Questo protocollo descrive e confronta due metodi rappresentativi per differenziare le hiPSC in cellule stromali mesenchimali (MSC). Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica. Il metodo dei corpi embrioidi (EBs) è caratterizzato da un minor consumo di tempo.
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Articolo metodologico
Confronto di due metodi rappresentativi per la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule stromali mesenchimali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule staminali pluripotenti adulte che sono state ampiamente utilizzate nella medicina rigenerativa. Poiché le MSC derivate da tessuti somatici sono limitate da donazioni limitate, variazioni di qualità e biosicurezza, negli ultimi 10 anni si è assistito a un grande aumento degli sforzi per generare MSC da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Gli sforzi passati e recenti nella differenziazione delle hiPSC in MSC sono stati incentrati su due metodologie di coltura: (1) la formazione di corpi embrioidi (EB) e (2) l'uso di colture monostrato. Questo protocollo descrive questi due metodi rappresentativi per derivare le MSC dalle hiPSC. Ogni metodo presenta i suoi vantaggi e svantaggi, tra cui il tempo, il costo, la capacità di proliferazione cellulare, l'espressione dei marcatori MSC e la loro capacità di differenziazione in vitro. Questo protocollo dimostra che entrambi i metodi possono derivare MSC mature e funzionali dalle hiPSC. Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica, mentre il metodo EB è caratterizzato da un minor consumo di tempo.
Introduzione
Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule staminali pluripotenti adulte derivate dal mesoderma1. Le MSC sono presenti in quasi tutti i tessuti connettivi2. Da quando le MSC sono state scoperte per la prima volta negli anni '70 e isolate con successo dal midollo osseo nel 1987 da Friedenstein et al.3,4,5, una varietà di tessuti somatici umani (inclusi fetali e adulti) sono stati utilizzati per isolare le MSC come ossa, cartilagine, tendini, muscoli, tessuto adiposo e stroma di supporto ematopoietico 1,2,6,7
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Protocollo
1. Mantenimento delle hiPSCs
- Scongelamento di hiPSC
- Estrarre le celle dall'azoto liquido e scongelarle rapidamente a bagnomaria a 37 °C. Trasferire le cellule di scongelamento in una provetta da 15 mL preparata con 3 mL di terreno di mantenimento iPSC (Tabella dei materiali). Mescolare delicatamente il mezzo.
- Centrifugare a 300 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di terreno di mantenimento iPSC con 10 μM Y-27632 (pipettare le cellule su e giù 2-3 volte).
- Trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti....
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Risultati
Seguendo il protocollo (Figura 1A), le hiPSC sono state differenziate in MSC attraverso i metodi di formazione EB e di coltura monostrato. Durante il differenziamento, le cellule hanno mostrato diverse morfologie rappresentative (Figura 1B,C).
Come mostrato nella Figura 1B, le colonie di hiPSCs mostrano una tipica morfologia compatta prima della differenziazione con un bordo chiaro compos.......
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Discussione
In questo protocollo, sono stati esaminati due metodi rappresentativi di differenziazione delle hiPSC in MSC: 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Entrambi i metodi erano in grado di derivare l.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Siamo estremamente grati a tutti i membri del Mao and Hu Lab, passati e presenti, per le interessanti discussioni e i grandi contributi al progetto. Siamo grati al National Clinical Research Center for Child Health per il grande supporto. Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dalla National Natural Science Foundation of China (U20A20351 a Jianhua Mao, 82200784 a Lidan Hu), dalla Natural Science Foundation of Zhejiang Province of China (No. LQ22C070004 a Lidan Hu).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Kit di colorazione rosso alizarina | Beyotime Biotecnologia | C0148S | |
| Anti-umano-CD105 (PE) | Biolegend | 323206 | |
| Anti-umano-CD34 (FITC) | Biolegend | 343503 | |
| Anti-umano-CD45 (APC) | Biolegend | 304011 | |
| Anti-umano-CD73 ( APC) | Biolegend | 344006 | |
| Anti-umano-CD90 (FITC) | Biolegend | 328108 | |
| Acido ascorbico | Solarbio | A8100 | |
| BMP-6 | Novoprotein | C012 | |
| Agitatore di livello di anidride carbonica | Cristallo | CO-06UC6 | |
| Perle di compensazione | BioLegend | 424601 | |
| CryoStor CS10 | Tecnologia STEMCELL | 07959 | |
| Desametasone | Beyotime Biotecnologia | ST1254 | |
| DMEM/F12 medium | Servicebio | G4610 | |
| Siero fetale bovino | HAKATA | HS-FBS-500 | |
| FGF2 | Stemcell | 78003.1 | |
| Gelatina | Sigma-Aldrich | G2500-100G | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | |
| controllo dell'isotipo umano IgG1 APC | BioLegend | 403505 | |
| controllo dell'isotipo IgG1 umano FITC | BioLegend | 403507 | |
| controllo dell'isotipo IgG1 umano PE | BioLegend | 403503 | |
| TGF umano-β 1 | Proteina staminale | 78067 | |
| TruStain umana FcX | BioLegend | 422301 | |
| IBMX | Beyotime Biotecnologia | ST1398 | |
| Indometacina | Solarbio | SI9020 | |
| Insulina | Beyotime Biotecnologia | P3376 | |
| iPSC mezzo di manutenzione | STEMCELL Technology | 85850 | |
| ITS Media Supplement | Beyotime Biotecnologia | C0341-10mL | |
| Matrigel, fattore di crescita ridotto | BD Corning | 354230 | |
| Kit di colorazione Oli Red O | Beyotime Biotecnologia | C0158S | |
| Prolina | Solarbio | P0011 | |
| Piruvato di sodio | ThermoFisher | 11360-070 | |
| TGFβ 3 | di toluidina Novoprotein | CJ44 | |
| Solarbio | G2543 | ||
| TrypLE Express Enzyme(1x) | Gibco | 12604013 | |
| Piastra a 6 pozzetti con attacco ultrabasso | Costar | 3471 | |
| Versene | Gibco | 15040-66 | |
| Y-27632 | Stemcell | 72304 | |
| &alfa;-MEM | Hyclone | SH30265 | |
| β-glicerofosfato | Solarbio | G8100 |
Riferimenti
- Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
- Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One n....
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Ristampe e permessi
