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Articolo metodologico

Identificazione, diagnosi e classificazione dei tumori maligni della guaina dei nervi periferici in modelli murini geneticamente modificati

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DOI:

10.3791/65740

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17 maggio 2024

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1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

In questo articolo

Sommario

Abbiamo sviluppato una metodologia per valutare se le neoplasie del sistema nervoso nei topi geneticamente modificati ricapitolano accuratamente la patologia delle loro controparti umane. Qui, applichiamo queste tecniche istologiche, i criteri patologici definiti e le metodologie di coltura ai neurofibromi e ai tumori maligni della guaina dei nervi periferici che insorgono nel modello murino P 0-GGFβ3.

Abstract

I pazienti con la sindrome da suscettibilità al tumore autosomico dominante neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) sviluppano comunemente neurofibromi plessiformi (PN) che successivamente si trasformano in tumori maligni altamente aggressivi della guaina dei nervi periferici (MPNST). La comprensione del processo attraverso il quale un PN si trasforma in un MPNST sarebbe facilitata dalla disponibilità di modelli murini geneticamente modificati (GEM) che replicano accuratamente la progressione PN-MPNST osservata negli esseri umani con NF1. Sfortunatamente, i modelli GEM con ablazione di Nf1 non ricapitolano completamente questo processo. Questo ci ha portato a sviluppare topi P 0-GGFβ3, un modello GEM in cui la sovraespressione del mitogeno delle cellule di Schwann neuregulin-1 (NRG1) nelle cellule di Schwann provoca lo sviluppo di PN che progrediscono fino a diventare MPNST ad alta frequenza. Tuttavia, per determinare se la tumorigenesi e la progressione neoplastica nei topi P 0-GGFβ3 modellano accuratamente i processi osservati nei pazienti NF1, abbiamo dovuto prima dimostrare che la patologia dei tumori della guaina nervosa periferica P0-GGFβ3 ricapitola la patologia delle loro controparti umane.

In questo articolo, descriviamo le metodologie specializzate utilizzate per diagnosticare e classificare accuratamente le neoplasie del sistema nervoso periferico in modelli GEM, utilizzando P 0-GGFβ3 e P0-GGFβ3; Trp53+/- topi come esempio. Descriviamo i metodi istologici, immunoistochimici e istochimici utilizzati per diagnosticare PN e MPNST, come distinguere queste neoplasie da altri tipi di tumore che ne imitano la patologia e come classificare queste neoplasie. Discutiamo la creazione di colture di passaggio precoce da MPNST GEM, come caratterizzare queste colture utilizzando l'immunocitochimica e come verificare la loro tumorigenicità stabilendo allotrapianti. Collettivamente, queste tecniche caratterizzano la patologia dei PN e degli MPNST che insorgono nei modelli GEM e confrontano criticamente la patologia di questi tumori murini con le loro controparti umane.

Introduzione

Negli ultimi tre decenni, numerosi laboratori hanno tentato di creare modelli murini di tumori umani introducendo mutazioni associate al cancro umano nel genoma del topo o sovraesprimendo un prodotto genico che è sovraespresso nei tumori umani. I modelli murini geneticamente modificati (GEM) risultanti possono essere utilizzati per una varietà di scopi, come stabilire che la modifica genomica di nuova introduzione avvia la tumorigenesi, identificare altri cambiamenti genetici o epigenetici che si verificano successivamente che contribuiscono alla progressione del tumore e definire le vie di segnalazione chiave che guidano l'inizio e la progressione del tumore. A differenza dei modelli di xenotrapianto ortotopico, che si basano sull'uso di topi immunodeficienti, i modelli di cancro GEM hanno un sistema immunitario completamente funzionale e quindi modellano in modo più accurato le risposte agli agenti terapeutici candidati. Tuttavia, quando si utilizzano modelli di cancro GEM per scopi come questi, è essenziale che i ricercatori confermino che le osservazioni fatte con le neoplasie GEM sono rilevanti per le loro controparti umane. Tale convalida deve includere una valutazione approfondita della patologia delle neoplasie GEM e la determinazione se le caratteristiche patologiche delle neoplasie GEM ricapitolano la patologia del corrispondente tipo di tumore umano.

La sindrome da suscettibilità al tumore neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) è la malattia genetica più comune che colpisce il sistema nervoso umano, che si verifica in circa 1 ogni 3.000-3.500 nati vivi 1,2,3. Gli individui affetti da NF1 sviluppano tumori multipli benigni della guaina nervosa periferica noti come neurofibromi nella pelle (neurofibromi dermici) e nei grandi nervi e plessi nervosi (neurofibromi plessiformi). Mentre sia i neurofibromi cutanei che quelli plessiformi peggiorano la qualità della vita del paziente producendo compromissione fisica, comportamentale e/o sociale, i neurofibromi plessiformi (PN) sono particolarmente pericolosi 4,5. Ciò è dovuto al fatto che i PN si trasformano spesso in tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNST), che sono neoplasie aggressive a cellule fusiformi con un tasso di sopravvivenza eccezionalmente basso 1,2. In gran parte, questo basso tasso di sopravvivenza è dovuto al fatto che i regimi radioterapici e chemioterapici attualmente utilizzati per trattare le MPNST sono inefficaci. Tuttavia, lo sviluppo di nuove terapie più efficaci è stato impegnativo. Questo perché, nonostante la frequenza con cui le MPNST si verificano nei pazienti NF1, si tratta comunque di neoplasie rare. Di conseguenza, è molto difficile ottenere un gran numero di tumori umani da studiare; è anche difficile reclutare un numero sufficiente di pazienti con MPNST per gli studi clinici. Per superare queste limitazioni, sono stati generati diversi modelli GEM con l'obiettivo di ottenere ulteriori informazioni sulle anomalie che guidano la patogenesi del neurofibroma e la progressione del PN-MPNST e di facilitare gli studi preclinici con agenti terapeutici candidati.

