Articolo metodologico

Microiniezione di retrovirus RCAS(A) ricombinante nel cristallino embrionale di pollo

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DOI:

10.3791/65727

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1 settembre 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Structural Biology, University of Texas Health Science Center, San Antonio

In questo articolo

Sommario

Questo documento di protocollo descrive la metodologia della microiniezione embrionale di lenti di pollo di un retrovirus RCAS(A) come strumento per studiare la funzione in situ e l'espressione delle proteine durante lo sviluppo della lente.

Abstract

Il pollo embrionale (Gallus domesticus) è un modello animale ben consolidato per lo studio dello sviluppo e della fisiologia del cristallino, dato il suo alto grado di somiglianza con il cristallino umano. RCAS(A) è un retrovirus di pollo competente per la replicazione che infetta le cellule in divisione, che funge da potente strumento per studiare l'espressione e la funzione in situ di proteine wild-type e mutanti durante lo sviluppo del cristallino mediante microiniezione nel lume vuoto della vescicola del cristallino nelle prime fasi di sviluppo, limitando la sua azione alle cellule del cristallino proliferanti circostanti. Rispetto ad altri approcci, come i modelli transgenici e le colture ex vivo , l'uso di un retrovirus aviario RCAS(A) competente per la replicazione fornisce un sistema altamente efficace, rapido e personalizzabile per esprimere proteine esogene negli embrioni di pulcino. In particolare, il trasferimento genico mirato può essere confinato alle cellule proliferative della fibra del cristallino senza la necessità di promotori tessuto-specifici. In questo articolo, forniremo una breve panoramica dei passaggi necessari per la preparazione del retrovirus ricombinante RCAS(A), forniremo una panoramica dettagliata e completa della procedura di microiniezione e forniremo i risultati di esempio della tecnica.

Introduzione

L'obiettivo di questo protocollo è quello di descrivere la metodologia di microiniezione embrionale di lenti di pollo di un RCAS(A) (sarcoma/leucosi retrovirale A competente per la replicazione). È stato dimostrato che l'efficace somministrazione retrovirale in una lente embrionale di pollo è uno strumento promettente per lo studio in vivo del meccanismo molecolare e della struttura-funzione delle proteine della lente nella normale fisiologia del cristallino, nelle condizioni patologiche e nello sviluppo. Inoltre, questo modello sperimentale potrebbe essere utilizzato per l'identificazione di bersagli terapeutici e lo screening farmacologico per condizioni come la cataratta congenita umana. Nel complesso, questo protocollo mira a delineare i passi necessari per lo sviluppo di una piattaforma personalizzabile per lo studio delle proteine del cristallino.

I pulcini embrionali (Gallus domesticus), a causa della loro somiglianza nella struttura e nella funzione del cristallino con il cristallino umano, sono un modello animale ben consolidato per lo studio dello sviluppo e della fisiologia del cristallino 1,2,3,4. L'uso di un retrovirus aviario RCAS(A) competente per la replicazione è stato considerato un sistema altamente efficace, rapido e personalizzabile per esprimere proteine esogene negli embrioni di pulcino. In particolare, ha una capacità unica di confinare il trasferimento genico bersaglio alle cellule proliferative della fibra del cristallino senza la necessità di promotori tessuto-specifici, utilizzando l'esclusivo lasso di tempo di sviluppo embrionale in cui la presenza di lume del cristallino vuoto consente la microiniezione in situ di RCAS(A) nel sito ristretto per l'espressione di proteine esogene all'interno delle cellule proliferative della fibra del cristallino5, 6,7,8.

La procedura di microiniezione dell'embrione di pulcino, qui descritta in modo approfondito, si basa originariamente in parte sul lavoro di Fekete et. al.6 e ulteriormente sviluppato da Jiang et. al.8 ed è stato utilizzato come mezzo per introdurre plasmidi virali e non virali nel cristallino dei pulcini embrionali 1,9,10,11,12,13. Nel complesso, il lavoro precedente dimostra il potenziale dell'utilizzo di questa metodologia per studiare lo sviluppo del cristallino, la differenziazione, la comunicazione cellulare e la progressione della malattia, e per la scoperta e il test di bersagli terapeutici per condizioni patologiche del cristallino come la cataratta.

