Lo sviluppo e l'applicazione di saggi biofisici per la valutazione della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS)

Summary

Qui descriviamo i protocolli per la caratterizzazione biofisica della formazione di complessi ternari indotti da chimere mirate alla proteolisi (PROTACS) che coinvolgono le ubiquitina ligasi Von Hippel-Lindau E3 ligasi (VHL) e Cereblon (CRBN). I metodi biofisici qui illustrati includono la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria del biostrato (BLI) e la calorimetria di titolazione isotermica (ITC).

Abstract

Le ligasi E3 e le proteine bersaglio della degradazione possono essere indotte a formare complessi da molecole eterobifunzionali in un processo a più fasi. La cinetica e la termodinamica delle interazioni coinvolte contribuiscono all'efficienza dell'ubiquitinazione e alla conseguente degradazione della proteina. Le tecniche biofisiche come la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria del biostrato (BLI) e la calorimetria di titolazione isotermica (ITC) forniscono informazioni preziose che possono essere utilizzate nell'ottimizzazione di tali interazioni. Utilizzando due sistemi modello, è stato stabilito un kit di strumenti di analisi biofisica per comprendere la cooperatività della formazione di complessi ternari e l'impatto dell'"effetto gancio" sulla cinetica di legame. In un caso, è stata valutata una molecola di chimera mirata alla proteolisi (PROTAC) che induce la formazione di complessi ternari tra Brd4^BD2 e VHL. La molecola eterobifunzionale, MZ1, ha affinità nM sia per la proteina Brd4^BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) che per il complesso VHL (SPR K D = 29 nM, ITC K _D = 66 nM). Per questo sistema, sono stati sviluppati robusti saggi SPR, BLI e ITC che hanno riprodotto i risultati pubblicati che dimostrano la cooperatività della formazione di complessi ternari. Nell'altro caso, è stata studiata una molecola che induce complessi ternari tra una proteina da 46,0 kDa, PPM1D, e il cereblon [CRBN (319-442)]. La molecola eterobifunzionale, BRD-5110, ha un SPR K D = 1 nM per PPM1D ma un legame molto più debole contro il complesso CRBN troncato (319-442) (SPR K_D = ~ 3 μM). In quel caso, il legame per CRBN in SPR non era saturabile, determinando un "effetto gancio". Sono stati valutati i requisiti di produttività e reagenti per SPR, BLI e ITC e sono state fornite raccomandazioni generali per la loro applicazione ai progetti PROTAC.

Introduction

La poliubiquitinazione delle proteine nella cellula è un processo strettamente regolato che coinvolge gli enzimi della famiglia delle ubiquitina ligasi ^1,2. Gli enzimi terminali nella via sono le ubiquitina ligasi E3 che legano covalentemente le molecole di ubiquitina ai loro partner che legano le proteine³. La poliubiquitinazione di questi partner di legame proteico li indirizza alla degradazione proteolitica da parte del proteasoma⁴. Questo sistema fa parte del processo di omeostasi proteica che è stato sfruttato terapeuticamente per indurre la degradazione delle proteine coinvolte nella malattia⁵. Le piccole molecole che inducono l'interazione tra le ubiquitina ligasi E3, come la ligasi E3 di Von Hippel-Lindau (VHL) o il cereblon (CRBN), sono tipicamente composte da una testata legante la ligasi E3 collegata da un linker flessibile a una testata che si lega alla proteina bersaglio per la degradazione. Queste molecole eterobifunzionali sono comunemente indicate come chimere mirate alla proteolisi o PROTACS⁶.

Lo sviluppo di PROTACS comporta la valutazione della capacità delle molecole di indurre la degradazione delle proteine nelle cellule. Sono stati sviluppati molti sistemi di saggi cellulari che monitorano l'interazione indotta tra la proteina bersaglio e i componenti della ligasi E3, come VHL o CRBN, dopo il trattamento delle cellule con una molecola PROTAC. Uno di questi saggi cellulari, il sistema nanoluc-Halotag⁷, coinvolge una ligasi E3 fusa all'accettore Halotag e una proteina bersaglio marcata con un donatore nanoluc. La formazione del complesso ternario porta il donatore di nanoluc e l'accettore di Halotag in prossimità, consentendo il trasferimento di energia dal donatore all'accettore con conseguente emissione di luce. Le variazioni di questo sistema possono essere utilizzate per valutare la permeabilità cellulare delle molecole PROTACS⁸ o i cambiamenti nel livello relativo di ubiquitinazione della proteina bersaglio⁹. Mentre questi sistemi cellulari sono essenziali per guidare l'ottimizzazione di PROTACS, la formazione di complessi tra le ligasi E3 e le proteine mirate alla degradazione è un processo a più fasi^10,11. La cinetica e la termodinamica delle interazioni binarie e ternarie coinvolte contribuiscono all'ubiquitinazione dell'efficienza e alla conseguente degradazione della proteina^12,13,14.

