Articolo metodologico

Alleviamento della nefropatia da IgA mediata dalla dioscina inibendo l'attivazione delle cellule B in vivo e diminuendo la produzione di IgA1 carente di galattosio in vitro

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DOI:

10.3791/65719

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13 ottobre 2023

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1Department of Nephrology, Guanganmen Hospital, 2Department of Nephrology, 906 Hospital of Joint Logistic Support Force of People's Liberation Army (PLA), 3Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo studio fornisce dati sperimentali per il trattamento della nefropatia da immunoglobulina A (IgAN) con Dioscina (DIO), il principio attivo di Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) e un paradigma per lo studio degli effetti della fitoterapia e dei meccanismi sottostanti in vivo e in vitro.

Abstract

L'aumento delle IgA1 circolanti carenti di galattosio (Gd-IgA1) è causato da un'eccessiva attivazione delle cellule secretorie IgA-positive nel processo di risposte immunitarie della mucosa, che è un anello critico nella patogenesi della nefropatia da IgA (IgAN). Il cerotto di Peyer, il luogo prominente in cui i linfociti B vengono trasformati in plasmacellule secernenti IgA, è la fonte primaria di IgA. Inoltre, la minore espressione della 1β-1,3-galattosiltransferasi (C1GalT1) e del suo chaperone molecolare, C1GalT1-specific molecular chaperone (Cosmc), è correlata a un'anomala glicosilazione delle IgA1 nei pazienti con IgAN. La nostra esperienza clinica dimostra che la fitoterapia di Dioscoreae Nipponicae Rhizoma's (DNR) può alleviare la proteinuria e l'ematuria e migliorare la funzione renale nei pazienti con IgAN. La dioscina (DIO) è uno dei principali principi attivi della DNR, che ha diverse attività farmacologiche. Questo studio esplora il possibile meccanismo di DIO nel trattamento di IgAN.Il topo modello di IgAN è stato stabilito mediante induzione immunitaria della mucosa. I topi sono stati divisi nei gruppi di controllo, modello e sonda DIO. La deposizione glomerulare di IgA nei topi, le alterazioni patologiche renali e l'espressione dei marcatori delle cellule B CD20 e CXCR5 nel cerotto di Peyer sono stati rilevati mediante immunofluorescenza e immunoistochimica. Dopo la stimolazione con lipopolisaccaridi (LPS), gli effetti di DIO sulla proliferazione delle cellule DAKIKI, sulla secrezione di IgA e Gd-IgA1, sull'espressione di C1GalT1 e Cosmc sono stati studiati mediante il test del kit di conteggio delle cellule-8 (CCK-8), il test ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), la reazione a catena quantitativa della polimerasi in tempo reale (QRT-PCR) e il western blotting (WB). Negli studi in vivo , la deposizione di IgA accompagnata da iperplasia mesangiale glomerulare e aumento dell'espressione di CD20 e CXCR5 nel cerotto di Peyer nel topo modello di IgAN è stata alleviata da DIO. Studi in vitro hanno dimostrato che da 0,25 μg/mL a 1,0 μg/mL DIO ha inibito la proliferazione delle cellule DAKIKI indotta da LPS, la secrezione di IgA e Gd-IgA1 e ha sovraregolato l'espressione dell'mRNA e della proteina C1GalT1 e Cosmc. Questo studio dimostra che la DIO può ridurre la produzione di Gd-IgA1 inibendo l'eccessiva attivazione delle cellule secernenti IgA e aumentando l'espressione di C1GALT1/Cosmc.

Introduzione

La nefropatia da IgA (IgAN) è il tipo più comune di glomerulonefrite primaria, per la quale non esiste un trattamento specifico, e rimane una causa significativa di malattia renale allo stadio terminale1. Sebbene la patogenesi delle IgAN non sia ancora completamente compresa, l'"ipotesi multi-hit" è generalmente accettata e supportata da un ampio corpus di prove di ricerca cliniche e sperimentali2. La patogenesi delle IgAN comporta l'attivazione delle cellule B e la produzione di IgA1 carenti di galattosio (Gd-IgA1)3. L'aumento delle Gd-IgA1 circolanti dovuto all'eccessiva proliferazione e attivazione delle cellule secernenti IgA durante la risposta immunitaria della mucosa è un anello critico nella patogenesi delle IgAN 4,5,6. Come luogo centrale per la proliferazione e l'attivazione della conversione del fenotipo dei linfociti B in cellule secernenti IgA, il cerotto di Peyer è la fonte primaria di secrezione di IgA, strettamente correlata alla comparsa e allo sviluppo di IgAN 7,8. Inoltre, la proliferazione delle cellule secernenti IgA1, così come l'espressione della Core 1β-1,3-galattosiltransferasi (C1GalT1) e del chaperone molecolare specifico per C1GalT1 (Cosmc), sono state associate a un'anomala glicosilazione delle IgA1, che causa la produzione di GD-IgA1 nei pazienti con IgAN 6,9.