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Protocollo

Questo studio è stato condotto in conformità con la legge sul benessere degli animali e i regolamenti di attuazione sul benessere degli animali in conformità con i principi della Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Università del Texas Health Science Center di San Antonio. Per una panoramica del protocollo, vedere la Figura 1; vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti e gli strumenti utilizzati in questo protocollo.

figure-protocol-1
Figura 1: Schema sperimentale. 1 . La prima fase del protocollo è la determinazione di una specifica proteina bersaglio, l'identificazione delle sequenze geniche associate e la generazione di frammenti di DNA. 2 . Clonazione della sequenza o delle sequenze geniche in un vettore retrovirale mediante clonazione iniziale in un vettore adattatore, 3. seguita da un vettore virale . 4 . Preparazione di particelle virali ad alto titolo utilizzando celle di impacchettamento per la raccolta e la concentrazione. 5 . La fase finale, e l'obiettivo di questo protocollo, è la microiniezione di particelle virali RCAS(A) nel lume della lente. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

1. Preparazione di retrovirus ricombinanti ad alto titolo

  1. Reazione a catena della polimerasi (PCR) per produrre frammenti di DNA proteico bersaglio
    NOTA: Questa sezione ha lo scopo di amplificare la sequenza di DNA corrispondente alla proteina del cristallino bersaglio. Per maggiori dettagli, vedere 7,8.
    1. Progettare primer per PCR, corrispondenti alla proteina di interesse, per realizzare frammenti di DNA con i loro termini carbossilici in-frame con o senza una sequenza di epitopi FLAG (5'-GACTACAAGGACGACGATGACAAG-3'), un codone di stop e un sito enzimatico di restrizione (i.e., EcoRI) presente all'interno della regione polylinker di CLa12NCO)) secondo le specifiche indicate nei protocolli precedentemente pubblicati, con sequenze per enzimi di restrizione adeguati1, 7,8,10,11.
    2. Eseguire la reazione PCR10. Combinare 100 pmol di senso e antisenso dei primer progettati con 0,5 μg di cDNA connexina (come combinazioni Cx50, Cx43 o chimeriche Cx50*43L), al tampone di reazione PCR di scelta. Eseguire 30 cicli ciascuno composto da 94 °C per 1 min, 58 °C per 1 min e 72 °C per 1 min, seguiti da un'estensione finale per 10 min a 72 °C.
    3. Isolare e purificare i prodotti PCR con un kit di purificazione in gel.
    4. Digerire i prodotti PCR purificati utilizzando enzimi di restrizione di scelta secondo le istruzioni del produttore.
  2. Clonazione di inserti di DNA in plasmidi adattatori
    NOTA: L'inserimento di frammenti di DNA in un vettore adattatore elimina la necessità di cellule helper/virus per aumentare la stabilità del vettore RCAS(A)14. Per maggiori dettagli, vedere 7,8.
    1. Subclonare i frammenti di DNA in un plasmide adattatore, Cla12NCO, utilizzando una reazione di legatura adesiva. Miscelare i frammenti di PCR con enzimi di restrizione e Cla12NCO in un rapporto di 2-5:1. Eseguire la legatura e la trasformazione del DNA utilizzando cellule competenti.
    2. Isolare il DNA utilizzando un kit di isolamento del DNA.
    3. Sequenziare il DNA per garantire l'accuratezza.
  3. Clonazione nel vettore virale RCAS(A)