I pazienti affetti da NF1 presentano mutazioni inattivanti in una copia del gene NF1. La patogenesi del neurofibroma si innesca quando si verifica una mutazione inattivante nel gene NF1 funzionale rimanente in una cellula della linea cellulare di Schwann. Sorprendentemente, tuttavia, quando i topi sono stati generati con mutazioni Nf1 inattivanti la linea germinale, non hanno sviluppato neurofibromi 6,7. La successiva dimostrazione che topi con cellule di Schwann Nf1-null e aploinsufficienza di Nf1 in tutti gli altri tipi cellulari (Krox20-Cre;Nf1flox/- topi) hanno sviluppato neurofibromi plessiformi hanno suggerito che per la patogenesi del neurofibroma8 era necessario un dosaggio ridotto del gene Nf1 in altri tipi di cellule. Anche allora, i neurofibromi plessiformi in Krox20-Cre; I topi flox/- Nf1 non sono progrediti fino a diventare MPNST e quindi hanno imitato solo parzialmente la biologia delle loro controparti umane. La patogenesi delle MPNST si è verificata quando le mutazioni di Nf1 sono state associate a mutazioni in altri geni oncosoppressori come Trp539 o Cdkn2a10, ma le MPNST in questi modelli GEM si sono sviluppate de novo o da neoplasie neurofibromatiche atipiche a potenziale biologico incerto (ANNUBPs)11,12, piuttosto che da neurofibromi plessiformi benigni preesistenti (vedi13,14 per eccellenti revisioni di questi modelli e di altri modelli che introducono ulteriori mutazioni con perdita di funzione associate a MPNST in geni come Suz12 e Pten15).

Questi modelli murini sono stati preziosi per stabilire il ruolo che geni come NF1, TP53 e CDKN2A svolgono nella patogenesi delle neoplasie del sistema nervoso periferico associate a NF1 e per studi preclinici che testano agenti terapeutici candidati. Tuttavia, abbiamo ancora una comprensione incompleta del processo attraverso il quale i neurofibromi plessiformi progrediscono fino a diventare neoplasie neurofibromatiche atipiche di potenziale biologico incerto (ANNUBPs16) e quindi MPNST. Recentemente sono stati compiuti alcuni progressi nella comprensione di questo processo con il recente rapporto secondo cui i topi con delezioni in Nf1 e Arf sviluppano ANNUBP che progrediscono fino a diventare MPNST11. Tuttavia, non esistono ancora modelli murini basati sulla mutazione di Nf1 che ricapitolano completamente il processo di progressione del neurofibroma plessiforme-MPNST osservato nell'uomo. Inoltre, non è chiaro se esistano più percorsi distinti che portano allo sviluppo di MPNST. Alla luce di ciò, è possibile che i GEM sopra descritti modellino solo un sottoinsieme di diversi percorsi che portano alla progressione del neurofibroma-MPNST e alla patogenesi del MPNST. Questo punto è enfatizzato dal fatto che le MPNST si verificano anche sporadicamente e che alcune MPNST sporadiche apparentemente non hanno mutazioni NF1 17,18.

Sebbene quest'ultimo punto sia stato messo in discussione dal recente suggerimento di Magollon-Lorenz et al. secondo cui almeno alcuni MPNST sporadici privi di mutazioni NF1 sono melanomi o un diverso tipo di sarcoma19, abbiamo recentemente riportato un MPNST sporadico e una linea cellulare derivata da questo tumore (cellule 2XSB) che era NF1 wild-type20. Durante la caratterizzazione del tumore genitore e della linea cellulare 2XSB, abbiamo sistematicamente escluso possibilità diagnostiche alternative, tra cui il melanoma e i molteplici altri tipi di sarcoma che sono considerati di routine nella diagnosi differenziale di un tumore maligno sporadico della guaina dei nervi periferici20. Inoltre, notiamo che Magollon-Lorenz et al. hanno riconosciuto che i loro risultati nelle tre linee cellulari MPNST sporadiche che hanno studiato non potevano essere generalizzati per indicare che tutti i tumori identificati come MPNST sporadici non lo sono.

Per costruire un modello GEM in cui il neurofibroma e la patogenesi di MPNST non dipendessero necessariamente da specifiche mutazioni del gene oncosoppressore, abbiamo generato topi transgenici in cui la sovraespressione del potente mitogeno delle cellule di Schwann neuregulin-1 (NRG1) era guidata dal promotore della proteina mielinica zero (P0) specifica per le cellule di Schwann (topi P 0-GGFβ3)21. Abbiamo precedentemente dimostrato che i neurofibromi umani, gli MPNST e le linee cellulari MPNST esprimono diverse isoforme NRG1 insieme alle tirosin-chinasi del recettore erbB (erbB2, erbB3 e erbB4) che mediano la segnalazione di NRG1 e che questi recettori erbB sono costitutivamente attivati22. Abbiamo anche dimostrato che gli inibitori farmacologici delle chinasi erbB inibiscono potentemente la proliferazioneMPNST 22, la sopravvivenza23 e la migrazione24. In linea con le nostre osservazioni nell'uomo, i topi P 0-GGFβ3 sviluppano neurofibromi plessiformi25 che progrediscono fino a diventare MPNST ad alta frequenza21,25. Abbiamo dimostrato che le MPNST P 0-GGFβ3, come le loro controparti umane, sviluppano comunemente mutazioni di Trp53 e Cdkn2a, così come numerose altre anomalie genomiche che potenzialmente contribuiscono alla tumorigenesi25. Le MPNST che insorgono nei topi P 0-GGFβ3 non hanno mutazioni inattivanti di Nf1. Tuttavia, utilizzando la complementazione genetica, abbiamo dimostrato che NRG1 promuove la tumorigenesi nei topi P 0-GGFβ3 prevalentemente attraverso le stesse cascate di segnalazione che sono alterate dalla perdita di Nf1 26; questa conclusione si basa sulla nostra scoperta che la sostituzione della sovraespressione di NRG1 con la perdita di Nf1 in presenza di aploinsufficienza di Trp53 (P 0-GGFβ3;Trp53+/- topi) produce animali in cui le MPNST si sviluppano de novo, come si vede in cis-Nf1+/-; Trp53+/- topi27.