Negli ultimi anni gli studi clinici sul trattamento delle IgAN con la fitoterapia sono progrediti. La formula Yiqi Qingjie è una formula essenziale per il trattamento delle IgAN del Dipartimento di Nefrologia dell'Ospedale di Guang'anmen. Lo studio precedente del nostro gruppo ha rilevato che la Gd-IgA1 è diminuita nel siero dei pazienti con IgAN dopo il trattamento con Yiqi Qingjie Formula. Essendo una delle erbe più utilizzate nella formula Yiqi Qingjie, Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) è il rizoma essiccato di Dioscorea Nipponica Makino, che ha varie funzioni come regolare l'immunità, sopprimere l'infiammazione, alleviare la tosse e l'asma10,11. Diversi studiosi hanno trattato le IgAN con DNR e hanno ottenuto buoni risultati 12,13,14. Come principale ingrediente attivo di DNR15, la dioscina (DIO) abbassa l'acido urico, inibisce la fibrosi, inibisce la risposta infiammatoria e lo stress antiossidante16,17. Pertanto, la DIO potrebbe avere un nuovo meccanismo d'azione per inibire la secrezione cellulare di un'eccessiva Gd-IgA1 ed esercitare specifici effetti di protezione renale. Tuttavia, non è stato riportato alcuno studio sul meccanismo d'azione di DIO per il trattamento dell'IgAN.

Per esplorare il potenziale meccanismo terapeutico della DIO sulle IgAN e fornire un nuovo metodo per il trattamento delle IgAN, abbiamo condotto esperimenti per gli effetti terapeutici della DIO sulle IgAN in vivo e in vitro.

Protocollo

Il comitato etico dell'ospedale di Guanganmen ha approvato questo esperimento (numero di approvazione etica dell'esperimento animale: IACUC-GAMH-2023-003).

1. Preparazione dei topi per la procedura sperimentale

  1. Allevare 22 topi maschi Balb/c di grado SPF (6-7 settimane di età, peso corporeo 20-25 g) nella struttura per animali dell'ospedale/centro di ricerca. Dividi gli animali in gruppi di controllo (n = 8) e modello (n = 14) utilizzando il metodo della tabella dei numeri casuali.
  2. Dopo 1 settimana di allevamento adattativo nella gabbia di laboratorio, nutrire il gruppo modello (gruppo IgAN) con una soluzione di gamma globulina bovina (BGG) allo 0,1% in acqua acidificata contenente 6 mmol/L di HCl per 9 settimane secondo il protocollo di modellazione di Zou et al.18.
  3. Iniettare 0,1 mL di soluzione di BGG allo 0,1% in soluzione salina nella vena caudale per 3 giorni consecutivi continuando a bere la soluzione di BGG per preparare un modello murino sperimentale di IgAN18.
  4. Lasciare che il gruppo di controllo beva liberamente 6 mmol/L di acqua acidificata HCl senza BGG per 9 settimane. Iniettare il volume corrispondente di soluzione fisiologica nella vena caudale per 3 giorni consecutivi.
    NOTA: I gruppi di controllo e di modello sono stati alimentati con la stessa qualità del mangime normale.
  5. Dopo l'iniezione della vena caudale, selezionare 2 topi nel gruppo di controllo e 2 topi nel gruppo modello in modo casuale ed esaminarli mediante proteinuria, microscopia ottica e immunofluorescenza per determinare se la modellazione ha avuto successo.
    NOTA: Non viene fornito cibo agli animali, ma non è vietato loro dall'acqua; registrare la produzione di urina.
  6. Raccogliere l'urina per 24 ore tramite gabbie metaboliche e centrifugarla a 400 x g per 5 min; Scartare il sedimento urinario. Dopo una diluizione di 10 volte del surnatante, misurare la concentrazione di proteinuria utilizzando un kit per il dosaggio delle proteine urinarie e quindi moltiplicare per il fattore di diluizione e il volume delle urine per ottenere 24 ore di proteine urinarie totali.
    NOTA: I metodi di microscopia e immunofluorescenza sono mostrati rispettivamente nelle sezioni 3 e 4.
  7. Dopo aver preparato con successo il modello, dividere 12 topi del gruppo modello in 6 topi, ciascuno nel gruppo modello (gruppo IgAN) e nel gruppo DIO gavage (gruppo DIO), secondo il metodo della tabella dei numeri casuali.
  8. Lasciare che il gruppo di controllo continui a bere 6 mmol/L di HCl di acqua acidificata senza BGG e che il gruppo modello prosegua con una soluzione di BGG allo 0,1% composta da acqua acidificata contenente 6 mmol/L di HCl. Calcolare la dose di somministrazione di sonda gastrica del gruppo DIO secondo la formula di conversione della dose della metodologia sperimentale farmacologica (convertita in base alla massa corporea umana di 70 kg)19. Gavage DIO compresse 0,06 g/kg una volta al giorno per 8 settimane.
  9. Dopo 8 settimane di gavagage, anestetizzare i topi per via intraperitoneale con pentobarbital sodico allo 0,4% (60 mg/kg) e, dopo aver confermato la corretta anestesia con il pizzicamento delle dita, isolare i reni e il cerotto di Peyer per le successive analisi di microscopia ottica e immunoistochimica.
    NOTA: Lo schema per il modello in vivo è riportato nella Figura 1 supplementare.