    NOTA: I frammenti di DNA vengono inseriti in un veicolo (retrovirus RCAS(A)) per la trasduzione stabile di un gene nelle cellule dell'embrione di pulcino in via di sviluppo14,15. Per maggiori dettagli, vedere 7,8,15.
    1. Digerire il frammento di DNA Cla12NCO-del vettore contenente interesse con ClaI (1 unità per 1 μg di DNA) e isolare con gel i frammenti.
    2. Subclonare i frammenti di DNA in un plasmide RCAS(A) linearizzato ClaI. Utilizzare l'enzima di restrizione SalI per distinguere il sito ClaI sul plasmide RCAS(A).
    3. Confermare il corretto orientamento dei frammenti inseriti sui costrutti mediante digestione con enzimi di restrizione ClaI e SalI.
    4. Isolare il DNA utilizzando un kit di isolamento del DNA.
    5. Determinare la concentrazione di DNA.
  4. Trasfezione di cellule di fibroblasti embrionali di pulcino (CEF) e raccolta di RCAS(A)
    NOTA: Le cellule di impacchettamento del virus, CEF, vengono utilizzate per ottenere/raccogliere terreni di coltura cellulare contenenti particelle virali15,16. Per maggiori dettagli, vedere 7,8,15.
    1. Trasfettare cellule CEF con costrutti di DNA retrovirale ricombinante utilizzando l'agente di trasfezione secondo le istruzioni del produttore.
    2. Eseguire il western blotting delle cellule trasfettate per esaminare la loro espressione della proteina di interesse.
    3. Quando le cellule trasfettate raggiungono la confluenza, iniziare a raccogliere il mezzo surnatante, elaborarlo/filtrarlo in modo appropriato (per rimuovere eventuali detriti cellulari utilizzando un filtro da 0,22 μm) e conservare a -80 °C fino al momento della concentrazione.
  5. Concentrazione e titolazione delle scorte virali
    NOTA: Il pellet e i grandi volumi di terreno derivati dalle cellule contenenti le particelle virali devono essere filtrati. Inoltre, è necessario eseguire un test del titolo virale per stabilire la forza del virus contro le cellule ospiti. Per maggiori dettagli, vedere 6,7,8,15.
    1. Scongelare i terreni di coltura contenenti i virioni.
    2. Centrifugare il terreno di coltura a 72.000 × g per 2 ore a 4 °C.
    3. Decantare il surnatante e risospendere il pellet virale con il terreno residuo (~50 μL) e conservare a -80 °C fino all'uso, in ceppi virali da ~10 μL.
    4. Per la titolazione, utilizzando cellule QT-6 o CEF, trasfettare le cellule con una diluizione seriale delle scorte virali.
    5. Dopo la confluenza, fissare le cellule utilizzando il 4% di formaldeide.
    6. Immunocolorazione per proteine gag virali o processo istochimico per fosfatasi alcalina per ottenere il titolo, definito come (unità formanti colonie) CFU per millilitro (CFU/mL).

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Figura 2: Strumenti e configurazione per la microiniezione con lente di pulcino . (A) Estrattore manuale per micropipette a microelettrodo verticale P-30. (1) riquadro che mostra una micropipetta di vetro che viene estratta. (B) (2) Incubatrice per uova. Incubare l'uovo di gallina per ~65-68 ore in un'incubatrice a 37 °C per raggiungere lo stadio 18 (con lume centrale sigillato e vuoto) per l'iniezione del retrovirus. (C) Configurazione della microiniezione. (3) apparecchiature di illuminazione, (4) Pico-Injector, (5) microscopio da dissezione, (6) micromanipolatore Drummond, (7) computer/telecamera per la visualizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Microiniezione di lenti per pulcini

