Estrazione di DNA senza cellule di campioni di vitreo e umor acqueo per la diagnosi e il monitoraggio del linfoma vitreoretinico

Sommario

Qui viene stabilita una procedura per estrarre il DNA privo di cellule dall'umor vitreo e acqueo per eseguire studi molecolari per la diagnosi di linfoma vitreoretinico. Il metodo offre la possibilità di estrarre contemporaneamente il DNA dalla componente cellulare del campione o di riservarlo per test ausiliari.

Abstract

Il linfoma vitreoretinico (VRL) rappresenta un linfoma aggressivo, spesso classificato come linfoma primario diffuso a grandi cellule B del sistema nervoso centrale. Per diagnosticare il VRL, vengono raccolti campioni come l'umor vitreo e, più recentemente, l'umor acqueo. I test diagnostici per VRL su questi campioni includono citologia, citometria a flusso e test molecolari. Tuttavia, sia la citopatologia che la citometria a flusso, insieme ai test molecolari che utilizzano il DNA cellulare, richiedono cellule intere intatte. La sfida risiede nel fatto che l'umor vitreo e acqueo hanno in genere una bassa cellularità e molte cellule vengono distrutte durante la raccolta, la conservazione e l'elaborazione. Inoltre, questi campioni pongono ulteriori difficoltà per i test molecolari a causa dell'elevata viscosità dell'umor vitreo e del basso volume sia dell'umor vitreo che dell'umor acqueo. Questo studio propone un metodo per estrarre DNA privo di cellule da campioni vitrei e acquosi. Questo approccio integra l'estrazione del DNA cellulare o consente di utilizzare la componente cellulare di questi campioni per altri metodi diagnostici, tra cui la citologia e la citometria a flusso.

Introduzione

Il linfoma vitreoretinico (VRL) è un linfoma aggressivo associato al linfoma primario a grandi cellule B diffuso del sistema nervoso centrale ^1,2,3. Il VRL è tipicamente fatale a causa del suo coinvolgimento nel sistema nervoso centrale ^1,2. Sebbene rara^1,4, la VRL si presenta spesso con sintomi simili all'uveite posteriore e ad altre malattie vitreoretiniche ^4,5. Di conseguenza, i pazienti che presentano sintomi di uveite richiedono una diagnosi per confermare o escludere la VRL.

Recentemente, sono stati pubblicati i criteri di consenso per la diagnosi di VRL, che comportano una combinazione di esame clinico e risultati di laboratorio⁶. I campioni comunemente usati per diagnosticare il VRL includono l'umor vitreo e, più recentemente, l'umor acqueo⁷. L'umor vitreo si ottiene attraverso una procedura chirurgica chiamata vitrectomia pars plana, che consente l'accesso al segmento posteriore dell'occhio⁸.

Nel protocollo presentato, sono stati raccolti campioni di umor acqueo e umor vitreo per l'estrazione cellulare e cfDNA. Dopo aver anestetizzato i pazienti e posizionato trocar a circa 4 mm dal limbus corneale, è stato ottenuto un campione di umore acqueo di circa 100-200 μL utilizzando una siringa di tubercolina da 1 mL nel limbus corneale. Per i pazienti pseudofachici, il vitreo non diluito è stato ottenuto introducendo aria sterile nell'infusione, consentendo la raccolta di una maggiore quantità di vitreo non diluito (fino a 3,5 ml). Nei pazienti fachici, circa 500-1000 μL di vitreo non diluito sono stati rimossi prima di attivare un'infusione di soluzione salina bilanciata. In alcuni casi, il vitreo diluito secondariamente (da 500 a 2.000 μL) è stato raccolto commutando l'infusione in liquido e posizionando il vitrector all'interno della gonna vitreale per ottenere questo campione. La frazione vitreale più diluita è stata raccolta conservando la sacca a cassetta (Figura supplementare 1) alla fine dell'intervento. Una volta che questa sacca ha raggiunto il reparto di patologia, il vitreo diluito è stato ottenuto drenando il liquido da questa sacca in provette coniche per la successiva estrazione del DNA.

La citopatologia del liquido vitreo è spesso considerata il gold standard⁹. Tuttavia, diversi studi hanno dimostrato una sensibilità limitata a causa dell'elaborazione e della cellularità minima^10,11,12. La citometria a flusso può aiutare a identificare le cellule B clonali, ma può anche essere limitata dalla bassa cellularità e dalla fragilità delle grandi cellule di linfoma^13,14,15. Sia la citopatologia che la citometria a flusso richiedono cellule intere intatte. Molte di queste cellule vengono distrutte durante la raccolta, lo stoccaggio e l'elaborazione. Quando i test molecolari vengono eseguiti utilizzando DNA estratto da cellule intatte (DNA cellulare), soffre di questa stessa limitazione. Inoltre, dividendo il campione vitreo limitato per tutti questi test si riduce la quantità di materiale disponibile per ogni test.