2. Analisi istologica

  1. Sezioni di paraffina per i reni e cerotto di Peyer
    1. Fissare tessuti renali spessi 3 mm o 1 cerotto di Peyer con paraformaldeide al 4% per 24 ore, disidratare con etanolo a gradiente e xilene. Immergere nella cera per 2 ore, sigillare e congelare.
    2. Tagliare sezioni di rene spesse 2 μm e sezioni di cerotto di Peyer spesse 4 μm e stenderle in acqua tiepida. Raccogliere le fette aperte con un vetrino pulito e cuocerle in forno a temperatura costante a 40 °C per 1 ora. Iniziare la colorazione dopo la pre-elaborazione del campione.
      NOTA: Prendere la superficie coronale della parte ilare del rene, con uno spessore di 3 mm di blocco di tessuto.
  2. Decerare e colorare le sezioni di paraffina a temperatura ambiente (RT) per 10 minuti con soluzione acida periodica, evitando la luce. Risciacquare con acqua distillata e asciugare le macchie con la soluzione colorante di Schiff per 20-30 minuti, evitando la luce. Sciacquare con acqua distillata fino a quando le sezioni non sono diventate rosse al microscopio.
  3. Mettere le sezioni nella soluzione colorante di ematossilina, colorare i nuclei per 3 minuti (i nuclei colorati troppo profondamente possono essere divisi da etanolo cloridrato) e risciacquare con acqua corrente fino a quando i vetrini non sono incolori.
  4. Eseguire la disidratazione di routine con concentrazioni in gradiente di etanolo e xilene, sigillare le sezioni con gomma neutra e osservare al microscopio. PAS-positivo è rosso e il nucleo è blu.

3. Analisi immunoistochimica della macchia di Peyer

  1. Preparare le sezioni di paraffina del cerotto di Peyer come descritto al punto 2.1.
    NOTA: Lo spessore delle sezioni per l'immunoistochimica e la successiva immunofluorescenza è di 4 μm.
  2. Decerare le sezioni di paraffina:
    1. Mettere le sezioni nello xilene I per 5 minuti, nello xilene II per 5 minuti e nello xilene III per 5 minuti.
    2. Inoltre, sciacquare i vetrini con etanolo anidro I per 5 minuti, etanolo anidro II per 5 minuti, alcol all'85% per 5 minuti, alcol al 75% per 5 minuti. Quindi sciacquare i vetrini in acqua distillata.
  3. Recupero dell'antigene
    1. Preparare 50 volte la soluzione madre di citrato di sodio e diluirla con acqua distillata fino a 1 volta per l'uso. Scaldarlo in autoclave per 2 minuti, quindi mettere le fette in autoclave, assicurandosi che il livello del liquido superi il livello delle fette.
    2. Scaldare ad alta temperatura per 5 minuti, quindi lasciare raffreddare naturalmente i vetrini. Lavare le fette tre volte con la soluzione PBS per 5 minuti ciascuna.
  4. Blocco della perossidasi endogena: segnare i bordi del tessuto in un cerchio con una penna immunoistochimica. Incubare le sezioni in una soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 15 minuti a RT, al riparo dalla luce, e lavare le sezioni tre volte con una soluzione di PBS per 5 minuti ogni volta.
  5. Blocco del siero: bloccare le sezioni facendo cadere il 10% di siero di capra sulle sezioni di tessuto contrassegnate per 30 minuti a RT. Assicurarsi che le sezioni siano uniformemente coperte dalla macchia.
  6. Incubazione degli anticorpi primari: Scuotere delicatamente la soluzione bloccante e aggiungere una parte dell'anticorpo primario preparato (CD20 [1:800]; CXCR5 [1:800]) alla sezione. Posizionare la sezione piatta in una scatola bagnata e incubare per una notte a 4 °C.
    NOTA: Aggiungere una piccola quantità di acqua alla scatola bagnata per evitare l'evaporazione dell'anticorpo.
  7. Incubazione secondaria degli anticorpi: lavare le sezioni tre volte con la soluzione di PBS per 5 minuti ogni volta. Rimuovere la PBS agitando le sezioni per asciugarle, coprire il tessuto con una goccia di anticorpo secondario (HRP-label) delle specie correlate dell'anticorpo primario e incubare a RT per 50 minuti.
  8. Omogeneizzazione con 3,3'-diaminobenzidina (DAB): lavare le sezioni con soluzione di PBS tre volte per 5 minuti ciascuna. Dopo aver agitato le sezioni per asciugarle, far cadere la soluzione cromogenica DAB appena preparata sulle sezioni. Osservare il tempo di sviluppo del colore al microscopio; Il positivo è giallo-brunastro. Risciacquare con acqua di rubinetto per terminare lo sviluppo del colore.
  9. Colorare nuovamente con ematossilina per circa 1 minuto, lavare con acqua di rubinetto e poi risciacquare per 10 minuti con acqua di rubinetto per tornare al blu.
  10. Disidratazione e sigillatura:
    1. Mettere le sezioni in alcol al 75% per 5 minuti e all'85% per 5 minuti. Mettere le sezioni nell'etanolo anidro I per 5 minuti, nell'etanolo anidro II per 5 minuti e nell'etanolo anidro III per 5 minuti.
    2. Lavare le sezioni in xilene I per 5 minuti, estrarle ad asciugare leggermente e sigillare le sezioni con gomma neutra.
  11. Acquisizione delle immagini: Raccogli le immagini mediante esame microscopico e analizzale con il software halo per l'analisi delle immagini panoramiche del tessuto.
    NOTA: I nuclei colorati con ematossilina sono blu e l'espressione positiva di DAB è osservata come giallo-brunastra.

