Mantenimento in cattività ed estrazione del veleno di Tityus serrulatus (scorpione giallo brasiliano) per la produzione di antidoto

Gli scorpioni sono artropodi appartenenti alla classe Arachnida, ordine degli Scorpioni, che comprende circa 2.621 specie ^1,2. Questi animali hanno un ampio areale geografico e sono presenti in tutti i continenti ad eccezione dell'Antartide¹. L'avvelenamento causato dagli scorpioni provoca la morbilità o la morte di migliaia di persone ogni anno in tutto il mondo³. Nel 2019 si stima che ci siano stati più di 1,2 milioni di incidenti e 3.500 decessi annuali causati da questi animali. In Brasile, il numero di casi è aumentato in modo esponenziale, raggiungendo più di 100.000 casi all'anno dal 2017 ^4,5,6. L'urbanizzazione incontrollata osservata in Brasile negli ultimi decenni, senza un adeguato trattamento delle acque reflue e una regolare raccolta e smaltimento dei rifiuti, associata al degrado ambientale e ai cambiamenti climatici, ha creato le condizioni per la proliferazione di scorpioni invasivi, come T. serrulatus, aumentando il contatto con l'uomo e provocando così incidenti dannosi ^4,7,8. Ci sono circa 178 specie di scorpioni in Brasile, ma le punture di importanza medica sono causate dal genere Tityus, con quattro specie (T. serrulatus, T. bahiensis, T. stigmurus e T. obscurus) che destano preoccupazione medica, con Tityus serrulatus responsabile dei casi più gravi e dei decessi ^7,9.

L'Instituto Butantan è il principale laboratorio di produzione di antidoto in Brasile, che fornisce circa 70.000 fiale di antidoto per scorpioni per il sistema sanitario brasiliano. In breve, le fasi coinvolte nella produzione di antidoto includono l'inoculazione di antigeni derivati dal veleno negli equini, la raccolta e la purificazione del plasma ricco di anticorpi, ottenendo fiale da 5 ml di antidoto per scorpioni. Ogni flaconcino è in grado di neutralizzare, almeno, 1 mg di veleno di scorpione per mL di antidoto. L'Artropods Bioterium è parte integrante del centro industriale, responsabile della fornitura del materiale di partenza per l'antidoto dello scorpione.

Il Bioterium degli Artropodi dell'Instituto Butantan è stato originariamente chiamato Laboratorio degli Artropodi ed è stato fondato nel 1967. Tuttavia, è solo nel 1995 che il Laboratorio si trasferisce in una struttura esclusiva dedicata all'alloggiamento degli artropodi velenosi^10,11. A quel tempo, gli scorpioni erano tenuti in una stanza di 12^m2 senza temperatura controllata e distribuiti in circa 13 recinti, ognuno dei quali ospitava un massimo di 300 animali¹⁰. A causa della crescente domanda di veleno nel corso degli anni e della conseguente necessità di aumentare il numero di animali, insieme ai miglioramenti nel processo di estrazione del veleno, nel 2016 si è verificato un importante cambiamento. Il Laboratorio è stato integrato nel centro industriale dell'Instituto Butantan ed è stato ribattezzato Arthropods Bioterium. Inoltre, nel 2016, il Bioterium si è trasferito in una nuova struttura appositamente costruita. La nuova sala scorpioni copre un'area di 24^m2 e contiene circa 48 recinti in polipropilene, ognuno dei quali ospita fino a 300 animali, come mostrato nella Figura 1. Ciò si traduce in un totale di 10.000-20.000 individui mantenuti in condizioni di cattività controllata, con variazioni nel corso dell'anno. Gli scorpioni sono gestiti con cura secondo rigidi protocolli di allevamento per garantire il loro benessere, soddisfacendo al contempo le elevate esigenze di produzione e aderendo alle buone pratiche e agli standard etici per la cura degli animali. Per l'estrazione del veleno è stata progettata e costruita una stanza specifica, che ospita due armadi per il flusso d'aria, come mostrato nella Figura 2A. Questi armadi servono come misure di sicurezza per impedire ai tecnici di inalare particelle di veleno durante la procedura di estrazione. I dispositivi di protezione individuale (DPI) sono obbligatori per i tecnici, compresi grembiuli sintetici e mascherine FFP2, per evitare qualsiasi contaminazione e garantire la loro sicurezza.