Il DNA libero da cellule (cfDNA) rappresenta un'altra fonte di DNA che non richiede cellule intatte. Il cfDNA da campioni vitrei è stato utilizzato per la rilevazione di VRL ^16,17 e melanoma uveale¹⁸. In questo protocollo, il DNA cellulare e privo di cellule viene estratto dal liquido vitreo e acquoso per rilevare il VRL.

Protocollo

Il presente protocollo segue le linee guida per l'assistenza umana e con l'approvazione del comitato di revisione istituzionale (IRB) dell'Università del Michigan. Per questo è stata ottenuta una rinuncia al consenso informato da parte dell'IRB. Non ci sono criteri di inclusione o esclusione rilevanti per i pazienti coinvolti.

1. Separazione dei componenti cellulari e cell-free

NOTA: Per il test diagnostico VRL è possibile ricevere tre tipi di campioni: vitreo (non diluito; liquido da vitrectomia raccolto prima dell'inizio dell'infusione), vitreo diluito all'interno di una sacca a cassetta (Figura 1) e umor acqueo (liquido dalla camera anteriore dell'occhio).

1. Per il liquido vitreo non diluito, che è molto viscoso, diluire con 3-5 mL di PBS per facilitare il pipettaggio.
2. Per diluire il vitreo all'interno della sacca a cassetta (Figura supplementare 1), drenare il liquido in provette coniche da 50 mL (una per ogni 45 mL di fluido).
3. L'umore acqueo ha un volume molto basso (<200 μL). Per garantire il massimo recupero delle cellule, trasferire il campione in una provetta da 1,5 mL, sciacquare la provetta originale per microcentrifuga da 500 μL in cui è stato raccolto il campione con un volume uguale di PBS e aggiungerlo alla provetta da 1,5 mL.
4. Centrifugare il fluido vetroso o acquoso a 3.000 x g per 15 minuti a temperatura ambiente.
5. Rimuovere con cautela il surnatante utilizzando una pipetta, facendo attenzione a non disturbare le cellule pellettate.

2. Estrazione del DNA dalla componente cellulare

1. Aggiungere una quantità appropriata di soluzione di lisi cellulare (300 μL per pellet piccoli, 1 mL o più per pellet più grandi) (vedere Tabella dei materiali). Mescolare pipettando su e giù.
2. Quando è completamente lisato, aggiungere 1/3 del volume totale della soluzione di precipitato proteico (100 μL per 300 μL di lisato) (vedere Tabella dei materiali).
3. Vorticare vigorosamente per 20-30 s. Centrifugare per 3 minuti a 3.000 x g a temperatura ambiente.
4. Pipettare 300 μL di isopropanolo in una provetta per microcentrifuga pulita. Pipettare con cura il surnatante del passaggio precedente nella provetta di isopropanolo.
5. Aggiungere 1,5 μL di glicogeno 20 mg/mL (per 300 μL di lisi) (vedere la tabella dei materiali).
6. Mescolare bene per inversione, quindi porre il campione in un congelatore a -20 °C per 1 ora o tutta la notte per favorire la precipitazione del DNA.
7. Centrifugare la provetta da 1,5 mL per 5 minuti a 3.000 x g a temperatura ambiente. Pipettare l'isopropanolo.
8. Aggiungere 0,5 mL di etanolo al 70% e capovolgere il tubo per lavare il pellet.
9. Centrifugare per 1 minuto a 3.000 x g a temperatura ambiente e travasare l'etanolo. Ripetere il lavaggio con etanolo una volta.
10. Capovolgere il tubo su una garza pulita per drenare la soluzione e asciugare il pellet o il decantante. Centrifugare rapidamente il DNA in una microcentrifuga e pipettare la goccia rimanente di etanolo con un puntale monouso a punta fine (una volta che non è rimasto etanolo residuo nella provetta, il DNA dovrebbe essere asciutto e pronto per idratarsi in 5-10 minuti).
11. Aggiungere 45 μL di soluzione di idratazione del DNA (vedere Tabella dei materiali) al pellet di DNA essiccato.
12. Posizionare il tubo in un blocco riscaldante a 50 °C e lasciarlo solubilizzare per 1-2 h. Pipettare il DNA su e giù per accelerare il processo di idratazione.
    NOTA: Aggiungere altra soluzione di idratazione del DNA se il campione appare troppo viscoso.