Per ottenere queste e altre informazioni che dimostrino che i topi P 0-GGFβ3 modellano accuratamente i processi di patogenesi del neurofibroma e della progressione del neurofibroma-MPNST osservati nell'uomo con NF1, abbiamo sviluppato metodologie specializzate per l'elaborazione dei tessuti di questi animali, la diagnosi accurata dei loro tumori, la classificazione delle MPNST che insorgono in questi topi, la determinazione e la caratterizzazione di P0-GGFβ3 e P0-GGFβ3 a passaggio precoce; colture di Trp53+/- MPNST e confronto critico della patologia di P 0-GGFβ3 PNs e MPNSTs e P 0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST a quello delle loro controparti umane. Molte di queste metodologie sono generalizzabili ad altri modelli GEM di neoplasia del sistema nervoso. Inoltre, molte di queste metodologie sono più ampiamente applicabili a modelli GEM in cui le neoplasie insorgono in altre sedi d'organo. Di conseguenza, qui presentiamo una descrizione dettagliata di queste metodologie.

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Protocollo

Le procedure qui descritte sono state approvate dall'IACUC dell'Università di Medicina della Carolina del Sud e sono state eseguite da personale adeguatamente addestrato in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e le linee guida istituzionali per la cura degli animali del MUSC.

1. Determinazione della penetranza e della sopravvivenza del tumore nei topi P 0-GGFβ3 e identificazione dei tumori in questi animali per un'ulteriore caratterizzazione

  1. Generare la coorte di topi che saranno valutati per la tumorigenesi. Il numero di topi necessari dipende dalla penetranza del fenotipo tumorale. Per compensare perdite come queste, inizia con una coorte superiore del 10-15% rispetto al numero finale di animali desiderato.
    NOTA: Abbiamo determinato empiricamente la penetranza del tumore nei topi P 0-GGFβ3 in una coorte iniziale di 50 topi (sei dei quali sono stati persi per motivi non correlati alla neoplasia (ad esempio, combattimento))25.
  2. Valuta la salute degli animali tre volte alla settimana e registra i punteggi delle condizioni corporee, inclusi il peso e i cambiamenti comportamentali ad ogni esame. Terminare topi portatori di tumore o moribondi (vedi nota sotto) utilizzando l'eutanasia con anidride carbonica seguita da lussazione cervicale. Record di età alla morte in giorni. Se i tumori sono visibili esternamente, registrare le dimensioni del tumore (lunghezza, larghezza e altezza).
    NOTA: È essenziale che gli animali non siano autorizzati a procedere oltre la dimensione massima consentita del tumore approvata dalla IACUC e/o l'endpoint umano.
  3. Utilizzando l'età alla morte, stabilire una curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier per determinare l'età media alla morte e l'intervallo di sopravvivenza.
    NOTA: I topi P 0-GGFβ3 avevano un'età media alla morte di 261,5 giorni, con un intervallo di 74-533 giorni; Il 91% della nostra coorte aveva neurofibromi multipli e il 71% aveva MPNST21.
  4. Determinare se sono presenti tumori grossolanamente visibili e, in caso affermativo, sezionarli in condizioni sterili per stabilire se il tumore è associato a un nervo periferico e quindi asportare il tumore. In P 0-GGFβ3 e P0-GGFβ3; Topi Trp53+/-, i tumori della guaina nervosa periferica si trovano più comunemente nei nervi trigemino e sciatico. Anche se non si osservano tumori grossolanamente visibili in associazione con questi nervi, fissare e incorporare questi nervi come descritto di seguito in modo che possano essere esaminati per la presenza di microtumori. I micro-tumori si verificano tipicamente all'interno dei gangli associati a questi nervi.
  5. Tagliare in tre pezzi i tumori grossolanamente visibili (Figura 1A). Utilizzare il pezzo 1 per l'istologia (sezioni di paraffina, immunoistochimica e istochimica). Usa il pezzo 2 per stabilire le culture di primo passaggio. Congelare a scatto il pezzo 3 (utilizzando azoto liquido) per possibili esperimenti futuri (ad esempio, immunoblot, isolamento di RNA e DNA).
  6. Fissare il pezzo 1 in paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per una notte a 4 oC. Fissare il resto del corpo dell'animale immergendolo in paraformaldeide al 4% per una notte a 4 °C.

2. Inclusione in paraffina di tumori grossolanamente visibili e preparazione di sezioni colorate con ematossilina ed eosina per la valutazione diagnostica iniziale

