37 °C su uno shaker per 30-45 minuti (Fig.......
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Discussione
Proponiamo un approccio pratico e fattibile per l'isolamento e l'induzione adipogenica di preadipociti derivati da SVF dal tessuto adiposo periaortico di topo. I vantaggi di questo protocollo sono che è semplice ed economico. Un numero adeguato di topi è fondamentale per il successo dell'isolamento, poiché un tessuto insufficiente può causare una bassa densità di SVF e uno scarso stato di crescita, influenzando in ultima analisi l'efficienza lipogenica. Inoltre, l'età del topo è un fattore importante da considerare poich.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse, finanziari o di altro tipo, da dichiarare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (82130012 e 81830010) e dai progetti Nurture per la ricerca di base dello Shanghai Chest Hospital (Grant Number: 2022YNJCQ03).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,2 μ m filtri per siringhe | PALL | 4612 | |
| piastra a 12 pozzetti | Labselect | 11210 | |
| Provetta da centrifuga da 15 mL | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-tironina (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 provetta da centrifuga nM |
| 50 mL | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectina | Abcam | ab22554 | 1:1.000 concentrazione di lavoro |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1.000 concentrazione di lavoro |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1.000 concentrazione di lavoro |
| anti-PGC1&alfa; | Abcam | ab191838 | 1:1.000 concentrazione di lavoro |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1.000 concentrazione di lavoro |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1.000 concentrazione di lavoro |
| anti-&alfa;-actinina | CST | 6487 | 1:1.000 concentrazione di lavoro |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 topi di età compresa tra 4 e 8 settimane di entrambi i sessi | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Filtro cellulare 70 &; micro; m, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagene dalla pelle di vitello | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenasi, Tipo 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Desametasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μ M |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Siero fetale bovino | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| DMEM ad alto contenuto di glucosio | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubatore con agitatore orbitale | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co., Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulina (bovini) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μ M |
| isoflurano | RWD | R510-22-10 | |
| Soluzione di Krebs-Ringer | Pricella | PB180347 | proteggere dalla luce |
| Pinza microchirurgica | Beyotime | FS233 | |
| Forbice microchirurgica | Beyotime | FS217 | |
| Olio Rosso O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (soluzione salina tamponata con fosfato) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillina-Streptomicina | Gibco | 15140122 | |
| Perossidasi AffiniPura capra anti-topo IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5.000 concentrazione di lavoro |
| Perossidasi AffiniCapra pura Anti-coniglio IgG (H + L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5.000 concentrazione di lavoro |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μ M |
| Pinza standard | Beyotime | FS225 | |
| Forbice chirurgica | Beyotime | FS001 |
Riferimenti
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al.
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Ristampe e permessi