4. Immunofluorescenza renale delle IgA

  1. Preparare sezioni di paraffina per i reni come descritto al punto 2.1.
  2. Decerare le sezioni di paraffina:
    1. Mettere le sezioni nello xilene I per 5 minuti, nello xilene II per 5 minuti e nello xilene III per 5 minuti. Trattare le sezioni in etanolo anidro I, etanolo anidro II, etanolo al 95%, etanolo al 90%, etanolo all'80%, etanolo al 70% ed etanolo al 50%, ciascuna per 5 minuti, e lavare con acqua distillata.
  3. Recupero della proteinasi K: Agitare le sezioni per asciugarle e disegnare un cerchio attorno alla sezione di tessuto con una penna istochimica. Aggiungere la soluzione di lavoro della proteinasi K (rapporto 1:9 tra soluzione madre e PBS) goccia a goccia per coprire il tessuto e incubare a 37 °C per 30 minuti. Lavare le sezioni tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna.
  4. Penetrazione della membrana cellulare: Agitare leggermente le sezioni per asciugarle e poi coprirle con Tritone allo 0,1%. Incubare per 20 minuti a RT e lavare le sezioni tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna.
  5. Bloccante: Aggiungere il 10% di siero di capra goccia a goccia per coprire uniformemente il tessuto per il blocco a RT per 30 minuti.
  6. Incubazione primaria degli anticorpi: aggiungere una quantità appropriata di anticorpo IgA coniugato AF488 di capra (1:500) goccia per goccia per coprire il tessuto in modo uniforme e incubare per una notte a 4 °C.
  7. Colorazione dei nuclei: Lavare le fette tre volte con PBS per 5 minuti ciascuna. Dopo aver rimosso il PBS, aggiungere la colorazione goccia a goccia del 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) sulle sezioni e incubare per 15 minuti a RT, al riparo dalla luce.
  8. Lavare e sigillare le sezioni: lavare le sezioni tre volte con PBS per 5 minuti, quindi sigillarle con un mezzo di montaggio antisbiadimento.
  9. Microscopia e fotografia: osservare le sezioni al microscopio a fluorescenza e scattare immagini.
    NOTA: Per DAPI, l'eccitazione ultravioletta è la lunghezza d'onda 330-380 nm e la lunghezza d'onda di emissione è 420 nm, luce blu. La lunghezza d'onda di eccitazione dell'isotiocianato di fluoresceina (FITC) è 465-495 nm e la lunghezza d'onda di emissione è 515-555 nm, luce verde.

5. Coltura cellulare

  1. Ottieni la linea di linfociti B umani DAKIKI da ATCC, USA. Coltura di cellule DAKIKI in terreno RPMI-1640 integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina-streptomicina.
  2. Coltivare le cellule in un incubatore a 37 °C, 5% di CO2 e sub-coltivarle ogni 2-3 giorni. Utilizzare le cellule nella fase di crescita logaritmica per tutti gli esperimenti.
  3. Alla confluenza del 70%-80%, raccogliere le cellule con una pipetta sterile e centrifugare le cellule a 140 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante, risospendere con il terreno privo di siero e, dopo 24 ore, lasciare tutte le cellule in un periodo di quiescenza per il trattamento successivo.

6. Saggi di citotossicità LDH per lo screening di concentrazioni sicure di DIO su cellule DAKIKI normali

  1. Seminare le cellule DAKIKI in piastre a 96 pozzetti a una densità di 4x105 cellule/pozzetto e impostare un gruppo di controllo basso, un gruppo di controllo alto e diverse concentrazioni di DIO (0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 μg/mL). Incubare in incubatore al 5% di CO2, 37 °C per 24 ore dopo il trattamento corrispondente secondo il metodo di raggruppamento.
  2. Secondo le istruzioni del kit di rilevamento della citotossicità, aggiungere 5 μl di lisato per pozzetto nel gruppo di controllo alto, quindi posizionare la piastra in un incubatore al 5% di CO2, 37 °C per 15 minuti.
  3. Estrarre la piastra, aggiungere 100 μl della miscela di reazione a ciascun pozzetto, incubare al buio per 10 minuti a RT, quindi aggiungere 50 μl della soluzione di stop della reazione. Misurare il valore OD a 490 nm sul lettore di micropiastre il prima possibile.
  4. Calcolare il tasso di rilascio di LDH di diverse concentrazioni di DIO e ≤10% come dose massima somministrata secondo la formula: tasso di rilascio di LDH = (LDH sperimentale - LDH di controllo basso) / (LDH di controllo alto - LDH di controllo basso) x 100%.

7. Saggio CCK-8 per rilevare l'effetto di DIO sulla proliferazione delle cellule DAKIKI

  1. Sulla base dei risultati dei nostri precedenti esperimenti20, stabilire un modello di IgAN utilizzando LPS 40 μg/mL per indurre le cellule DAKIKI.
  2. Quindi, seminare 4x105 cellule/pozzetto in piastre da 96 pozzetti e dividerlo nei gruppi di controllo, modello e DIO a bassa, media e alta concentrazione (0,25 μg/mL, 0,5 μg/mL e 1,0 μg/mL). Incubare le piastre in un'incubatrice al 5% di CO2, 37 °C per 24 ore.
  3. Quindi, aggiungere 20 μl di reagente CCK-8 a ciascun pozzetto e riposizionare le piastre nell'incubatore (5% CO2, 37 °C) per 2 ore. Dopo l'incubazione, rilevare il diametro esterno a una lunghezza d'onda di 450 nm sul lettore di micropiastre il prima possibile.