  1. Inclusione di paraffina di tumori grossolanamente visibili
    1. Dopo aver fissato il tumore 1 per una notte in paraformaldeide al 4%, sciacquare il tessuto inserendolo in un volume di PBS almeno 10 volte maggiore del volume del tessuto per 15 min; Utilizzare lo stesso volume per tutti i risciacqui successivi. Ripetere altri due risciacqui PBS da 15 minuti, utilizzando un nuovo volume di PBS per ogni risciacquo.
    2. Trasferire il pezzo tumorale 1 al 70% di etanolo. Tenere il tessuto in etanolo al 70% per 24 ore a 4 °C. Se lo si desidera, conservare il tessuto a lungo termine in queste condizioni.
      NOTA: I passaggi da 2.1.1 a 2.1.7 sono forniti a beneficio degli sperimentatori che non hanno accesso a una macchina commerciale per il trattamento dei tessuti. Se lo sperimentatore ha accesso a un processatore di tessuti, il tessuto verrà processato attraverso etanoli e xileni graduati secondo il protocollo dello strumento programmato.
    3. Trasferire il pezzo di tumore da 1 a etanolo all'80% per 30 minuti a temperatura ambiente. Ripetere l'incubazione per altri 30 minuti in un volume fresco di etanolo all'80%.
    4. Trasferire il pezzo tumorale da 1 a etanolo al 95% per 75 minuti a temperatura ambiente. Ripetere l'incubazione altre due volte, ogni volta per altri 75 minuti in un volume fresco di etanolo al 95%.
    5. Trasferire il pezzo di tumore 1 al 100% di etanolo e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. Ripetere l'incubazione di 60 minuti altre due volte, ogni volta utilizzando un nuovo volume di etanolo al 100%.
    6. Trasferire il pezzo tumorale 1 in un solvente a base di d-limonene e incubare per 30-60 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il pezzo tumorale 1 in un volume fresco di solvente a base di d-limonene e incubare per altri 30-60 minuti a temperatura ambiente.
    7. Trasferire il pezzo tumorale 1 in solvente 1:1 a base di paraffina/d-limonene per 1 ora a 60 oC. Scartare il solvente 1:1 a base di paraffina/d-limonene e trasferire il pezzo tumorale da 1 a 60 oC di paraffina e incubare per 20 minuti a 60 oC. Ripetere l'incubazione in un nuovo volume di paraffina a 60 oC ancora una volta per 20 min. Incubare il tumore 1 in paraffina per una notte a 60 °C.
    8. Versare uno strato di base di paraffina in uno stampo istologico in acciaio e lasciarlo solidificare. Trasferire il pezzo tumorale 1 sulla superficie della paraffina di base e, subito dopo il posizionamento, coprire il tessuto con paraffina a 60 °C e posizionare la cassetta tissutale sopra e a contatto con la paraffina fusa. Trasferire lo stampo sul lato freddo della stazione di inclusione e lasciarlo solidificare per 10-15 minuti.
    9. Rimuovere lo stampo dal blocco di paraffina con la cassetta di tessuto attaccata. Utilizzare la cassetta di tessuto allegata per fissare il blocco al microtomo durante il sezionamento.
      NOTA: Il blocco di paraffina può ora essere conservato a tempo indeterminato a temperatura ambiente.
  2. Preparare sezioni colorate con ematossilina ed eosina di tumori grossolanamente visibili.
    1. Tagliare sezioni di tessuto tumorale di 4-5 μm utilizzando un microtomo e montarle su vetrini caricati positivamente.
    2. Per eseguire la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E), deparaffinizzare le sezioni di tessuto incubando i vetrini in un solvente a base di d-limonene per 10 minuti a temperatura ambiente. Ripetere l'incubazione in un nuovo volume di solvente a base di d-limonene per 10 minuti.
    3. Trasferire i vetrini in etanolo al 100% e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini in un volume fresco di etanolo al 100% e incubare per altri 5 minuti a temperatura ambiente.
    4. Trasferire i vetrini in etanolo al 95% e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini in un volume fresco di etanolo al 95% e incubare per altri 5 minuti a temperatura ambiente.
    5. Trasferire i vetrini in etanolo al 70% e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferire al 50% di etanolo e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
    6. Trasferire i vetrini in acqua distillata e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
    7. Colorare i vetrini immergendoli nell'ematossilina per 5 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare con acqua corrente per 1-2 min. Differenziare immergendo i vetrini 2-5 volte in acido cloridrico allo 0,5% in etanolo al 70%. Risciacquare a bagnomaria corrente per 1-2 minuti. Immergere i vetrini in etanolo al 95% con acido acetico allo 0,5% per 10 s.
    8. Colorare i vetrini con eosina-Y per 30 s a temperatura ambiente e poi trasferire i vetrini in etanolo al 100% per 5 min. Pulire i campioni in un solvente a base di d-limonene per 5 minuti.
    9. Montare i vetrini coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene mentre il vetrino è ancora bagnato con il solvente a base di d-limonene. Lasciare indurire il mezzo di montaggio durante la notte.
      NOTA : Non utilizzare un mezzo di montaggio a base d'acqua.
  3. Preparare i tessuti senza tumori grossolanamente visibili per identificare i neurofibromi plessiformi e i micro-MPNST. Incorporare i tessuti in paraffina, preparare sezioni istologiche e colorare queste sezioni con ematossilina ed eosina.
    1. Rimuovere gli organi interni e incorporare porzioni rappresentative di ciascun organo nella paraffina per preparare sezioni colorate con H&E che verranno esaminate per l'evidenza microscopica di tumori (Figura 1B). Rimuovere la testa, gli arti anteriori, gli arti posteriori e la coda (Figura 1C). Esaminare il midollo spinale e le radici nervose in situ per l'evidenza di tumori delle radici nervose, decalcificare la colonna vertebrale e le costole associate e i tessuti molli mediante immersione in EDTA/4% paraformaldeide 0,3 M (pH 8,0) per 48-72 ore a 4 oC; quindi, risciacquare i campioni con 1x PBS. Al termine della decalcificazione, assicurarsi che la decalcificazione sia completa tentando di perforare la colonna vertebrale con un ago. La decalcificazione ha successo se l'ago penetra facilmente nell'osso senza scricchiolare.
    2. Tagliare la colonna vertebrale decalcificata e le strutture associate in blocchi che si adattino a una cassetta di tessuto. Disidratare mediante etanoli graduati seguiti da un solvente a base di d-limonene come descritto nei passaggi 2.1.2-2.1.7. Incorporare nella paraffina e preparare sezioni di 4-5 μm come descritto nei passaggi 2.1.7-2.2.1. Eseguire le colorazioni H&E come descritto nei passaggi 2.2.2-2.2.9; Lasciare indurire il mezzo di montaggio durante la notte.