3. Estrazione del DNA senza cellule

1. La quantità di surnatante del passaggio 1.5 è variabile. Aggiungere 70 μL di tampone di condizionamento (vedere la tabella dei materiali) per ogni millilitro di surnatante.
2. Mescolare bene le perline di pulizia mediante vortice. Aggiungere 10 μL di microsfere di chiarimento se si tratta <14 mL di surnatante senza cellule, 20 μL se si elaborano 14-40 mL.
3. Miscelare bene la miscela campione/perlina mediante vortice. Centrifugare a 3.000 x g per 15 minuti a temperatura ambiente.
4. Senza disturbare il pellet, pipettare il surnatante lasciando dietro di sé 100 μL se si utilizzano 10 μL di microsfere di chiarimento e 200 μL se si utilizzano 20 μL di microsfere di chiarimento.
5. Aggiungere un volume uguale di tampone per la digestione di pellet di urina (vedere Tabella dei materiali) al pellet e risospendere il pozzetto del pellet mediante vortex o pipettaggio.
6. Aggiungere la proteinasi K (5% (v/v)) al pellet risospeso (ad esempio, aggiungere 10 μL di proteinasi K alla miscela da 200 μl) e mescolare bene con un leggero vortice.
7. Incubare la miscela di pellet a 55 °C per 30 min.
8. Aggiungere un volume di tampone di lisi genomica (vedere Tabella dei materiali) alla miscela di digestione (ad esempio, 210 μL di tampone di lisi genomica a 210 μL di miscela di digestione) e mescolare mediante vortice.
9. Trasferire la colonna di centrifuga disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali) in una nuova provetta di raccolta.
10. Aggiungere 200 μL di tampone Urine DNA Prep alla colonna di centrifugazione, centrifugare a ≥16.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente ed eliminare il flusso continuo.
11. Aggiungere 700 μL di tampone per il lavaggio del DNA urinario alla colonna, centrifugare a ≥16.000 x g per 1 minuto a temperatura ambiente ed eliminare il flusso continuo.
12. Ripetere il passaggio con 200 μL di tampone per il lavaggio del DNA urinario.
13. Trasferire la colonna di rotazione in una provetta per microcentrifuga priva di DNasi/RNasi.
14. Aggiungere il volume appropriato di tampone di eluizione del DNA (in base ai test molecolari da eseguire) direttamente sulla matrice della colonna e lasciarlo riposare per 3-5 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Nei casi di esempio sono stati utilizzati 30 μL di tampone di eluizione. Se sono necessari ulteriori test, viene utilizzato un tampone di eluizione più elevato.
15. Centrifugare a ≥16.000 x g a temperatura ambiente per 1 minuto per ottenere il DNA privo di cellule.

Risultati

Questi metodi di estrazione sono stati eseguiti su un numero limitato di casi per garantire un'adeguata resa e amplifiabilità del DNA libero da cellule rispetto al DNA cellulare dei campioni vitrei (quattro) e acquosi (quattro). Da questi campioni, le rese di DNA dalla componente priva di cellule di questi fluidi sono simili a quelle della componente cellulare (Tabella 1). Anche le cellule e il cfDNA di questi campioni sono stati valutati utilizzando test molecolari, come per la mutazione associata a VRL MYD88 L265P. Una PCR in tempo reale specifica per l'allele per MYD88 L265P (Figura 1) illustra il rilevamento di questa mutazione associata a VRL sia nel DNA cellulare che nel cfDNA. In questo esempio, il carico di malattia sembra essere più elevato nella componente priva di cellule, come illustrato da una soglia di ciclo (Ct) più bassa. Questi dati illustrano che il cfDNA estratto dall'umor vitreo e acqueo utilizzando questo metodo si traduce in una fonte di DNA che può essere applicata anche ai test molecolari diagnostici.

Figura 1: PCR in tempo reale specifica per l'allele MYD88 L265P. Grafico di amplificazione rappresentativo che mostra la PCR in tempo reale specifica per l'allele MYD88 L265P per DNA cellulare e libero (ogni reazione PCR eseguita in duplicato). La soglia per la soglia del ciclo (Ct) è indicata dalla linea verde. Vengono etichettati i punti in cui l'amplificazione del cfDNA (tracce blu e marroni) e del DNA cellulare (tracce rosse e verdi) - ciascuna eseguita in duplicato - raggiunge la soglia. La fluorescenza di fondo è presente vicino a 1.00e-003. Un carico di mutazione più elevato è presente nella componente priva di cellule, come dimostrato da un CT più basso. Fare clic qui per visualizzare una versione più ampia di questa figura.