Figura 1: Vista generale della stanza dello scorpione del Bioterium degli Artropodi. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Area di lavoro . (A) Vista generale della sala di estrazione del veleno del Bioterium degli Artropodi. (B) Superficie di lavoro dell'armadio del flusso d'aria. Tutti i materiali e le attrezzature sono preparati e disposti sulla parte superiore del piano di lavoro dell'armadio del flusso d'aria. La freccia nera indica il dispositivo elettrostimolatore e la freccia rossa indica la pinza. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Circa il 90% degli scorpioni T. serrulatus nel Bioterium degli Artropodi proviene da diversi siti, raccolti dagli agenti sanitari municipali nell'ambito di un programma di sorveglianza e controllo per questi animali. Gli scorpioni vengono catturati nelle aree urbane e poi inviati all'Instituto Butantan come parte di un programma collaborativo. Gli scorpioni di T. serrulatus sono partenogenetici, il che significa che la nascita avviene come conseguenza dello sviluppo della prole da uova non fecondate, senza la presenza di un individuo del sesso opposto¹². A causa di questo tipo di riproduzione, alcuni animali nascono in cattività nella nostra struttura e vengono mantenuti fino al raggiungimento della fase adulta, seguendo un protocollo di allevamento simile a quello descritto di seguito. Una volta raggiunto lo stadio adulto, vengono aggiunti alla routine di estrazione del veleno. All'arrivo, gli scorpioni vengono sottoposti a un primo screening e quelli in buone condizioni di salute vengono tenuti in recinti collettivi contenenti un massimo di 350 individui, divisi per provenienza. Per ogni recinto viene compilato giornalmente un modulo di controllo che fornisce dati sulla data di alimentazione e sul tipo di preda offerta (grillo o scarafaggio), sull'approvvigionamento idrico, sulle procedure di pulizia, sul numero di animali morti e sul numero di animali vivi rimasti all'interno del recinto.

In un'agenda prestabilita, gli animali vengono sottoposti a stimolazione elettrica e il veleno risultante di centinaia di individui viene quindi liofilizzato, dando luogo a lotti di veleno liofilizzato. Il veleno standardizzato ottenuto da questo processo è destinato all'immunizzazione del cavallo come parte del processo di fabbricazione, nonché a fornire materiale di riferimento per il controllo di qualità del principio attivo e del prodotto finale.

Ci sono pochissime strutture al mondo in grado di detenere un numero così elevato di scorpioni ed eseguire il volume delle estrazioni del veleno in conformità con le buone pratiche di fabbricazione e l'uso etico degli animali, come fatto nel Bioterium Artropodi dell'Instituto Butantan. Pertanto, il nostro obiettivo è quello di descrivere i protocolli di mantenimento dello scorpione e le procedure di estrazione del veleno utilizzate nell'allevamento di T. serrulatus , che forniscono con successo la quantità necessaria di veleno per la produzione di antidoto dello scorpione.

I protocolli che coinvolgono animali invertebrati sono esenti dall'approvazione del Comitato per l'Uso e la Cura degli Animali dell'Instituto Butantan. Tuttavia, il mantenimento degli scorpioni qui descritto segue parametri etici e il benessere degli animali viene rispettato in base alle esigenze della specie.