  1. Preparazione delle forniture
    1. Preparazione di micropipette di vetro per microiniezione17
      NOTA: I capillari in vetro vengono utilizzati per realizzare micropipette in vetro con punta e diametro esterno (OD) di ~11 μm per microiniezione. La configurazione è illustrata nella Figura 2A.
      1. Fissare il capillare in vetro borosilicato alle clip imbottite in gomma nell'estrattore verticale manuale per micropipette.
      2. Impostare la temperatura di calore (HEAT 1) a 950 °C ed eseguire il prepull per ottenere un capillare di vetro più sottile e morbido.
      3. Impostare la temperatura di calore (HEAT 2) a 790 °C ed eseguire un pull secondario per produrre le micropipette finali.
      4. Con un macinatore per micropipette, affilare l'apertura del puntale fino a un diametro esterno di ~11 μm.
      5. Per esperimenti futuri, conservare le micropipette di vetro in un tampone di serraggio di spugna all'interno di un barattolo di vetro.
    2. Incubazione di uova fecondate fino allo stadio di sviluppo 18
      NOTA: Durante lo sviluppo del cristallino, a ~65-68 h di sviluppo embrionale, il cristallino si separa dall'ectoderma e forma una vescicola sigillata con un lume centrale; L'iniezione in questo lume vuoto della lente innesca per un'espressione limitata alle cellule proliferativedel cristallino 7,8,18.
      1. Incubare uova di gallina fecondate per ~65-68 h in un'incubatrice a basculante umidificata a 37 °C (Figura 2B).
  2. Apertura dell'uovo di gallina
    NOTA: Questa fase descrive l'identificazione e l'esposizione dell'embrione per la microiniezione. Per maggiori dettagli, vedere 7,8.
    1. Pulire accuratamente l'area di lavoro con etanolo al 70%.
    2. Togliete le uova dall'incubatrice, spruzzatele abbondantemente con etanolo al 70% e lasciatele asciugare all'aria.
    3. Metti l'uovo, con l'estremità più grande rivolta verso l'alto, su un portauova.
    4. Usando un paio di pinze a denti affilati, produrre un foro di ~2 cm di diametro sull'estremità più grande dell'uovo picchiettando con cura sul guscio dell'uovo e rimuovendo i frammenti del guscio dell'uovo (Figura 3A).
    5. Usando un microscopio da dissezione, localizza l'embrione.
    6. Una volta individuato l'embrione e la lente del pulcino, utilizzare il microscopio da dissezione e le pinze e le forbici da dissezione fine per tagliare la membrana amnionica che copre immediatamente la parte superiore dell'embrione (Figura 3B).
      NOTA: Non tagliare troppo (solo quanto basta per esporre l'embrione ~0,5 cm x 0,5 cm), altrimenti gli embrioni potrebbero affondare nella massa vitellina; Evitare anche di toccare i vasi sanguigni, se possibile.
    7. Coprire l'apertura dell'uovo con una capsula di Petri da 60 mm in preparazione dei passaggi successivi.
  3. Microiniezione di stock virale concentrato
    NOTA: Le particelle virali contenenti frammenti di DNA proteico bersaglio per la trasduzione vengono inserite nelle cellule all'interno del lume del cristallino. La configurazione è illustrata nella Figura 2C. Per maggiori dettagli, vedere 6,7,8.
    1. Scongelare le scorte virali sul ghiaccio.
    2. Per visualizzare lo stock virale durante l'iniezione, diluire 1 μL di 10x Fast green in un flaconcino di stock virale contenente 10 μL.
    3. Per garantire che non vi siano grossi pezzi di materiale non disciolto che potrebbero ostruire la micropipetta di vetro, centrifugare le soluzioni per 10 s a 10.000 × g a 4 °C per pellettare "pezzi grandi" e trasferire i surnatanti in nuove provette, il tutto mantenendo le soluzioni in ghiaccio.
    4. Su una piastra di coltura di 35 mm x 10 mm, posizionare un parafilm da laboratorio allungato e aggiungere 1 μL di soluzione fisiologica sterile (PBS) sopra la pellicola (non sterilizzata, con il lato coperto considerato "pulito").
    5. Collegare una micropipetta di vetro preparata a un pico-iniettore automatico.
    6. Premere la modalità di riempimento per riempire la soluzione fisiologica sterile (PBS) in una micropipetta di vetro, quindi utilizzare la modalità di iniezione per testare il liquido da 1 μL assegnato.
    7. Posizionare un secondo parafilm da laboratorio allungato sulla superficie di una nuova piastra di coltura cellulare da 35 mm x 10 mm e aggiungere 1 μL di stock virali colorati in verde Fast sopra la pellicola.
    8. Abbassare la punta della micropipetta nello stock virale e premere il modello di riempimento per riempire la micropipetta di vetro con ~1 μL di stock virale.
      NOTA: Per evitare che si secchi, mettere la punta della micropipetta riempita in soluzione fisiologica sterile (PBS) ogni volta che c'è una pausa nella procedura.
    9. Abbassare la micropipetta di vetro riempita, collegata a un iniettore automatico, nella regione target del lume del cristallino dell'embrione con l'aiuto di un microscopio da dissezione.
    10. Regolare la sorgente luminosa per garantire una chiara visualizzazione del contorno della vescicola dell'obiettivo.
      NOTA: Il lume del cristallino destro (rivolto verso l'alto) viene in genere utilizzato per l'iniezione e il sinistro (rivolto verso il basso) viene mantenuto intatto come controllo controlaterale.
    11. Una volta accertati che il posizionamento della micropipetta si trovi nella posizione corretta all'interno del lume del cristallino, iniettare 5-40 nL del materiale virale (Figura 3C).
      NOTA: La pratica è molto necessaria per un posizionamento ottimale dell'iniezione.
    12. Attendere ~45 s e poi rimuovere delicatamente la micropipetta di vetro.
    13. Verificare l'esito positivo della microiniezione nel lume della lente utilizzando il microscopio da dissezione esaminando il colorante Fast Green che dovrebbe rimanere nel lume vuoto della lente senza alcuna perdita.
    14. Dopo la procedura di iniezione, sigillare l'apertura del guscio d'uovo con nastro adesivo.
    15. Rimettere l'embrione nell'incubatrice umidificata a 37 °C, senza alcun movimento rotatorio, fino al raggiungimento dell'età embrionale desiderata per la dissezione del cristallino.