8. ELISA per rilevare l'effetto di DIO sulla secrezione di IgA e Gd-IgA1 da parte delle cellule DAKIKI

  1. Seminare le cellule DAKIKI in piastre a 6 pozzetti a una densità di 6x106 cellule/pozzetto, e raggruppare e trattare le cellule secondo il passaggio 7.2. Coltivare le cellule per 24 ore, quindi centrifugare a 850 x g per 10 minuti a 4 °C per ottenere il surnatante.
  2. Rilevare le concentrazioni di IgA e Gd-IgA1 secondo le istruzioni del kit.

9.qRT-PCR per rilevare l'effetto di DIO sui livelli di mRNA di C1GALT1 e Cosmc nelle cellule DAKIKI

  1. Seminare le cellule DAKIKI a una densità di 6x106 cellule/pozzetto in una piastra a 6 pozzetti, raggruppare e trattare le cellule come CCK8 menzionato nel passaggio 7.2 e incubare per 24 ore. Estrarre l'RNA totale dalle cellule DAKIKI secondo le istruzioni del kit di estrazione dell'RNA totale.
  2. Dopo aver prelevato 1 μL di RNA estratto da ciascun gruppo di campioni e averne misurato la concentrazione, trascrivere inversamente 1 μg di RNA totale da ciascun campione in cDNA secondo le istruzioni del kit.
  3. Quindi, eseguire l'amplificazione RT-PCR per rilevare l'espressione di ciascun gene (95 °C per 15 minuti, 95 °C per 10 secondi e 60 °C per 30 secondi). Calcola il livello di espressione di ciascun gene utilizzando il metodo 2-ΔΔCT con β-actina come riferimento interno.
    NOTA: Le sequenze di primer erano le seguenti:
    C1GALT1: 5'-AAGGTTGACACCCAGCCTAA-3', 5'-CTTTGACGTGTTTGGCCTTT-3';
    Cosmc: 5'-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3', 5'-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3';
    β-actina: 5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3', 5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'.

10. Western blotting per l'esame dell'effetto di DIO sull'espressione delle proteine C1GALT1 e Cosmc nelle cellule DAKIKI

  1. Seminare le cellule DAKIKI a una densità di 6x106 cellule/pozzetto in una piastra a 6 pozzetti. Raggrupparli e trattarli come indicato nel passaggio 7.2. Dopo 24 ore di incubazione, raccogliere ogni gruppo di cellule.
  2. Aggiungere una quantità adeguata di soluzione di lisi cellulare (PMSF: inibitore della fosfatasi: soluzione di lisi RIPA = 1:1:100) e incubare su ghiaccio per 30 minuti. Quindi centrifugare a 13.500 x g per 10 minuti a 4 °C e raccogliere il surnatante.
  3. Determinare la concentrazione proteica utilizzando il kit per il dosaggio della concentrazione proteica BCA.
  4. Mescolare i campioni di proteine con 5 tamponi di caricamento SDS-PAGE a 4:1 mediante vortex e riscaldare i campioni misti a 100 °C per 5 minuti per denaturare la proteina.
  5. Per rilevare proteine con pesi molecolari diversi, aggiungere il marcatore proteico (5 μL/pozzetto) e i campioni (20 μg/pozzetto) in diverse corsie di un gel SDS-PAGE al 12%, eseguire l'elettroforesi SDS-PAGE e trasferire il gel sulle membrane PVDF.
  6. Bloccare le membrane con latte scremato al 5% per 2 ore a RT e incubare con gli anticorpi primari corrispondenti (C1GALT1 [1:1000], Cosmc [1:2000]) per 24 ore. Utilizzare l'anticorpo β-actina (1:100000) come controllo interno.
  7. Lavare la membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) con 1x soluzione salina tamponata Tris, detergente Tween 20 allo 0,1% (TBST) tre volte (10 min/tempo), quindi incubare con il corrispondente anticorpo IgG secondario di capra anti-coniglio (1: 10000) a RT per 2 ore.
  8. Lavare nuovamente la membrana con TBST (tre volte per 10 minuti ciascuna) e trattarla con una quantità appropriata di soluzione di lavoro a chemiluminescenza potenziata (ECL) (secondo le istruzioni del produttore) per il rilevamento delle bande proteiche.
  9. Acquisisci le immagini utilizzando il sistema di imaging a chemiluminescenza ed esegui un'analisi semiquantitativa dei valori di grigio delle proteine utilizzando il sistema di analisi delle immagini Image J.

11. Analisi statistica

  1. Utilizzare un'applicazione software appropriata per l'analisi dei dati. Esprimi tutti i dati come mezzi ± SD (deviazione standard) e valuta più campioni mediante un test ANOVA unidirezionale per il confronto tra i gruppi.
    NOTA: Il software statistico SPSS 26.0 è stato utilizzato per l'analisi statistica. Il metodo LSD è stato utilizzato per confronti a due vie tra gruppi quando le varianze erano uguali, e il metodo Dunnett T3 è stato utilizzato per confronti a due vie tra gruppi quando le varianze non erano uguali. Si ritiene che P<0,05 indichi una differenza statisticamente significativa.