Di seguito sono descritti protocolli che possono essere adattati per la caratterizzazione biofisica della formazione di complessi ternari indotti da PROTACS utilizzando la risonanza plasmonica di superficie (SPR), l'interferometria del biostrato (BLI) e la calorimetria di titolazione isotermica (ITC). I protocolli SPR e ITC per la molecola MZ1 PROTAC che induce la formazione di complessi ternari tra Brd4,^BD2 e VHL derivati dai rapporti di letteratura^13,15 e qui descritti sono stati in grado di ricapitolare i risultati riportati con alcune modifiche alle procedure riportate^, che verranno discusse. In questo rapporto è inclusa una descrizione di un saggio BLI utilizzato per valutare la formazione di complessi ternari tra MZI, Brd4^BD2 e VHL. Le misurazioni dell'affinità da BLI sono risultate coerenti con quelle osservate in SPR e ITC. Viene inoltre descritto un protocollo precedentemente pubblicato in cui è stato sviluppato un saggio SPR per valutare la formazione di complessi ternari indotti da PROTAC tra PPM1D, una proteina fosfatasi Ser/Thr la cui espressione è indotta in modo p53-dipendente¹⁶, e CRBN. In questo caso, la molecola PROTAC ha un'affinità nanomolare per PPM1D ma solo un'affinità micromolare per CRBN. In questo caso, il legame della molecola PROTAC al CRBN non è saturabile, con conseguente "effetto gancio" comunemente osservato. L'effetto gancio è una proprietà di tre sistemi di corpi in cui ci sono due specie che possono formare un complesso eterotrimerico quando entrambe sono legate a una molecola ponte (Figura 1)¹⁷. L'effetto gancio si osserva quando la specie ponte è in concentrazione eccessiva rispetto alle altre due specie. Lo stato risultante è quello in cui le interazioni binarie superano le interazioni ternarie. I sistemi in cui si osserva l'effetto gancio richiedono specifiche considerazioni di progettazione sperimentale discusse in questo rapporto. Vengono forniti i concetti generali e i requisiti dei reagenti per la valutazione dell'utilizzo di saggi biofisici per la valutazione della formazione di complessi ternari indotti da PROTAC.

Protocol

Tutte le proteine sono risultate sovraespresse in E.coli con buona resa e purezza (>80%) seguendo i protocolli di letteratura¹⁸. La biotinilazione è stata effettuata utilizzando una reazione catalizzata da BirA¹⁸. Tutte le piccole molecole sono state preparate in soluzioni madre da 1 mM in DMSO al 100%. Le procedure qui descritte non richiedono attrezzature di sicurezza o precauzioni di laboratorio specializzate. Devono essere utilizzati dispositivi di protezione individuale (DPI) standard da laboratorio (ad es. camice da laboratorio, occhiali di sicurezza e guanti).

Le proteine applicate in questo studio sono elencate di seguito:
VHL: complesso biotinilato VHL(53-213)/ElonginB (1-104)/ElonginC(17-112) con Avi-tag all'estremità C di ElonginB.
Brd4^BD2: Brd4^BD2 senza tag (333-460)
CRBN: CRBN biotinilato (319-442) con Avi-tag all'estremità N
PPM1D: PPM1D(1-420) senza tag o con doppio tag His8 all'estremità N

Le piccole molecole applicate in questo studio sono elencate di seguito:
MZ1 (MW = 1002.6 Da): PROTAC che si lega a VHL e Brd4^BD2
BRD-2512 (MW = 841.4 Da): CRBN K_D ~3 μM, non si lega a PPM1D
BRD-5110 (MW = 872.0 Da): CRBN K D ~3 μM, PPM1D K_D = 1-2 nM
BRD-4761 (MW = 476.6 Da): non si lega a CRBN, PPM1D K_D = 1-2 nM

1. Metodo 1: ITC (calorimetria isotermica di titolazione)

NOTA: Le titolazioni vengono eseguite utilizzando un microcalorimetro con autoiniezione.