3. Identificare potenziali neurofibromi plessiformi ed eseguire colorazioni speciali per confermare le diagnosi

NOTA: Si consiglia vivamente di includere un patologo umano o veterinario esperto nella valutazione dell'H&E e delle colorazioni speciali delle sezioni tumorali GEM.

  1. Esaminare i vetrini colorati con H&E preparati come descritto sopra utilizzando la microscopia in campo chiaro per identificare potenziali tumori della guaina nervosa periferica. Poiché i neurofibromi e gli MPNST insorgono all'interno dei nervi periferici, è importante determinare se i tumori microscopici sono associati a un nervo periferico. Identificare i blocchi con potenziali tumori della guaina nervosa periferica in modo che le immunocolorazioni e altre colorazioni speciali possano essere eseguite per confermare o confutare le diagnosi.
  2. Distinguere i potenziali PN dalle MPNST/altre neoplasie di alto grado in base alle caratteristiche istologiche osservate durante l'esame in campo chiaro delle sezioni colorate con H&E. Le PN umane sono neoplasie lievemente ipercellulari composte prevalentemente da cellule con nuclei allungati, spesso ondulati. In molte aree, le cellule sono debolmente impacchettate e possono essere separate da materiale extracellulare mixoide; I PN nei topi P 0-GGFβ3 hanno un aspetto simile. Le mitosi in genere non sono presenti; se lo sono e il tumore è da moderatamente a altamente ipercellulare, il tumore è un MPNST o un altro tipo di neoplasia di alto grado (vedi sotto).
  3. I PN sono composti da una miscela di cellule di Schwann neoplastiche e altri tipi di cellule non neoplastiche come i mastociti. Per confermare l'identità di un PN, eseguire immunocolorazioni per i marcatori delle cellule di Schwann S100β e Sox10 e il marcatore dei mastociti CD117 (c-Kit) su sezioni di blocchi contenenti potenziali PN identificati all'esame H&E (vedere paragrafo 3.4 per opzioni alternative di colorazione dei marcatori dei mastociti). Eseguire immunocolorazioni Ki67 per confermare bassi tassi di proliferazione.
    NOTA: La Tabella 1 elenca i marcatori antigenici utilizzati per l'identificazione di routine dei neurofibromi plessiformi GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), la diagnosi di MPNST e per una valutazione completa di altri tipi di cellule presenti nei neurofibromi; coloriamo questi ultimi antigeni solo quando descriviamo per la prima volta un nuovo modello GEM. Consultare la scheda tecnica del produttore dell'anticorpo per le condizioni consigliate. Notare se il foglietto illustrativo del produttore dell'anticorpo raccomanda il recupero dell'antigene; Non tutti gli antigeni richiedono il recupero per essere rilevabili.
    1. Preparare sezioni di 4-5 μm dai blocchi di paraffina selezionati e montarli su vetrini caricati positivamente. Deparaffinizzare le sezioni come descritto nei passaggi 2.2.2-2.2.6.
    2. Risciacquare le sezioni con 1x PBS per 3-5 min.
    3. Se il produttore dell'anticorpo raccomanda il recupero dell'antigene, preparare un tampone citrato. Combinare 9 mL di soluzione di acido citrico (10,5 g di acido citrico in 500 mL di acqua distillata) e 41 mL di soluzione di citrato di sodio (14,7 g di citrato di sodio in 500 mL di acqua distillata).
    4. Eseguire il recupero dell'antigene posizionando i vetrini in un tampone citrato per 20 minuti in un cuociriso riscaldato.
    5. Trasferire i vetrini in perossido di idrogeno al 3%/1x PBS per 10 minuti per eliminare l'attività della perossidasi nel tessuto.
      NOTA: Rendere questa soluzione fresca ogni volta e non utilizzare la soluzione madre di perossido di idrogeno se è più vecchia di 3-4 mesi.
    6. Risciacquare le sezioni in 1x PBS.
    7. Bloccare le sezioni utilizzando il buffer di blocco (2% BSA, 0,1% Triton X-100 in 1x PBS) per 1 ora. Sciacquare brevemente i vetrini in PBS 1x.
    8. Aggiungere l'anticorpo primario alle sezioni di tessuto. Preparare gli anticorpi primari in tampone bloccante diluito. Incubare i vetrini per 2 ore a 37 °C o per una notte a 4 °C.
    9. Lavare i vetrini in PBS 1x per 5 min. Ripetere 3 volte.
    10. Incubare il tessuto con anticorpi secondari biotinilati per 1-2 ore.
    11. Preparare la soluzione di diaminobenzidina (DAB) in base al protocollo del produttore e immergere i vetrini nella soluzione per 2-10 minuti. Lavare i vetrini in acqua per 5 min.
    12. Controcolorare le sezioni immergendole nell'ematossilina per 10-15 minuti. Esporre all'acqua corrente fino a quando non diventa limpido. Immergere rapidamente i vetrini nell'alcool e sciacquarli in acqua.
    13. Disidratare i vetrini in etanoli graduati immergendo rapidamente i vetrini, 4-5 volte per soluzione, in etanolo al 70%, etanolo al 95% e poi etanolo al 100%. Incubare i vetrini in un solvente a base di d-limonene per 2 min. Incubare i vetrini in un secondo lotto di solvente a base di d-limonene per 2 minuti.
    14. Montare le guide con un mezzo di montaggio a base di xilene.
    15. Esaminare i vetrini mediante microscopia in campo chiaro.
    16. Per l'immunofluorescenza, omettere i passaggi 3.3.10-3.3.15. Invece, incubare il tessuto con l'anticorpo secondario specie-specifico diluito in tampone bloccante per 1-2 ore.
    17. Sciacquare i vetrini in 1x PBS per 5 min. Ripetere 3 volte.
    18. Montare i vetrini utilizzando 1x PBS/glicerolo.
    19. Esaminare i vetrini utilizzando la microscopia a fluorescenza.
  4. Metodo alternativo per colorare i mastociti: colorazione con blu di toluidina
    1. Preparare la soluzione madre blu di toluidina sciogliendo 1 g di blu di toluidina O in 100 mL di etanolo al 70%.
    2. Preparare una soluzione di cloruro di sodio (NaCl) all'1% sciogliendo 0,5 g di NaCl in 50 mL di acqua distillata. Mescolare per sciogliere. Regolare il pH a circa 2,0-2,5 utilizzando HCl.
      NOTA: Questa soluzione di NaCl deve essere resa fresca ogni volta che vengono eseguite le colorazioni.
    3. Preparare la soluzione di lavoro blu di toluidina aggiungendo 5 mL di soluzione madre blu di toluidina a 45 mL di soluzione di NaCl all'1%. Mescolare bene e assicurarsi che il pH sia di circa 2,3.
      NOTA: Un pH superiore a 2,5 comporterà una colorazione con meno metacromasia. Rendere questa soluzione fresca ogni volta che viene eseguita la colorazione.
    4. Deparaffinizzare sezioni da 4-5 μm montate su vetrini caricati positivamente come descritto nei passaggi 2.2.2-2.2.6. Lavare le sezioni deparaffinate in acqua corrente per 2 min.
    5. Colorare le sezioni in soluzione di lavoro blu di toluidina per 2-3 min. Lavare in acqua distillata per 2 min.
    6. Disidratare le sezioni immergendole 10 volte in etanolo al 95%. Immergere i vetrini in etanolo al 100% 10x. Immergere i vetrini in etanolo fresco al 100% altre 10 volte.
    7. Incubare i vetrini in un solvente a base di d-limonene per 2 min. Incubare i vetrini in un secondo lotto di solvente a base di d-limonene per 2 minuti.
    8. Montare i vetrini coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene mentre il vetrino è ancora bagnato con un solvente a base di d-limonene.
      NOTA : Non utilizzare un mezzo di montaggio a base d'acqua.
    9. Esaminare i vetrini mediante microscopia in campo chiaro. Identifica i mastociti dalla presenza di granuli viola scuro nel loro citoplasma. Altri tipi di cellule sono colorati di azzurro.