Risultati

Effetto della DIO sul tessuto renale in un modello di topi IgAN

Rispetto al gruppo di controllo, il modello di topi IgAN immuno-indotti della mucosa (gruppo modello) ha avuto un aumento significativo della proteinuria (Figura 2 supplementare), la deposizione di IgA era visibile nella regione mesangiale, la fluorescenza era distribuita uniformemente in cluster in tutta la regione mesangiale (Figura 1A), la colorazione PAS del tessuto renale ha mostrato proliferazione delle cellule mesangiali e iperplasia stromale (Figura 1B), che è stato ridotto nel gruppo DIO gavage (gruppo DIO).

Effetto di DIO sui linfociti B nel cerotto di Peyer

Il cerotto di Peyer è il sito principale della conversione dei linfociti B in cellule secernenti IgA. Abbiamo preso il cerotto di Peyer come oggetto di ricerca per osservare l'effetto della DIO sui linfociti B rilevando l'espressione dei marcatori delle cellule B CD20 e CXCR5. I risultati immunoistochimici hanno mostrato che l'espressione di CD20 e CXCR5 era significativamente più alta nel gruppo modello rispetto al gruppo di controllo. DIO potrebbe inibire l'espressione dei suddetti marcatori molecolari (Figura 2A, B).

L'intervallo di concentrazione sicuro di DIO sulle celle DAKIKI

L'LDH è un marcatore dell'integrità della membrana plasmatica e un indicatore di morte cellulare, con tassi di rilascio di LDH più elevati che indicano un danno cellulare più grave. Il test di rilascio LDH è stato utilizzato per determinare l'intervallo di concentrazione sicuro di DIO. La concentrazione massima sicura di DIO è stata determinata da un tasso di rilascio di LDH inferiore al 10%. I risultati (Figura 3) non hanno mostrato citotossicità significativa indotta da DIO a concentrazioni comprese tra 0,25 e 1,0 μg/mL. Pertanto, lo studio seguente ha utilizzato 0,25, 0,5 e 1,0 μg/mL di DIO come livello di dosaggio.

Effetti della DIO sulla proliferazione delle cellule DAKIKI

I risultati sperimentali (Figura 4) hanno mostrato che, rispetto al gruppo modello (gruppo stimolato da LPS), DIO ha inibito la proliferazione delle cellule DAKIKI indotta da LPS in modo dipendente dalla concentrazione. La DIO a concentrazioni di 0,5 e 1,0 μg/mL ha inibito significativamente la proliferazione delle cellule DAKIKI indotta da LPS (P < 0,01).

Effetti della DIO sulla funzione secretoria delle cellule DAKIKI

I livelli di Gd-IgA1 sono strettamente correlati al processo patologico delle IgAN, e le IgA totali vengono testate insieme come indicatore della funzione secretoria cellulare. Un test ELISA è stato utilizzato per rilevare il contenuto di IgA e Gd-IgA1 nel surnatante della coltura cellulare DAKIKI. I risultati hanno mostrato (Figura 5A, B) che le cellule DAKIKI stimolate da LPS secernono più IgA rispetto al gruppo di controllo (P < 0,01). In confronto, DIO ha inibito significativamente le cellule DAKIKI dal secernere IgA (P < 0,01) in modo dipendente dalla concentrazione. Rispetto al gruppo di controllo, le cellule DAKIKI stimolate da LPS hanno secreto più Gd-IgA1 con una tendenza statistica (P < 0,10), e DIO ha inibito la secrezione di Gd-IgA1 dalle cellule DAKIKI stimolate da LPS in modo concentrazione-dipendente (P < 0,05 e P < 0,01), tra cui DIO a 1,0 μg/mL ha inibito significativamente la secrezione di Gd-IgA1 con un tasso di inibizione del 25%.

Il meccanismo di DIO inibisce la secrezione di Gd-IgA1 da parte delle cellule DAKIKI

Per indagare ulteriormente il possibile meccanismo di inibizione dell'eccessiva secrezione di Gd-IgA1 da parte delle cellule DAKIKI, i livelli di transferasi glicosilata C1GALT1 e proteina chaperone Cosmc mRNA nelle cellule DAKIKI sono stati rilevati mediante qRT-PCR e i risultati hanno mostrato (Figura 6A, B) che l'espressione relativa dell'mRNA di C1GALT1 e Cosmc era sottoregolata nelle cellule DAKIKI nel gruppo modello rispetto al gruppo di controllo (P < 0,01). DIO ha sovraregolato l'espressione relativa dell'mRNA di C1GALT1 e Cosmc in misura diversa rispetto al gruppo modello, con DIO 1,0 μg/mL che ha aumentato significativamente l'espressione relativa dell'mRNA di C1GALT1 e Cosmc (P < 0,05).

Allo stesso tempo, il metodo WB è stato utilizzato per rilevare l'effetto di DIO sull'espressione proteica di C1GALT1 e Cosmc nelle cellule DAKIKI. Rispetto al gruppo di controllo, l'espressione proteica di C1GALT1 e Cosmc nelle cellule DAKIKI nel gruppo modello è diminuita ovviamente (P < 0,05). Rispetto al gruppo modello, l'espressione proteica di C1GALT1 e Cosmc dopo l'intervento di DIO è risultata sovraregolata. L'espressione proteica di C1GALT1 e Cosmc è stata significativamente sovraregolata da DIO a una concentrazione di 1,0 μg/mL (P < 0,05) (Figura 7A-C).