figure-protocol-3
Figura 3: Preparazione e schema del pulcino con microiniezione . (A) Apertura di un uovo di gallina. (B) Taglio della membrana amniotica. (C) Schema di microiniezione del lume della lente di pollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

Dopo la determinazione di una specifica proteina bersaglio e l'identificazione della sequenza genica associata, l'approccio sperimentale complessivo prevede il clonaggio della sequenza genica in un vettore retrovirale RCAS(A) mediante il clonaggio iniziale in un vettore adattatore, seguito da un vettore virale. In secondo luogo, le particelle virali ad alto titolo vengono preparate utilizzando cellule di imballaggio per raccogliere e concentrare i virioni. Questi primi due passi principali sono stati ampiamente descritti...

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Discussione

Questo modello sperimentale offre l'opportunità di esprimere la/e proteina/e di interesse nel cristallino intatto, portando allo studio della rilevanza funzionale di queste proteine nella struttura e nella funzione del cristallino. Il modello di microiniezione del pulcino embrionale si basa in parte sul lavoro di Fekete et. al.6 ed è stato ulteriormente sviluppato da Jiang et. al.8 ed è stato utilizzato come mezzo per inserire sia plasmidi virali che agenti come agonisti, p...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni del National Institutes of Health (NIH): RO1 EY012085 (a J.X.J) e F32DK134051 (a FMA) e dalla sovvenzione della Welch Foundation: AQ-1507 (a J.X.J.). Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresenta necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Le figure sono state parzialmente create con Biorender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 µ m FiltroCorning431118Per la rimozione di detriti cellulari dai terreni
35 mm x 10 mm Piatto di colturaFisherScientific50-202-030Per l'uso durante
microiniezione CentrifugaFisherbrand13-100-676Soluzione di filatura
CostruttiGENEWIZ-Perla generazione di costrutti Microscopio
dissezioneAmScopeSM-4TZ-144AVisualizzazione della lente per microiniezione
di primer DNA PCR TecnologieDNA integrate-Generazionedi primer:

Loop intracellulare (IL)-Deleto Cx50 (residui 1– 97 e 149 400) e il vettore Cla12NCO sono stati ottenuti con la seguente coppia di primer: sense, CTCCTGAGAACCTACATCCT; antisenso, CACCGCATGCCCAAAGTACAC

IL di Cx43 (residui 98– 150) e Cx46 (residui 98– 166) erano  ottenuto con le seguenti coppie di primer: sense, TACGTGATGAGGAAAGAAGAG; antisenso, TCCTCCACGCATCTTTACCTTG; senso, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisenso, AGCACCTCCC AT ACGGATTC, rispettivamente

Il modello di costrutto Cla12NCO-Cx43 è stato ottenuto con la seguente coppia di primer: senso, CTGCTTCGTACTTACATC; antisenso, GAACAC GTGCGCCAGGTAC

IL di Cx50 (residui 98– 148) o Cx46 (residui 98– 166) sono stati clonati utilizzando i costrutti Cla12NCO-Cx50 e Cla12NCO-Cx46 come modelli con la seguente coppia di primer: sense, CACCATGTCCGCATGGAGGAGA; antisenso, GGTCCCC TC CAGGCGAAAC; senso, CACATTGTACGCATGGAAGAG; antisense, AGCACCTCCCATACGGATTC, rispettivamente
Drummond Nanoject II Iniettore automatico di nanolitriDrummond Scientific3-000-204Pipetta per microiniezione
Luci a collo d'oca Illuminatore per microscopio AmScopeLED-50WYIlluminazione per la visualizzazione
Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)Invitrogenper colture cellulari
Portauova-Anelli di polistirolo fatti in casa con diametro di 2 pollici e altezza di mezzo pollice
Incubatrice per uovaGQF Manufacturing Company Inc.1502Per l'incubazione di uova fecondate
Fast GreenFisher scientificF99-10Per la visualizzazione dell'iniezione virale
Uova di gallina livornese bianca fecondateTexas A& M UniversityN/AModello animale di scelta per microiniezione (https://posc.tamu.edu/fertile-egg-orders/)
Siero fetale bovino (FBS)Hyclone LaboratoriesPer colture cellulari
IgG di topo coniugato con fluoresceinaIgG Jackson ImmunoResearch115-095-003Per pinze anti-FLAG  1:500
FisherScientific22-327379Per spostare oggetti e
Capillari in vetroSutter InstrumentsB100-75-10Micropipetta in vetro per microiniezione (D.E. 1,0 mm, D.I. 0,75 mm, lunghezza 10 cm)
LipofectamineInvitrogenL3000001Per la trasfezione
Estrattore manuale verticale per micropipetteSutter InstrumentsP-30Per ottenere micropipette in vetro della dimensione corretta
Provetteper microcentrifugaFisherScientific02-682-004Soluzione di dissoluzione
MicroscopioKeyenceBZ-X710Per la colorazione dell'imaging
ParafilmFisherScientific03-448-254Soluzione di posizionamento
Penicillina/StreptomicinaInvitrogenPer colture cellulari
Pico-InjectorHarvard ApparatusPLI-100Per erogare piccoli volumi di liquido con precisione attraverso micropipette, applicando una pressione regolata per un periodo di tempo impostato digitalmente
anti-pulcino AQP0Self generated-JiangJX, White TW, Goodenough DA, Paul DL. Clonaggio molecolare e caratterizzazione funzionale della connessina in fibra di lentino di pollo 45.6. Mol Biol Cell. marzo 1994; 5(3):363-73. DOI: 10.1091/mbc.5.3.363.
coniglio anticorpo anti-FLAGRockland Immunichemicals600-401-383Per la colorazione FLAG
IgG anti-coniglio coniugato con rodaminaJackson ImmunoResearch111-295-003Per anti-AQP0  1:500
Tampone di serraggio in spugnaSutter InstrumentsBX10Per la conservazione di micropipette in vetro
la da coniglio

Riferimenti

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