4. Colorazioni speciali per diagnosticare MPNST ed escludere diagnosi alternative

  1. L'aspetto istologico delle MPNST umane è molto variabile e diversi tipi di tumore hanno un aspetto simile a quello delle MPNST28. Poiché le MPNST derivano dalla linea cellulare di Schwann, determinare se il tumore deriva da un nervo periferico o all'interno di una PN benigna esistente mediante esame macroscopico o esame microscopico in campo chiaro di sezioni colorate con H&E. Sebbene le MPNST non siano occasionalmente in associazione con un nervo periferico o PN (di solito a causa della separazione involontaria dal nervo durante la dissezione, distruzione della PN preesistente tramite crescita eccessiva di MPNST o perché la lesione è metastatica), cercare l'associazione del tumore con un nervo o PN poiché la diagnosi è meno probabile se il tumore non è associato a un nervo o PN.
  2. Preparare sezioni di 4-5 μm da blocchi di paraffina contenenti potenziali MPNST e montarle su vetrini caricati positivamente come descritto al punto 2.2.1. Deparaffinizzare le sezioni come descritto nei passaggi 2.2.2-2.2.6.
  3. Eseguire l'immunoistochimica con il pannello di anticorpi indicato nella Tabella 2 come descritto nei passaggi 3.3.1-3.3.15.
  4. Esaminare le immunocolorazioni mediante microscopia in campo chiaro. Poiché le MPNST dimostrano una differenziazione schwanniana, cercare un'immunoreattività uniforme o irregolare per S100β, nestina e Sox10. Se i tumori non sono positivi per questi tre marcatori, fare riferimento alla Tabella 2 per stabilire la diagnosi.
    NOTA: Gli MPNST umani e murini possono dimostrare una differenziazione divergente. Ad esempio, alcuni MPNST umani dimostrano una differenziazione rabdomioblastica focale (queste varianti sono note come tumori tritoni maligni); sebbene queste neoplasie si colorino per i marcatori schwanniani, esprimono anche marcatori muscolari come desmina, MyoD1 e miogenina. L'immunoreattività per questi ultimi marcatori non dovrebbe dissuadere i ricercatori dal diagnosticare il tumore come MPNST. Sebbene siano stati stabiliti diversi modelli murini che esprimono condizionatamente il gene di fusione SS18-SSX per modellare la patogenesi del sarcoma sinoviale29, per quanto ne sappiamo, non sono noti modelli di sarcoma sinoviale che generano spontaneamente il trascritto di fusione equivalente. Di conseguenza, non cerchiamo trascritti di fusione SS18-SSX nei tumori GEM e ci affidiamo invece ai profili immunoistochimici.