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Figura 1: Istopatologia dei reni. (A) Microscopio a immunofluorescenza. Le sezioni renali dei topi di ciascun gruppo sono state colorate con anti-IgA (verde) e DAPI (blu). La barra della scala dell'immagine sopra = 200 μm. La barra della scala dell'immagine sottostante = 50 μm. n = 6 per gruppo. (B) Immagini rappresentative della colorazione PAS del tessuto renale di topi nei gruppi Controllo, Modello e DIO. Barra di scala = 30 μm. La freccia verso il basso mostra le cellule mesangiali e la freccia verso l'alto mostra lo stroma. Barra di scala = 30 μm. n = 6 per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Effetto di DIO sui marcatori dei linfociti B. (A) L'espressione di CD20 nel cerotto di Peyer. Barra della scala = 200 μm. n = 6 per gruppo. (B) L'espressione di CXCR5 nel cerotto di Peyer. Le barre della scala si trovano nell'angolo in basso a destra dell'immagine. Barra della scala = 200 μm. n = 6 per gruppo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3. Screening della concentrazione sicura di DIO su cellule DAKIKI. I valori statistici sono espressi come media ± SD da tre esperimenti indipendenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4. Diverse concentrazioni di DIO influenzano la proliferazione delle cellule DAKIKI. I dati sono stati espressi come media ±SD. Rispetto al gruppo di controllo, **P < 0,01; rispetto al gruppo di modelli, #P < 0,05' ##P < 0,01; I risultati di tutti gli esperimenti sono stati ripetuti tre volte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5. DIO inibisce la secrezione di IgA e Gd-IgA1 da parte delle cellule DAKIKI. (A) Il metodo ELISA ha rilevato l'espressione di IgA in ciascun gruppo. (B) Il metodo ELISA ha rilevato l'espressione di Gd-IgA1 in ciascun gruppo. I dati sono stati espressi come media ± DS. Rispetto al gruppo di controllo, **P < 0,01; rispetto al gruppo di modelli, #P < 0,05, ##P < 0,01; Tutti i risultati sperimentali sono stati ripetuti tre volte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6. Il meccanismo della DIO inibisce l'eccessiva secrezione di Gd-IgA1 da parte delle cellule DAKIKI. (A) La QRT-PCR ha rilevato l'espressione dell'mRNA di C1GALT1. (B) La QRT-PCR ha rilevato l'espressione dell'mRNA di Cosmc. I dati sono stati espressi come media ± DS. Rispetto al gruppo di controllo, **P<0,01; rispetto al gruppo di modelli, #P < 0,05, ##P < 0,01; Tutti i risultati sperimentali sono stati ripetuti tre volte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7. DIO influenza l'espressione proteica di C1GALT1 e Cosmc nelle cellule DAKIKI. (A) WB ha verificato l'up-regolazione dell'espressione proteica di C1GALT1 e Cosmc da parte di DIO. (B) L'analisi semiquantitativa dell'espressione C1GALT1 è stata eseguita utilizzando l'immagine J. (C) Analisi semiquantitativa dell'espressione di Cosmc utilizzando l'immagine J. I dati sono stati espressi come media ±DS. Rispetto al gruppo di controllo,*P < 0,05; rispetto al gruppo di modelli, #P < 0,05, ##P < 0,01, tutti i risultati sperimentali sono stati ripetuti tre volte. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare 1. Lo schema per il modello in vivo. Clicca qui per scaricare questa figura.

Figura supplementare 2. Cambiamenti nella proteinuria. I dati sono stati espressi come media ± SD; n = 6 per gruppo. Clicca qui per scaricare questa figura.

Discussione

La caratteristica caratteristica patologica delle IgAN è la deposizione di immunocomplessi contenenti IgA1 e GD-IgA1 nella regione mesangiale del glomerulo21,22. Ridurre la formazione di immunocomplessi può ridurre il danno renale e alleviare i sintomi clinici di IgAN. In un esperimento in vivo, abbiamo studiato gli effetti terapeutici della DIO sulle IgAN e abbiamo scoperto che la DIO può ridurre la deposizione di IgA nel rene dei topi modello di IgAN. È dimostrato che l'accumulo di cellule secernenti IgA nel rene è correlato alla patogenesi delle IgAN23. Essendo un importante sito di proliferazione e attivazione dei linfociti B, il cerotto di Peyer è un'importante fonte di cellule secernenti IgA, quindi abbiamo esaminato l'espressione dei marcatori dei linfociti B (CD20, CXCR5) nel cerotto di Peyer e abbiamo scoperto che DIO potrebbe inibire l'espressione dei linfociti B nel modello di topi IgAN del cerotto di Peyer. Questi risultati sperimentali potrebbero fornire una base per l'applicazione di DIO nel trattamento delle IgAN.

