Confronto di due metodi rappresentativi per la differenziazione di cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule stromali mesenchimali

Summary

Questo protocollo descrive e confronta due metodi rappresentativi per differenziare le hiPSC in cellule stromali mesenchimali (MSC). Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica. Il metodo dei corpi embrioidi (EBs) è caratterizzato da un minor consumo di tempo.

Abstract

Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule staminali pluripotenti adulte che sono state ampiamente utilizzate nella medicina rigenerativa. Poiché le MSC derivate da tessuti somatici sono limitate da donazioni limitate, variazioni di qualità e biosicurezza, negli ultimi 10 anni si è assistito a un grande aumento degli sforzi per generare MSC da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC). Gli sforzi passati e recenti nella differenziazione delle hiPSC in MSC sono stati incentrati su due metodologie di coltura: (1) la formazione di corpi embrioidi (EB) e (2) l'uso di colture monostrato. Questo protocollo descrive questi due metodi rappresentativi per derivare le MSC dalle hiPSC. Ogni metodo presenta i suoi vantaggi e svantaggi, tra cui il tempo, il costo, la capacità di proliferazione cellulare, l'espressione dei marcatori MSC e la loro capacità di differenziazione in vitro. Questo protocollo dimostra che entrambi i metodi possono derivare MSC mature e funzionali dalle hiPSC. Il metodo monostrato è caratterizzato da un costo inferiore, da un funzionamento più semplice e da una più facile differenziazione osteogenica, mentre il metodo EB è caratterizzato da un minor consumo di tempo.

Introduction

Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono cellule staminali pluripotenti adulte derivate dal mesoderma¹. Le MSC sono presenti in quasi tutti i tessuti connettivi². Da quando le MSC sono state scoperte per la prima volta negli anni '70 e isolate con successo dal midollo osseo nel 1987 da Friedenstein et al.3,4,5, una varietà di tessuti somatici umani (inclusi fetali e adulti) sono stati utilizzati per isolare le MSC come ossa, cartilagine, tendini, muscoli, tessuto adiposo e stroma di supporto ematopoietico ^1,2,6,7

Protocol

1. Mantenimento delle hiPSCs

1. Scongelamento di hiPSC
   1. Estrarre le celle dall'azoto liquido e scongelarle rapidamente a bagnomaria a 37 °C. Trasferire le cellule di scongelamento in una provetta da 15 mL preparata con 3 mL di terreno di mantenimento iPSC (Tabella dei materiali). Mescolare delicatamente il mezzo.
   2. Centrifugare a 300 x g per 5 min. Rimuovere il surnatante e risospendere delicatamente le cellule in 1 mL di terreno di mantenimento iPSC con 10 μM Y-27632 (pipettare le cellule su e giù 2-3 volte).
   3. Trasferire la sospensione cellulare in una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti....

Results

Seguendo il protocollo (Figura 1A), le hiPSC sono state differenziate in MSC attraverso i metodi di formazione EB e di coltura monostrato. Durante il differenziamento, le cellule hanno mostrato diverse morfologie rappresentative (Figura 1B,C).

Come mostrato nella Figura 1B, le colonie di hiPSCs mostrano una tipica morfologia compatta prima della differenziazione con un bordo chiaro compos.......

Discussion

In questo protocollo, sono stati esaminati due metodi rappresentativi di differenziazione delle hiPSC in MSC: 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Entrambi i metodi erano in grado di derivare l.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit di colorazione rosso alizarina	Beyotime  Biotecnologia	C0148S
Anti-umano-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-umano-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-umano-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-umano-CD73 ( APC)	Biolegend	344006
Anti-umano-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Acido ascorbico	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Agitatore di livello di anidride carbonica	Cristallo	CO-06UC6
Perle di compensazione	BioLegend	424601
CryoStor CS10	Tecnologia STEMCELL	07959
Desametasone	Beyotime  Biotecnologia	ST1254
DMEM/F12  medium	Servicebio	G4610
Siero fetale bovino	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
Gelatina	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
controllo dell'isotipo umano IgG1 APC	BioLegend	403505
controllo dell'isotipo IgG1 umano FITC	BioLegend	403507
controllo dell'isotipo IgG1 umano PE	BioLegend	403503
TGF umano-β 1	Proteina staminale	78067
TruStain umana FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime  Biotecnologia	ST1398
Indometacina	Solarbio	SI9020
Insulina	Beyotime  Biotecnologia	P3376
iPSC mezzo di manutenzione	STEMCELL Technology	85850
ITS Media Supplement	Beyotime  Biotecnologia	C0341-10mL
Matrigel, fattore di crescita ridotto	BD Corning	354230
Kit di colorazione Oli Red O	Beyotime  Biotecnologia	C0158S
Prolina	Solarbio	P0011
Piruvato di sodio	ThermoFisher	11360-070
TGFβ 3	di toluidina Novoprotein	CJ44
	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)	Gibco	12604013
Piastra a 6 pozzetti con attacco ultrabasso	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
&alfa;-MEM	Hyclone	SH30265
β-glicerofosfato	Solarbio	G8100