5. Classificazione degli MPNST

  1. Determinare se è presente necrosi tumorale, un segno distintivo delle MPNST di grado IV dell'OMS. Per le MPNST di grado IV, cercare l'ipercellularità prominente, l'attività mitotica vivace (≥4 mitosi per 10 campi ad alta potenza (40x)) e l'atipia citologica.
    1. Se la necrosi non è presente, valutare il tumore per determinare se sono presenti ipercellularità, attività mitotica vivace e atipia citologica. Se queste caratteristiche sono tutte presenti in assenza di necrosi, classificare il tumore come MPNST di grado III dell'OMS.
    2. I tumori di grado II dell'OMS sono caratterizzati da una cellularità aumentata, ma in misura minore rispetto agli MPNST di grado III e IV dell'OMS. I nuclei delle cellule tumorali in un MPNST di grado II dell'OMS dimostrano un aumento delle dimensioni (più di 3 volte le dimensioni dei nuclei delle cellule tumorali nei neurofibromi) e dell'ipercromia. L'aumento dell'attività mitotica (<4 mitosi per 10 campi ad alta potenza) è associato, ma non un requisito per, i tumori di grado II dell'OMS.
      NOTA: Poiché i tumori di grado superiore in genere progrediscono da gradi inferiori, le regioni di basso grado e di alto grado possono essere presenti nello stesso MPNST. In questa circostanza, il grado del tumore è determinato dalla regione di grado più alto presente.
      NOTA: C'è controversia tra i patologi umani sul fatto che il sistema di classificazione dell'OMS sopra descritto sia predittivo degli esiti dei pazienti e alcuni di questi patologi preferiscono invece classificare semplicemente gli MPNST come di basso grado o di alto grado. In base a questo schema, le MPNST di alto grado hanno un'atipia citologica prominente, un'attività mitotica vivace (>5 mitosi per 10 campi ad alta potenza) e una marcata ipercellularità con o senza necrosi. Le MPNST di basso grado mancano di necrosi ma mostrano attività mitotica, atipia citologica e cellularità intermedia tra una MPNST di alto grado e una neoplasia neurofibromatosa atipica con potenziale biologico sconosciuto (ANNUBP). Preferiamo il sistema sopra descritto perché distinguere tra un ANNUBP e un MPNST di basso grado può essere difficile per gli investigatori che non hanno una lunga esperienza con queste entità.

6. Preparazione di colture dicellule MPNST P 0-GGFβ3 di passaggio precoce

  1. Coltura di cellule tumorali P 0-GGFβ3 a passaggio precoce da un tumore fresco 2 (fase 1.5, Figura 1A). Mantenere le condizioni sterili da questo punto in poi.
    1. Dissociare il tumore tagliandolo in piccoli pezzi (2-4 mm) e tritandolo in DMEM10 (il terreno essenziale minimo di Dulbecco) contenente il 10% di siero fetale di vitello, 2 μmol/L di forskolina e 10 nmol/L di neuregulina 1β (NRG1β) in piastre di coltura tissutale da 100 mm.
    2. Lasciare che le cellule crescano dai frammenti di tessuto tritato a 37 oC al 5% di CO2 fino a quando le piastre non sono confluenti. Cambiare supporto ogni 3-4 giorni.
    3. Dividere la coltura cellulare. Rimuovere il supporto dal piatto da 100 mm e lavare le celle con PBS; Rimuovere ed eliminare il tessuto tritato. Rimuovere il PBS e aggiungere 1 ml di tripsina allo 0,25% per 2-5 minuti a temperatura ambiente. Per favorire il distacco cellulare, picchiettare delicatamente la piastra e verificare il distacco utilizzando un microscopio ottico; Prolungare l'incubazione della tripsina secondo necessità.
    4. Neutralizza la tripsina aggiungendo 2 mL di DMEM10. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga e le celle di pellet a 500 × g per 5 minuti. Rimuovere il terreno e aggiungere 5 mL di DMEM10 fresco al pellet.
    5. Distribuire la sospensione cellulare in due o quattro piastre da 100 mm contenenti DMEM10. Non dividere le cellule per più di cinque passaggi (passaggi 6.1.3 e 6.1.4) e mantenerle in DMEM senza forskolina e NRG1β. Ricordarsi di congelare le celle al passaggio 2 per un uso futuro.

7. Verifica dell'identità delle cellule MPNST di passaggio precoce mediante immunocitochimica

  1. Posizionare vetrini coprioggetti rotondi sterili da 18 mm #1,5 nei pozzetti delle piastre sterili per coltura di tessuti a 6 pozzetti.
    1. Versare la soluzione di poli-L-lisina/laminina nei pozzetti in un volume sufficiente a coprire il vetrino coprioggetto. Sigillare la piastra con pellicola trasparente per ridurre al minimo l'evaporazione. Incubare a 4 °C per una notte. La mattina successiva, lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con PBS sterile.
      NOTA: Abbiamo tentato di placcare le cellule MPNST a passaggio precoce su vetrini coprioggetti non rivestiti e abbiamo scoperto che le cellule non aderiscono bene in assenza di rivestimento in poli-L-lisina/laminina.
    2. Placcare 10.000 cellule sul vetrino coprioggetto aggiungendo delicatamente 2 ml di sospensione cellulare in terreno di coltura in ciascun pozzetto contenente il vetrino coprioggetto. Incubare le piastre per una notte a 37 °C con il 5% di CO2 in un incubatore per colture tissutali.
    3. La mattina successiva, sciacquare i vetrini coprioggetti per 2 x 5 minuti con PBS.
    4. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS per 18 minuti a temperatura ambiente.
    5. Risciacquare i vetrini coprioggetti 3 x 5 minuti con PBS. Se lo si desidera, sigillare la piastra con pellicola di plastica e conservarla a 4 °C a questo punto.
    6. Preparare 50 mM NH4Cl freschi in PBS. Estinguere le aldeidi incubando vetrini coprioggetti in 50 mM NH4Cl in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
    7. Permeabilizzare le cellule incubando vetrini coprioggetti in Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini coprioggetti per 3 x 5 minuti con PBS.
    8. Bloccare il legame non specifico incubando i vetrini coprioggetti in tampone bloccante (1x PBS contenente l'1% di albumina sierica bovina, lo 0,2% di latte scremato in polvere e lo 0,3% di Triton X-100) per 1 ora a temperatura ambiente.
    9. Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere anticorpi primari che riconoscono i marcatori MPNST presenti nel tumore genitore (tipicamente S100β, Nestin e Sox10) diluiti alla diluizione ottimale predeterminata nel tampone bloccante. Avvolgere la piastra con pellicola di plastica e incubare a 4 °C per una notte in una camera umidificata.
    10. Lavare 3 x 5 minuti con PBS per rimuovere l'anticorpo primario non legato. Aggiungere l'anticorpo secondario marcato con fluorescenza diluito in tampone bloccante e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Proteggere dalla luce.
    11. Lavare 3 x 5 min con PBS. Incubare i vetrini coprioggetti in 1-5 μg di colorante Hoechst per 10 min. Continuare a proteggere dalla luce.
    12. Lavare i vetrini coprioggetti con PBS per 5 min. Montare i vetrini utilizzando PBS/glicerolo 1:1 1x. Immagine con un microscopio a fluorescenza.