Abbiamo eseguito i seguenti esperimenti in vitro per studiare ulteriormente il meccanismo d'azione di DIO su IgAN. In primo luogo, è stato dimostrato in precedenza che DAKIKI, una linea di cellule B immortalizzate con EBV che secerne IgA1, parte della quale è GD-IgA124, è ideale per la ricerca in vitro sul meccanismo d'azione del farmaco su IgAN. Abbiamo scelto le cellule DAKIKI per studiare il meccanismo molecolare della DIO nel trattamento delle IgAN. Inoltre, la risposta immunitaria infiammatoria della mucosa svolge un ruolo fondamentale nella patogenesi delle IgAN. Come accennato in precedenza, utilizziamo LPS per stimolare le cellule DAKIKI, che possono rilasciare fattori pro-infiammatori e mediare le risposte infiammatorie, che possono imitare meglio il meccanismo delle risposte immunitarie della mucosa in IgAN. Il modello cellulare in vitro può aiutare a studiare la possibilità e il meccanismo di altri farmaci per il trattamento delle IgAN. I risultati hanno mostrato che DIO ha inibito la proliferazione delle cellule DAKIKI stimolate da LPS in modo concentrazione-dipendente. DIO potrebbe inibire la secrezione di IgA e Gd-IgA1 nelle cellule DAKIKI causata dalla stimolazione di LPS e sovraregolare l'espressione dell'mRNA e della proteina di C1GalT1 e del suo chaperone Cosmc nelle cellule DAKIKI, suggerendo che DIO potrebbe ridurre la secrezione di Gd-IgA1 sovraregolando l'espressione di C1GALT1/Cosmc e quindi inibire l'eccessiva attivazione delle cellule DAKIKI.

I passaggi chiave devono essere annotati durante le procedure sperimentali. La concentrazione di Gd-IgA1 nel surnatante cellulare DAKIKI non rientra nell'intervallo di rilevamento del kit ELISA (1,56~100 ng/mL) e il surnatante raccolto deve essere centrifugato da una provetta di ultrafiltrazione per ottenere il concentrato Gd-IgA1. Inoltre, assicurarsi che il volume di surnatante a partire da ciascun gruppo sia lo stesso e che il volume finale di concentrato ottenuto dopo l'ultrafiltrazione sia lo stesso.

In questo studio, abbiamo utilizzato contemporaneamente metodi in vitro e in vivo , che possono sostenersi a vicenda negli effetti farmacologici e fornire un esempio per studiare gli effetti e i loro meccanismi della fitoterapia. Alcune cose potrebbero essere migliorate in questo protocollo. In primo luogo, non abbiamo rilevato concentrazioni ematiche nel gruppo DIO gavage dei topi; pertanto, la concentrazione di DIO equivalente alle concentrazioni ematiche non viene utilizzata negli esperimenti in vitro . In secondo luogo, è stato studiato solo il monomero DIO, il componente attivo della DNR; gli effetti di altri componenti del DNR sulle IgAN necessitano ancora di ulteriori studi.

In conclusione, questo studio fornisce una base sperimentale per il trattamento delle IgAN con DIO, il principio attivo della DNR. Questo studio ha stabilito un modello patologico cellulare di IgAN imitando la risposta immunitaria mucosale di IgAN sia in vitro che in vivo. Dà una nuova idea per studiare la medicina tradizionale cinese per prevenire e curare l'IgAN.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81973675).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Anti-CD20 / MS4A1 AnticorpoBoster Biotechnology CompanyA03780-3
Antifade mezzo di montaggioBeyotime, Shanghai, CinaP0128S
Balb / c topiBeijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd.
siero bloccanteSolarbio, Pechino, CinaSL038
Gamma globulina bovinaShangHai YuanYe Biotechnology CompanyS12031
C1GALT1 anticorpo policlonaleProteintech Group, Inc, USA27569-1-AP
Soluzione di recupero dell'antigene citrato (50×)Phygene Biotechnology CompanyPH0422
Anticorpo policlonale COSMCProteintech Group, Inc, USA19254-1-AP
Kit di rilevamento della citotossicitàRoche Company 4744926001
Sistema di rilevamento Dako REAL EnVision, Perossidasi/DAB+DakoK5007
DAPIInvitrogenD1306
DioscinaIstituto nazionale per il controllo degli alimenti e dei farmaci111707-201703
Compresse DIOChengdu No 1 Pharmaceutical Co., Ltd.
soluzione di lavoro ECLMerck Biotechnology, IncWBKLS0100 
Kit di conteggio cellulare migliorato-8Beyotime, Shanghai, CinaC0043
Mascheratura della rimozione in un solo passaggio della premiscela di sintesi del primo filamento di cDNA genicoTIANGEN, Pechino, CinaKR118-02
Kit di colorazione Schiff acido periodico glicogeno (PAS) BaSO Biotechnology CompanyBA4080A
IgA-AF488 IgA-AF488SouthernBiotech1040-30
Anticorpo IgG anti-coniglio di capra (H+L), HRP coniugatoBeiJing Bioss Biotechnology CompanyBS-0295G-HRP
Kit ELISA Gd-IgA1 umanoIBL27600
Kit ELISA IgA umanoMultiSciences (LiankeBio)70-EK174-96
Kit per il dosaggio delle proteine Pierce BCAThermo Scientific23227
Soluzione PMSFBeyotime, Shanghai, CinaST507
Proteinasi K Phygene Biotechnology CompanyPH1521
Anticorpo policlonale anti-CXCR5 di coniglio BeiJing Bioss Biotechnology Companybs-23570R
tampone di lisi RIPABeyotime, Shanghai, CinaP0013B
Kit di estrazione dell'RNA totale RNAsimpleTIANGEN, Pechino, CinaDP419
RPMI Medium 1640Solarbio, Pechino, Cina31800
Super-BradfordCWBIO, Pechino, CinaCW0013
Tritone X-100Beyotime, Shanghai, CinaST795
β-Actina Coniglio mAbclonal, Wuhan, CinaAC026
110322220101424000H51023866 Kit di analisi delle proteine

Riferimenti

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