1. Preparazione del tampone: Preparare 3 L di tampone contenente 20 mM di HEPES, 150 mM di NaCl, 1 mM di TCEP, pH 7,5.
2. Dialisi: Dializzare VHL e Brd4^BD2 (~ 500 μL a 150 μM ciascuno) rispetto a 1 L del tampone preparato nella fase 1.1, 3 volte a 4 °C, rispettivamente per 4 ore, 2 ore e circa 16 ore. Conservare il tampone dopo l'ultima dialisi per utilizzarlo nelle fasi successive.
3. Preparare i campioni su una piastra a 96 pozzetti con un coperchio di plastica.
   1. Per ogni titolazione, preparare 400 μL di soluzione per la cella, 125 μL per la siringa e 400 μL di tampone per la pulizia. Aggiungere i campioni a tre pozzetti consecutivi sulla piastra. Poiché il brodo composto viene preparato a 1 mM in DMSO al 100%, aggiungere la stessa percentuale di DMSO alle soluzioni proteiche per garantire il tampone corrispondente nella cellula e nella siringa. Aggiungere il 2% di DMSO alle soluzioni finali.
      1. Campione per la titolazione di VHL in MZ1: Preparare una soluzione cellulare contenente 392 μL di tampone, 4 μL di MZ1 a 1 mM (concentrazione finale di 10 μM) e 4 μL di DMSO al 100%. Preparare una soluzione siringa contenente 122,5 μL di VHL a 85,7 μM, 2,5 μL di DMSO al 100% (concentrazione finale 84 μM).
      2. Campioni per la titolazione di VHL nel tampone (i dati saranno utilizzati per la sottrazione di fondo dei dati generati dal campione 1.3.1.1): Preparare una soluzione cellulare contenente 392 μL di tampone, 8 μL di DMSO al 100%. Preparare una soluzione siringa contenente 122,5 μL di VHL a 85,7 μM (concentrazione finale di 84 μM) e aggiungere 2,5 μL di DMSO al 100%.
      3. Campioni per la titolazione di VHL in MZ1 e Brd4 BD2: Preparare una soluzione cellulare contenente 392 μL di 17,1 μM Brd4^BD2 (concentrazione finale 16,8 μM), 3,36 μL di MZ1 a 1 mM (concentrazione finale 8,4 μM) e 4,64 μL di DMSO al 100%. Preparare una soluzione siringa contenente 122,5 μL di VHL a 85,7 μM (concentrazione finale di 84 μM) e 2,5 μL di DMSO al 100%.
      4. Campioni per la titolazione di VHL in Brd4 BD2 (sfondo di 1.3.1.3): Preparare una soluzione cellulare contenente 392 μL di 17,1 μM Brd4^BD2 (concentrazione finale 16,8 μM) e 8 μL di DMSO al 100%. Preparare una soluzione siringa contenente 122,5 μL di VHL a 85,7 μM (concentrazione finale di 84 μM) e 2,5 μL di DMSO al 100%.
4. Eseguire tutte e quattro le titolazioni sul microcalorimetro. Ciascuna consiste in 19 iniezioni di soluzione siringa da 2 μL alla velocità di 2 μL/s a intervalli di tempo di 120 s. Effettuare un'iniezione iniziale di proteina (0,4 μL) e scartarla durante l'analisi dei dati. Eseguire tutti gli esperimenti a 25 °C, agitando a 600 giri/min.
5. Analisi dei dati: adattare i dati a un modello a singolo sito di legame per ottenere la stechiometria (n), la costante di dissociazione (K_D) e l'entalpia di legame (ΔH) utilizzando il software di analisi fornito dal produttore (Figura 2).

2. Metodo 2: BLI (interferometria a biostrato)

1. Eseguire esperimenti BLI utilizzando sensori rivestiti di streptavidina (SA) a temperatura ambiente (RT) con una velocità di acquisizione di 5 Hz. Durante l'esperimento BLI automatizzato, assicurarsi che i sensori siano stazionari all'interno di una singola colonna e che si muovano tra le diverse colonne di una piastra nera a fondo piatto a 96 pozzetti con un volume massimo di 392 μL. Riempire ogni pozzetto della piastra utilizzata nell'esperimento con 200 μL di soluzione.
   NOTA: BLI è utile solo per rilevare le interazioni proteina-proteina (cioè la formazione di complessi ternari). Non è abbastanza sensibile da rilevare le interazioni tra proteine e piccole molecole.
   1. Preparazione del tampone: Preparare 100 mL di tampone contenente 20 mM di HEPES, 150 mM di NaCl, 1 mM di TCEP, 0,05% di P20, pH 7,5.
   2. Ottimizzazione per la fase di immobilizzazione: Caricare il sensore di prova a 1-3 nm, come raccomandato dal produttore. Per le procedure qui descritte viene utilizzato un carico di ~1,0 nm. A tale scopo, immergere il sensore in una soluzione contenente VHL a 1,5 μg/mL per 80 s.
   3. Eseguire misure cinetiche BLI applicando sette sensori SA utilizzando la seguente sequenza:
      1. Per la prima fase di base, immergere nel buffer per 60 s.
      2. Per la fase di immobilizzazione, immergere in una soluzione di VHL a 1,5 μg/mL per 80 s.
      3. Per la seconda fase di base, immergere nel buffer per 60 s.
      4. Per la fase di associazione, immergere in soluzione una concentrazione fissa di Brd4^BD2 a 2 μM, una concentrazione fissa di DMSO al 2% e concentrazioni variabili di MZ1 a 100 nM, 50 nM, 25 nM, 12,5 nM, 6,3 nM, 3,1 nM e 0 nM (sensore di riferimento) per 300 s.
      5. Per la fase di dissociazione, immergere nel tampone per 600 s.
   4. Eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software del produttore. k _on, k off e k_D sono riportati per _{l'adattamento} dei dati (Figura 3).