1. Abitazioni

1. Tenere gli scorpioni in contenitori comuni di polipropilene come recinti (altezza 35 cm, larghezza 35,5 cm, lunghezza 72 cm) contenenti un massimo di 350 animali.
2. Mantenere il locale in cui sono alloggiati i recinti degli animali a una temperatura controllata di 24 °C (±0,5 °C) in un ciclo di luce di 10 ore con luci accese e 14 ore con luci spente.
3. Rivestire il pavimento del recinto (in basso) di ciascun contenitore con carta kraft fissata con nastro adesivo sui bordi su tutti i lati in modo che gli animali non possano entrare sotto la carta (Figura 3A).
4. Utilizzare quattro vassoi di cartone (vassoi per uova) come substrati verticali, impilati su un lato del contenitore, con un foglio di cartone rigido posto tra ciascun vassoio (Figura 3B,C).
5. Posizionare un vassoio di polipropilene poco profondo (vassoio dell'acqua) sul lato opposto del recinto, contenente cotone imbevuto come fonte d'acqua per gli animali (Figura 3B).
6. Tenere i contenitori senza coperchio per aumentare il flusso d'aria. Posizionare una striscia di circa 10 cm di nastro di plastica autoadesivo sulla parte superiore della superficie interna del recinto e sugli angoli superiori per rendere le pareti abbastanza lisce da impedire agli animali di fuoriuscire dal contenitore (Figura 3A).

Figura 3: Alloggiamento e preparazione dell'involucro . (A) Le frecce indicano la carta kraft sul fondo, fissata con nastro adesivo sui bordi. Le linee tratteggiate indicano il nastro di plastica autoadesivo posto sulla parte superiore della superficie interna dell'armadio. (B) Substrato verticale (vassoi per uova impilati su un lato del contenitore) e un vassoio in polipropilene poco profondo (vassoio per l'acqua) posto sul lato opposto. (C) Dettaglio del substrato verticale: vassoi per uova infilzati con un foglio di cartone rigido tra due vassoi. (D) Fogli di cartone e vassoi per uova posizionati a strati, che simulano l'habitat naturale buio e umido di T. serrulatus . (E) Animali alloggiati nel substrato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Routine di igiene

NOTA: La routine di igiene si divide in due procedure di manutenzione: manutenzione completa e parziale. Il primo viene eseguito 2 giorni dopo l'alimentazione degli animali o quando il recinto viene selezionato per l'estrazione del veleno. La manutenzione parziale viene eseguita quando gli animali non vengono nutriti.

1. Manutenzione completa
   1. Preparare un involucro pulito con un nuovo substrato (vassoi per uova, cartone e carta kraft) e un vassoio per l'acqua pulita, come descritto nella sezione 1.
   2. Utilizzando una pinza lunga, rimuovere la vaschetta dell'acqua dall'involucro. Se ci sono scorpioni sulla vaschetta dell'acqua, rimuoverli e riporli nell'involucro pulito.
   3. Ripetere la stessa procedura descritta al punto 2.1.2 con tutti i vassoi per le uova e i fogli di cartone, rimuovendo tutti gli scorpioni e mettendoli nell'involucro pulito.
   4. Dopo aver rimosso i vassoi, rimuovere tutti gli scorpioni rimasti sul pavimento del recinto e posizionarli nel recinto pulito. Assicurati di tenere conto di eventuali carcasse e di gettarle correttamente. Raccogli tutte le prede vive rimanenti (insetti) e rimuovile dal recinto.
   5. Rimuovere tutti i substrati monouso dall'involucro (vassoi per uova, foglio di cartone e carta kraft) e gettarli correttamente. Inviare gli articoli riutilizzabili (vaschetta dell'acqua e contenitore in polipropilene) per la sanificazione.
      NOTA: La sanificazione degli articoli riutilizzabili viene eseguita con ipoclorito allo 0,5% combinato con un detergente neutro. È obbligatorio che i materiali vengano accuratamente e abbondantemente risciacquati con acqua corrente dopo l'utilizzo di qualsiasi prodotto o soluzione igienizzante.
2. Manutenzione parziale
   NOTA: La manutenzione parziale consiste nell'ispezione di tutti i substrati (vassoi per uova e carta kraft) con l'obiettivo di rimuovere carcasse di scorpioni morti e altri detriti indesiderati, ma senza scartare i substrati o cambiare l'involucro.
   1. Eseguire l'ispezione utilizzando una pinza lunga per sollevare delicatamente ogni vassoio delle uova e rimuovere i rifiuti.
   2. Se necessario, sostituire uno o più vassoi per uova con uno pulito.
   3. Sostituisci completamente la vaschetta dell'acqua con una pulita utilizzando una pinza lunga. Trasferisci eventuali scorpioni sul vassoio dell'acqua nel vassoio delle uova in un'altra parte del recinto.