	Cellulare	Senza cellule
Vitreo 1	130.5	67.5
Vitreo 2	337.5	105
Vitreo 3	150	168
Vitreo 4	1816	654
Acquoso 1	58.5	40.5
Acquoso 2	153	225
Acquoso 3	117	454.5
Acquoso 4	TL	27

Tabella 1: Rese di estrazione del DNA cellulare e privo di cellule. Resa del DNA (in ng) per quattro fluidi vitrei non diluiti e quattro umori acquei (camera anteriore) di quattro individui diversi sulla base della quantificazione fluorimetrica del DNA. TL = troppo basso per essere quantificato.

Figura supplementare 1: Sacca per cassette vitree. Esempio di sacca a cassetta vitrea contenente liquido vitreo diluito. Fare clic qui per scaricare il file.

Discussione

Il linfoma vitreoretinico (VRL) è un linfoma aggressivo a grandi cellule B ^1,2,3 i cui sintomi possono imitare altre malattie vitreoretiniche ^4,5. I test molecolari dell'umor vitreo e, più recentemente, dell'umor acqueo sono diventati un metodo fondamentale per fare la diagnosi di VRL o escluderlo. Tuttavia, questi fluidi hanno un volume molto basso e spesso hanno una bassa cellularità. Molte delle cellule all'interno di questi fluidi possono anche essere danneggiate durante la raccolta, la conservazione e la lavorazione^13,14,15. Di conseguenza, le rese di DNA da questi campioni sono spesso basse. Inoltre, le cellule di questi fluidi devono essere condivise con altri metodi diagnostici, tra cui la citopatologia e la citometria a flusso. Il DNA libero da cellule (cfDNA) all'interno di questi fluidi fornisce un'altra fonte di DNA che non richiede cellule intatte.

Questo protocollo separa i componenti cellulari e privi di cellule del liquido vitreo o acquoso. Il fluido vetroso viene diluito con PBS per consentire il pipettaggio a causa della sua viscosità. Il fluido acquoso viene gestito per garantire il massimo recupero di questo fluido a bassissimo volume.

Un confronto tra le rese di DNA di questi due componenti illustra che un sostanziale acido nucleico aggiuntivo può essere derivato dal componente privo di cellule. I test molecolari del cfDNA, come la PCR in tempo reale specifica per l'allele MYD88 L265P, dimostrano che il VRL può essere rilevato nella componente priva di cellule dell'umor vitreo e acqueo e nella componente cellulare. In molti casi, la quantità relativa di VRL è maggiore nella componente priva di cellule rispetto a quella cellulare (Figura 1).

L'estrazione della componente priva di cellule del fluido vitreo e acquoso consente la valutazione molecolare di un componente di questi fluidi che altrimenti verrebbe scartato. Poiché il VRL è rappresentato in componenti cellulari e privi di cellule, il DNA cellulare e il cfDNA potrebbero essere combinati per massimizzare il DNA disponibile da questi campioni limitati. In alternativa, la componente priva di cellule di questi fluidi potrebbe essere utilizzata per i test molecolari e la componente cellulare potrebbe essere utilizzata per i test che richiedono cellule intatte, ad esempio citopatologia e citometria a flusso. Questo approccio eviterebbe l'assegnazione di aliquote separate di questi fluidi a ciascuna prova, il che può compromettere la sensibilità di ciascuna prova per la rilevazione di VRL. Dato il successo di questo metodo in campioni vitrei e acquosi, questo metodo può essere utile anche in altri fluidi limitati per aumentare la quantità di DNA disponibile per i test molecolari.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-propanolo (isopropanolo)	Fischer	A415-500
DNA pulito e Concentratore-10	Zymo Research	D4011
DNA Pulito & Concentratore-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Soluzione di lisi cellulare	Qiagen	158906
Gentra Puregene Soluzione di idratazione del DNA	Qiagen	158916
Gentra Puregene Soluzione di precipitazione proteica	Qiagen	158912
soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Kit per urine	Zymo Research	D3061	Tampone di condizionamento; include anche perle di pulizia, proteinasi K e colonne di spin
Glicogeno ultrapuro, 20 e micro; g/µ L (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010