3. Metodo 3: SPR (risonanza plasmonica di superficie)

NOTA: Tutti gli esperimenti SPR vengono eseguiti utilizzando chip sensore rivestiti di streptavidina (SA) a RT. Sebbene il chip NTA sia utilizzato per la rilevazione tra proteine e piccole molecole, deve essere utilizzato con cautela quando viene applicato al complesso ternario, poiché si osserva un fondo molto più alto rispetto al chip SA, probabilmente a causa delle interazioni elettrostatiche tra la superficie del chip caricato e la proteina nell'analita.

1. SPR per l'interazione VHL-MZ1
   1. Preparazione del tampone.
      1. Preparare un tampone da 1 L contenente 20 mM di HEPES, 150 mM di NaCl, 1 mM di TCEP, 0,005% P20, pH7,5 e farlo passare attraverso un'unità filtrante da 0,2 μm.
      2. Rimuovere 20 mL di tampone per un uso futuro (tampone privo di DMSO) e riempire con 20 mL di DMSO (2% di DMSO nel tampone finale in esecuzione). Mantenere il DMSO al 2% in tutti i campioni descritti di seguito (passaggi 3.1 e 3.2)
   2. Attivare il chip SA seguendo il protocollo del produttore e immobilizzare VHL a ~2000 RU (iniettare una soluzione proteica di 5 μg/mL a 5 μL/min).
   3. Preparare MZ1 in una diluizione seriale a 8 punti a 3 punti con la concentrazione massima a 10 μM su una piastra in polipropilene traslucido a fondo conico a 384 pozzetti con un volume massimo di 130 μL. Coprire la piastra con fogli di plastica autoadesivi, trasparenti compatibili con micropiastre in polipropilene.
      1. Preparare la concentrazione massima con il tampone privo di DMSO per garantire il 2% di DMSO alla concentrazione finale. A 147 μL di tampone privo di DMSO, aggiungere 1,5 μL di MZ1 stock a 1 mM e 1,5 μL di DMSO al 100%.
      2. Preparare la diluizione seriale a 3 pieghe con il tampone in esecuzione contenente il 2% di DMSO. A 100 μL del tampone corrente, aggiungere 50 μL di soluzione alla concentrazione massima preparata al punto 3.1.3.1 e mescolare bene per preparare la 2a^{concentrazione più alta} .
      3. Quindi trasferire 50 μL della soluzione preparata al punto 3.1.3.2 ai successivi 100 μL di tampone corrente, mescolare bene per preparare la 3a^{concentrazione più alta} e così via.
   4. Eseguire SPR utilizzando la configurazione multiciclo: Modalità: Alte prestazioni; tempo di contatto: 120 s; tempo di dissociazione: 300 s; portata: 50 μL/min.
   5. Eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software di valutazione fornito dal produttore dello strumento. L'analisi allo stato stazionario ha indicato K,_D = 26 (± 3) nM e Rmax di ~91% (± 5%) di legame raggiunto (Figura 4A)
2. SPR per VHL: MZ1: complesso ternario Brd4^BD2
   1. Preparare il tampone come descritto al punto 3.1.1.
   2. Attivare il chip SA seguendo il protocollo del produttore e immobilizzare VHL a ~100 RU. Iniettare una soluzione proteica di 0,5 μg/mL VHL a una velocità di flusso di 5 μL/min e un tempo di contatto compreso tra 1-5 min fino a raggiungere una densità superficiale di ~100 RU.
   3. Preparare i campioni per due iniezioni a ciclo singolo a 5 punti in una piastra a fondo rotondo in polistirene trasparente a 96 pozzetti con un volume massimo di 323 μL e coprirla con fogli di plastica autoadesivi, trasparenti, compatibili con le micropiastre in polistirene come descritto nelle fasi da 3.2.3.1 a 3.2.3.2.
      1. Controllo negativo: l'analita contiene solo Brd4^BD2 .
         1. Preparare la concentrazione massima a 25 μM in tampone di funzionamento con un volume di 200 μL (#A5)
         2. Aggiungere 160 μL ciascuno di Brd4^BD2 a 2 μM nel buffer di funzionamento ai successivi 4 pozzetti a sinistra (#A1-A4)
         3. Trasferire 40 μL da A5 ad A4. Mescolare bene.
         4. Trasferire 40 μL di A4 in A3. Mescolare bene. Continuate così fino ad A1.
      2. Formazione di complessi ternari: l'analita contiene MZ1 e Brd4^BD2.
         1. Preparare la concentrazione massima aggiungendo 4 μL di MZ1 a 20 μM in soluzione di DMSO al 100% a 196 μL contenenti 25,5 μM di Brd4^BD2 in tampone privo di DMSO (#B5). Le concentrazioni finali sono 25 μM Brd4^BD2, 100 nM MZ1 e 2% DMSO.
         2. Aggiungere 160 μL ciascuno di Brd4^BD2 a 2 μM nel tampone di funzionamento ai successivi 4 pozzetti a sinistra (#B1-B4)
         3. Trasferire 40 μL di B5 a B4. Mescolare bene.
         4. Trasferire 40 μL di B4 a B3. Mescolare bene. Continuate così fino a B1.
   4. Eseguire SPR utilizzando la configurazione a ciclo singolo: Tempo di contatto: 100 s; tempo di dissociazione: 720 s; portata: 50 μL/min. Applicare tre iniezioni di tampone prima di ogni campione per garantire uno sfondo stabile.