3. Alimentazione

1. Nutrire gli animali ogni 15 giorni secondo il programma di estrazione del veleno. Nutrire gli animali che saranno munti 7 giorni prima e 7 giorni dopo l'estrazione del veleno.
2. Per l'alimentazione, somministrare alternativamente scarafaggi (Phoetalia pallida) e grilli (Gryllus sp.).
3. Calcolare la quantità di cibo in base all'apporto energetico degli animali; Offri 1 preda ogni 3 o 5 scorpioni nel recinto.
4. Contare la quantità calcolata di prede e metterle vive all'interno del recinto, lasciandole per 2 giorni prima della manutenzione completa (sezione 2.1).
5. Quando offri scarafaggi, applica un carbonato di calcio con una soluzione alcolica intorno alla parte superiore degli involucri. La soluzione fa sì che gli scarafaggi scivolino e non siano in grado di arrampicarsi sulla superficie laterale del recinto, impedendo così agli insetti di scappare.

4. Estrazione del veleno

NOTA: Gli animali utilizzati nella routine di estrazione del veleno sono adulti o pre-adulti. A causa della difficoltà nel determinare la completa maturità sessuale dello scorpione giallo brasiliano (fase adulta), è stato determinato che gli animali con una lunghezza totale del corpo compresa tra 5 e 7 cm sono idonei per la procedura.

1. Mungere ogni animale ogni 2-3 mesi.
2. Il giorno dell'estrazione del veleno, contare tutti gli animali vivi nel recinto e trasferirli in un contenitore di vetro utilizzando una lunga pinza (Figura 4).
3. Preparare e disporre tutti i materiali e le attrezzature da utilizzare sulla parte superiore del piano di lavoro dell'armadio del flusso d'aria. Collegare il cavo di alimentazione dell'elettrostimolatore alla presa e accendere l'elettrostimolatore e l'armadio del flusso d'aria (Figura 2B).
   1. Utilizzare le seguenti impostazioni dei parametri dell'elettrostimolatore: potenziale (differenza di potenziale tra gli elettrodi): 540 mV, stress (durata dell'impulso elettrico): 2 ms, azione (intermittenza per moderare la potenza utilizzata, che ridurrebbe il riscaldamento del tessuto organico telson): 70%, ciclo (regolare la ripetizione ciclica): 1 s e intensità (corrente elettrica che circola attraverso il muscolo dell'animale): 0,75 mA.
4. Trattieni manualmente ogni animale in modo che il telson stia fermo, seguendo i passaggi:
   1. Tenere il metassoma dell'animale con una pinza diritta (Figura 5A).
   2. Immobilizzare il telson con una pinza curva (Figura 5B).
   3. Trattenere il telson con la mano (Figura 5C,D).
5. Dopo il ritenzione, posizionare il telson a diretto contatto con il conduttore dell'elettrostimolatore, senza la necessità di utilizzare una soluzione conduttiva. La scossa elettrica provoca una contrazione muscolare involontaria della ghiandola velenifera e conseguente espulsione del veleno.
6. Raccogliete le gocce di veleno direttamente in un microtubo di plastica posto vicino al conduttore dell'elettrostimolatore (Figura 6).
7. Successivamente, rilascia nuovamente l'animale nel contenitore di vetro, seguendo i passaggi:
   1. Trasferisci il telson dell'animale dalla mano alla pinza curva.
   2. Appoggiare delicatamente l'animale sul fondo del contenitore di vetro.
8. Eseguire i passaggi 4.4-4.7 con ogni animale nel recipiente di vetro.
9. Dopo che tutti gli animali nel recipiente di vetro sono stati munti, rimettili nel recinto.
10. Conservare il veleno raccolto a -20 °C fino al processo di liofilizzazione.