   5. Analisi dei dati: applicare la terza iniezione del buffer come sfondo per la sottrazione. Come controllo negativo, quando MZ1 non è presente, la risposta SPR tra VHL e Brd4^BD2 è trascurabile. Quando MZ1 è presente, l'adattamento cinetico indica che l'interazione tra VHL e il complesso^BD2 MZ1-Brd4 ha k _on = 7.9 (± 1.5) *10⁷ /M/s, k_off = 0.014 ^s-1 e K_D = 1 nM. (Figura 4B)
3. SPR per CRBN e interazioni con piccole molecole
   1. Preparazione del tampone.
      1. Preparare un tampone da 1 L contenente 50 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl 2, 0,5 mM TCEP, 0,005% P20, pH 7,5 e farlo passare attraverso un'unità filtro da_0,2 μm.
      2. Rimuovere 20 mL di tampone e rabboccare 20 mL di DMSO al 100% (2% di DMSO nel tampone finale in esecuzione). È importante mantenere il DMSO al 2% in tutti i campioni descritti di seguito (passaggi 3.3, 3.4 e 3.5).
   2. Attivare il chip SA seguendo il protocollo del produttore e immobilizzare CRBN a ~800 RU.
   3. Preparare i composti in diluizione seriale a 3 punte e 6 punti su una piastra da 384 pozzetti con una concentrazione massima di 30 μM, come descritto al punto 3.1.3.
   4. Eseguire SPR utilizzando la configurazione multiciclo: Modalità: Alte prestazioni, tempo di contatto: 60 s, tempo di dissociazione: 90 s; portata: 50 μL/min. Per questo sistema, tre iniezioni di tampone sono sufficienti per ottenere un fondo stabile. Per altri sistemi di analisi, potrebbe essere necessario eseguire ulteriori iniezioni di tampone.
   5. Eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software del produttore.
      NOTA: L'analisi allo stato stazionario indica che_{K D} di BRD-2512 e BRD-5110 sono entrambi intorno a 3 μM. Tuttavia, il legame ha raggiunto solo ~ 70% di legame_massimo R alla concentrazione massima. Sia la debole affinità che la forma del sensorgram indicano che è probabile che si verifichi l'insolubilità del composto ad alte concentrazioni. Pertanto, il K_D effettivo potrebbe essere superiore a 3 μM. BRD-4761, che non si lega al CRBN, è stato incluso come controllo negativo.
4. SPR per PPM1D e interazioni con piccole molecole
   1. Preparare il buffer come descritto al punto 3.3.1. Utilizzare un chip sensore di acido nitriloacetico (NTA).
   2. Applicare a ciclo singolo perché la testata PPM1D ha un k_acceso e k_spento lento. Rigenerare il chip NTA utilizzando la configurazione predefinita del produttore e immobilizzare PPM1D a ~ 1000 RU dopo ogni iniezione di composto (iniettare una soluzione proteica di 5 μg/mL a 5 μL/min).
   3. Preparare i composti in diluizione seriale a 5 punti con la concentrazione massima a 400 nM come descritto al punto 3.1.3.
   4. Eseguire SPR utilizzando la configurazione a ciclo singolo: Modalità: ad alte prestazioni; tempo di contatto: 90 s; tempo di dissociazione: 600 s; portata: 50 μL/min. Applicare tre iniezioni di tampone prima di ogni composto per garantire uno sfondo stabile.
   5. Analisi dei dati. Applicare la terza iniezione del tampone come sfondo per la sottrazione. Come controllo negativo, BRD-2512 non mostra legame con PPM1D. Per BRD-4761 e BRD-5110, il montaggio cinetico indicava che il KD per entrambi era 1-2 nM.
5. SPR per CRBN:PROTAC: complesso ternario PPM1D
   1. Preparare il buffer come descritto al punto 3.3.1.
   2. Attivare il chip SA seguendo il protocollo del produttore e immobilizzare CRBN a ~35 RU (iniettare una soluzione proteica di 0,5 μg/mL a 5 μL/min).
   3. Preparare tre composti in diluizione seriale a 6 punti con una concentrazione massima di 30 μM mantenendo [PPM1D] a 1 μM in tutti i campioni, compresi i bianchi, utilizzando il metodo descritto al punto 3.2.3.
   4. Eseguire SPR utilizzando la configurazione multiciclo: Modalità: Alte prestazioni; tempo di contatto: 60 s; tempo di dissociazione: 90 s; portata: 50 μL/min.
   5. Eseguire l'analisi dei dati utilizzando il software del produttore.
      NOTA: Mentre BRD-2512 e BRD-4761 mostrano una risposta assente o trascurabile, BRD-5110 mostra chiaramente l'"effetto gancio" allo stato stazionario con cinetica on/off rapida (Figura 5A-C). La risposta di legame sperimentale di BRD-5110 (Figura 5C) è intermedia tra la risposta prevista dalla simulazione quando si assume che K D (CRBN, cpd) sia di 3 o 10 μM (Figura 5E), suggerendo che il K D ternario e il K_D binario sono molto simili. Non c'è apparente cooperatività di PPM1D: BRD-5110: formazione del complesso CRBN.

Results

La caratterizzazione del complesso binario VHL: MZ1 e del complesso ternario VHL: MZ1: Brd4^BD2 può essere trovata nella Figura 2 (ITC), nella Figura 3 (BLI) e nella Figura 4 (SPR) utilizzando un buffer molto simile. Il K_D estratto dai saggi ortogonali è coerente. La cooperatività può essere calcolata con K D (binario) / K_D (ternario), che è molto positivo (15 da ITC o 26 da SPR).

La caratterizzazione del sistema CRBN:PROTAC: PPM1D è stata eseguita mediante SPR (Figura 5A-D). Il CRBN è stato immobilizzato a ~35 UR per facilitare l'osservazione della formazione di complessi ternari. Il legame di PROTAC da solo ha provocato un segnale di <2 RU che è al di sotto del rumore. PPM1D nell'analita fornisce un segnale di fondo elevato sulla superficie del chip SA e la concentrazione massima che può essere applicata è di circa 1 μM. Questo valore è inferiore al K_D tra CRBN e la sua testata ≥3 μM), quindi ci si aspetta un "effetto gancio". L'SPR è abbastanza sensibile da rilevarlo, il che è in buon accordo con la simulazione (Figura 5E). La simulazione è stata effettuata utilizzando gli equilibri non cooperativi in letteratura¹⁹ combinati con il classico calcolo SPR [Response max = (Response_Ligand × Mass_{Immobilization})/_{Mass Ligand}]. Poiché il K_D tra CRBN e composto non è determinato con precisione a causa dell'insolubilità del composto ad alta concentrazione, la simulazione è stata eseguita utilizzando quattro KD presuntivi: 1 μM, 3 μM, 10 μM o 30 μM. I risultati sperimentali sono caduti tra le curve simulate da 3 μM e 10 μM, che è quasi identica alla K_D nel sistema binario, suggerendo che non c'è cooperatività.

Figura 1: Illustrazione di tre scenari di legame e definizione di diversi K_D. (A) Sistemi classici a due componenti. (B) Sistema a tre componenti in cui un'estremità di PROTAC può essere saturata, quindi può essere valutato come un sistema a due componenti. (C) Sistema a tre componenti in cui si osserva l'"effetto gancio". Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Risultati ITC. Titolazione di VHL nel complesso MZ1 (a sinistra) o MZ1:Brd4^BD2 (a destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Risultati BLI. MZ1 media la formazione del complesso ternario VHL: MZ1: Brd4^BD2. (A) Dati grezzi. (B) Sottrazione di segnali di fondo dove [MZ1] = 0. (C) Adattamento cinetico di B per estrarre k _on, k_off e K_D. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Risultati SPR . (A) Legame MZ1 a VHL. (B) MZ1:Brd4^BD2 complesso binario che si lega a VHL. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Risultati SPR che mostrano l'"effetto gancio" di un PPM1D-PROTAC rappresentativo. CRBN è stato immobilizzato sulla superficie del chip SA mentre [PPM1D] è stato mantenuto a 1 μM nell'analita per tutti i casi. (A) BRD-2512, un composto che si lega solo a CRBN, non dà quasi nessuna risposta. (B) Anche BRD-4761, un composto che si lega solo a PPM1D, non dà alcuna risposta. (C,D) BRD-5110, un PROTAC con la testata di CRBN in BRD-2512 e la testata di PPM1D in BRD-4761, ha indotto la formazione del complesso ternario. (E) Una simulazione dei risultati SPR assumendo che il K_D tra CRBN e composto sia 1 μM (nero), 3 μM (blu), 10 μM (rosso) o 30 μM (verde). La curva BRD-2512 è compresa tra 3 μM e 10 μM, che è molto vicina alla binaria misurata K_D, suggerendo l'assenza di cooperatività (cooperatività = 1). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