Figura 4: Scorpioni nel contenitore di vetro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Procedura di immobilizzazione per l'estrazione del veleno. (A) Metassoma trattenuto con una pinza diritta (freccia nera). (B) Telson immobilizzato con pinze curve (freccia nera). (C) Trasferimento del telson trattenuto dal forcipe alla mano. (D) Telson trattenuto per la mano. Si raccomanda di maneggiare gli animali a mani nude poiché quando si utilizzano i guanti, gli scorpioni possono afferrare il materiale con gli artigli, rendendo difficile il rilascio al termine della procedura e aumentando notevolmente il rischio di incidenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Estrazione del veleno. Un microtubo di plastica (freccia bianca) posto vicino all'elettrostimolatore (freccia gialla). Le gocce di veleno vengono raccolte direttamente nella provetta mantenuta a temperatura ambiente durante la procedura. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per ogni procedura sono state sviluppate trenta procedure operative standard (SOP), garantendo la ripetibilità delle procedure tra i tecnici e il rispetto dei parametri di qualità. Il tasso medio di mortalità dopo la procedura di estrazione è di circa il 12%, che può essere considerato basso, considerando la routine di elettrostimolazione e l'ambiente di cattività, dove i fattori di stress vengono ridotti con successo applicando le procedure.

Per mantenere gli animali in salute, un vassoio ricoperto di cotone e acqua è posizionato a un'estremità della scatola, mentre fogli di cartone e vassoi per uova sono posizionati a strati sul lato opposto, simulando l'habitat naturale buio e umido di T. serrulatus (Figura 3D,E). Il substrato descritto si è dimostrato efficace nel mantenere un gran numero di animali in uno spazio ristretto, fornendo riparo e spazio sufficienti, garantendo così il loro benessere.

Ogni anno, la produzione di veleno di T. serrulatus supera la quantità di 80 grammi di veleno liquido, corrispondente a più di 13 grammi di veleno liofilizzato. Abbiamo raccolto indicatori di produzione, come il veleno medio munto per animale, il numero di animali e la quantità di veleno ottenuta al mese, come mostrato comparativamente nella Tabella 1, Figura 7, Figura 8 e Figura 9. I tre grafici mostrano una linea di tendenza positiva, che indica un coefficiente di correlazione di Pearson positivo (rispettivamente R= 0,68; R= 0,84; e R= 0,74). Circa 3.000-5.000 scorpioni vengono munti mensilmente in base alla domanda di produzione di antidoti, con una media del 90% di estrazioni positive. La maggior parte degli animali viene sottoposta a più di cinque procedure di estrazione del veleno durante la loro vita produttiva nella struttura, il che riflette la longevità degli animali, la bassa morbilità o danni alle ghiandole velenifere e il basso tasso di mortalità. È importante affermare che c'è una diminuzione della quantità di veleno ottenuto da scorpioni che sono stati estratti più volte, ma sono ancora produttivi.

Figura 7: Confronto mensile del veleno liofilizzato estratto per animale (2012-2022). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Confronto del veleno liofilizzato estratto al mese (2012-2022) Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Confronto del numero di scorpioni estratti al mese (2012-2022). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Confronto degli indicatori di produzione (2012-2022).

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.