La caratterizzazione biofisica delle interazioni binarie e ternarie tra le molecole PROTAC e i loro partner di legame proteico può fornire informazioni uniche e complementari relative a sistemi cellulari ampiamente utilizzati. Comprendere l'affinità tra ciascuna testata di una molecola PROTAC e i suoi partner di legame proteico può aiutare a guidare gli sforzi della chimica farmaceutica verso l'ottimizzazione di tali interazioni. Strutture cristalline di complessi ternari PROTAC pubblicate in precedenza hanno rivelato che gli atomi nella regione del linker possono formare interazioni con uno o entrambi i partner di legame proteico^16,20. Determinare sperimentalmente la cooperatività della formazione di complessi ternari può supportare l'ottimizzazione del linker.

In questo rapporto viene descritto l'utilizzo di tre diverse tecniche biofisiche in grado di fornire informazioni sulle affinità di legame tra le molecole PROTAC e i loro partner di legame proteico. Il metodo 1 descrive in dettaglio il set-up sperimentale della calorimetria di titolazione isotermica (ITC) per la molecola PROTAC, MZ1, il complesso VHL E3 ligasi e il bromodominio^{Brd4 BD2}. I risultati dell'ITC hanno mostrato K_D di 59 nM per l'interazione binaria tra MZ1 e VHL e di 4 nM per l'interazione ternaria tra VHL e MZ1 e Brd4^BD2 premiscelati. Le affinità erano coerenti con quelle osservate in SPR (legame VHL immobilizzato a MZ1 K_D = 26 nM, legame VHL immobilizzato a MZ1 e Brd4^BD2 premiscelati K D=1 nM) e BLI (K_D= 2,8 nM). Mentre i risultati ITC K_D per il legame di VHL a MZ1 sono coerenti con i valori riportati¹⁶, la stechiometria ottenuta è diversa. Una possibile spiegazione di questo risultato è la scarsa solubilità di MZ1 nel tampone basato su HEPES utilizzato nel protocollo qui descritto, mentre i risultati della letteratura sono stati generati utilizzando un tampone basato su Bis-tris. Gli autori hanno preferito utilizzare gli stessi componenti del buffer in SPR, ITC e BLI.

Il metodo 2 descrive il setup sperimentale per l'analisi BLI dell'interazione tra VHL immobilizzato, una concentrazione fissa di Brd4^BD2 e concentrazioni variabili di MZ1. A causa dei limiti di sensibilità della tecnica, è stato possibile generare valori di K_D, k_on e k_off per la formazione di complessi ternari, ma non per l'interazione binaria tra MZ1 e le proteine.

Il metodo 3 descrive più saggi SPR. L'SPR è più sensibile del BLI e può essere applicato per osservare sia le interazioni proteina-piccola molecola (binaria) che proteina-proteina (ternaria). In quest'ultimo caso, i segnali di fondo devono essere attentamente monitorati in quanto le proteine nell'analita potrebbero dare segnali elevati e instabili. L'SPR è molto sensibile ai reagenti con un alto indice di rifrazione, tra cui DMSO, glicerolo e detergenti. Se la proteina è immagazzinata nel tampone contenente glicerolo o detergente, il tampone corrente deve contenere concentrazioni corrispondenti di tali componenti. In alternativa, l'applicazione della cromatografia ad esclusione dimensionale li rimuove completamente prima di qualsiasi esperimento SPR. È necessario prestare attenzione a far corrispondere strettamente le concentrazioni di DMSO tra i campioni tampone e analita. Le correzioni del solvente DMSO vengono eseguite secondo le istruzioni del produttore.

Il metodo nel passaggio 3.1 descrive il saggio SPR per l'interazione binaria VHL-MZ1. Il metodo 3.2 descrive il saggio SPR per il complesso ternario VHL: MZ1: Brd4 BD2 in cui VHL è immobilizzato e l'analita è Brd4 BD2 da solo o il complesso MZ1:Brd4^BD2. In questo sistema, l'interazione tra Brd4^BD2 e VHL è trascurabile. La formazione del complesso ternario è altamente cooperativa (ɑ = 26). L'off-rate per la formazione di complessi ternari è 0,014 ^s-1, che richiede l'uso della cinetica a ciclo singolo. I risultati dell'ITC mostrano anche una formazione di complessi ternari altamente cooperativi (ɑ=15). I metodi SPR nelle fasi 3.3, 3.4 e 3.5 descrivono i saggi per valutare la formazione di un complesso tra CRBN e PPM1D indotto dalla presenza di una molecola PROTAC, BRD-5110. La molecola PROTAC ha una debole affinità per CRBN (K D ~ 3 μM) e una forte affinità per PPM1D (K_D = 1-2 nM). Di conseguenza, il debole legame con CRBN non è saturo e si traduce in un "effetto gancio" osservato. Sebbene sia possibile aumentare la solubilità del ligando aumentando la concentrazione di DMSO utilizzata nell'esperimento, è importante in questi casi monitorare attentamente la stabilità della proteina che può essere influenzata negativamente da alte concentrazioni di DMSO. Inoltre, il DMSO ha un elevato calore di dissoluzione che può oscurare il calore di legame dei ligandi alle proteine. Deve essere prestata attenzione a far corrispondere le concentrazioni di DMSO della soluzione nella siringa e della soluzione nella cellula. Gli autori raccomandano la dialisi delle due soluzioni rispetto allo stesso preparato tampone.

Vengono fornite raccomandazioni e linee guida generali sulla base degli esperimenti eseguiti e riportati qui. Quando le affinità delle interazioni binarie tra le molecole PROTAC e i loro partner di legame proteico sono forti (K_D <1 μM), SPR fornisce affinità affidabili e riproducibili insieme a preziose informazioni sulla cooperatività della formazione di complessi ternari. Quando le affinità dell'interazione binaria tra uno dei partner di legame della proteina e la molecola PROTAC sono deboli (K_D >1 μM), la configurazione del saggio dovrà essere modificata. In questi casi, l'uso di simulazioni molecolari in cui le costanti di legame sono fisse e le concentrazioni di ligando e analita sono variate può essere utile per guidare la progettazione del saggio e interpretare i risultati sperimentali. I saggi ITC forniscono informazioni importanti sulla stechiometria del legame, ma richiedono un numero significativamente maggiore di reagenti proteici e composti rispetto a SPR e BLI. Inoltre, la solubilità della molecola PROTAC può essere limitante per gli esperimenti ITC. Il BLI ha una produttività maggiore rispetto all'ITC e richiede meno proteine e reagenti composti. Tuttavia, a causa dei limiti di sensibilità, il BLI può essere utilizzato solo per valutare la formazione di complessi ternari e non le interazioni binarie tra le molecole PROTAC e i loro partner di legame proteico. Si raccomanda di utilizzare SPR per i test di routine dei saggi di legame PROTAC binari e ternari e dei saggi BLI e ITC utilizzati per la convalida ortogonale dei risultati di SPR.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastre nere Greiner	a	96 piastre	fondo piatto utilizzate negli esperimenti BLI
Piastra a 96 pozzetti	Nunc	73520-120	Uso della piastra per la preparazione dei campioni ITC
Piastra a 96 pozzetti	Greiner	650101	Piastra utilizzata per preparare i campioni per gli esperimenti SPR
Microcalorimetro Auto iTC200	Malvern Panalytical		Strumento utilizzato per eseguire esperimenti ITC. Prodotto fuori produzione.
Biacore S200	Cytiva	29136649	Strumento utilizzato per eseguire esperimenti SPR
MZ1	ProbeChem	PC-60099	PROTAC che si lega al chip del sensore NTA VHL e Brd4BD2
	Cytiva	BR100532	chip SPR utilizzato per eseguire esperimenti SPR che coinvolgono PPM1D
Octet Red-384	Sartorius		Instrument utilizzato per eseguire esperimenti BLI. Prodotto fuori produzione.
Coperchio della piastra	Malvern	PQA0001	Coperchio per piastra Nunc a 96 pozzetti (73520-120)
Coperchio della piastra	Cytiva	28975816	Coperchio della piastra per piastra Greiner (650101)Chip
sensore SA serie S Cytiva		BR100531	chip SPR utilizzato per eseguire esperimenti SPR che coinvolgono i biosensori MZ1:VHL:BRD4
Streptavidin (SA) Dip and Read	Sartorius	18-509	Sensori rivestiti utilizzati in BLI Esperimenti