8. Allotrapianto di cellule tumorali di passaggio precoce per dimostrare la tumorigenicità

  1. Far crescere cellule MPNST P 0-GGFβ3 a passaggio precoce in confluenza DMEM10 all'80%. Sciacquare le cellule una volta con la soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hanks a temperatura ambiente. Trattare le cellule per 30 secondi a 1 minuto con una soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica per rimuoverle dal substrato. Aggiungere 5 mL di DMEM10 per 1 mL di un reagente di dissociazione cellulare non enzimatico.
    NOTA: La dissociazione cellulare può richiedere molto più tempo, fino a 10-20 minuti. Si prega di fare riferimento al protocollo del produttore.
    NOTA: Non far crescere le cellule fino alla confluenza in quanto ciò ridurrà l'efficacia dell'innesto.
    1. Conta le cellule usando un emocitometro. Centrifugare le cellule a 5 × g per 5 minuti e risospenderle a una concentrazione di 1-2 × 106 cellule per 100 μL di DMEM10. Tenere le cellule sul ghiaccio fino al momento dell'iniezione.
    2. Anestetizzare topi NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) nella camera di induzione di un vaporizzatore di isoflurano. Posizionare l'animale a pancia in giù e sterilizzare il sito di iniezione con etanolo al 70%. Lasciare asciugare il sito all'aria prima dell'iniezione. Prima dell'iniezione, lasciare che le cellule raggiungano la temperatura ambiente.
    3. Iniettare 1-2 x 106 cellule per via sottocutanea nel fianco destro. Metti il topo da solo in una gabbia senza lettiera e lascialo riprendere. Assicurarsi che solo una parte della gabbia sia su un termoforo per evitare l'ipotermia. In questo modo si ottiene una zona in cui il mouse può spostarsi in caso di surriscaldamento.
      NOTA: Innestiamo un minimo di tre topi con ogni coltura di passaggio precoce poiché alcuni innesti potrebbero non prendere.
    4. Lasciare crescere l'innesto per 15-60 giorni; Valuta la salute degli animali 3 volte alla settimana e registra i punteggi delle condizioni corporee, inclusi il peso e i cambiamenti comportamentali ad ogni esame. Terminare i topi che hanno raggiunto la dimensione massima consentita dell'innesto o i topi moribondi utilizzando l'eutanasia con anidride carbonica seguita da lussazione cervicale. Record di età alla morte in giorni. Man mano che i tumori diventano visibili esternamente, registrare le dimensioni del tumore (lunghezza, larghezza e altezza).
      NOTA: In base alla nostra esperienza, diverse colture MPNST di passaggio precoce si innestano con efficienza variabile e differiscono nel tempo necessario per la crescita dell'innesto. Agli animali non deve essere consentito di procedere oltre la dimensione massima consentita del tumore approvata dalla IACUC e/o l'endpoint umano.
  2. Prelevare il tumore, fissarlo in paraformaldeide al 4%, incorporarlo in paraffina ed eseguire le colorazioni H&E come descritto nei paragrafi 2.1-2.2.9 per verificare che l'allotrapianto sia un tumore piuttosto che un tessuto reattivo. Se necessario, immunocolorare l'innesto per i marcatori che erano presenti nel tumore genitore.

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Risultati

La Figura 2 illustra esempi di neoplasie grossolanamente evidenti che insorgono in topi P 0-GGFβ3. I tumori che sono facilmente identificabili ad occhio nudo possono essere visti come masse che distendono le regioni del corpo, come mostrato nella Figura 2A (freccia). Quando si determina se la neoplasia è potenzialmente un tumore della guaina dei nervi periferici, è essenziale stabilire che il tumore è associato a un nervo periferico. In questo caso, u...

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Discussione

I metodi istologici e biochimici qui presentati forniscono un quadro di riferimento per la diagnosi e la caratterizzazione di modelli GEM di neurofibroma e patogenesi MPNST. Nel corso degli anni, abbiamo trovato queste metodologie molto utili per valutare la patologia dei tumori della guaina nervosa periferica che insorgono nei modelli GEM 21,25,26. Tuttavia, mentre i protocolli qui delineati sono utili per determinare l'accurat...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 e R01 NS109655 a S.L.C.; R01 NS109655-03S1 a D.P.J.), il National Cancer Institute (R01 CA122804 a S.L.C.) e il Dipartimento della Difesa (X81XWH-09-1-0086 e W81XWH-12-1-0164 a S.L.C.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastre per colture tissutali da 100 mm CorningFalcon353003
3, 3'- Diaminobensidina (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
Piastre a 6 pozzettiCorning Costar3516
Acido aceticoFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondario (Capra Anti-Topo)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondario (Capra Anti-Topo)InvitrogenA21043 o A11004
Alexa Fluor 568 Secondario (Capra Anti-Coniglio)InvitrogenA11036
Cloruro di ammonio (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
Kit per il dosaggio delle proteine BCAThermo Scientific23225
Albuminasierica bovinaFisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAM E89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAM ab29364
CD34ABCAM ab81289
CD86ABCAM ab53004
Raschietto cellulareSarstedt83.183
Spogliarellistacellulare Corning25-056-CI
Coprioggettocircolare Fisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (solvente a base di d-limonene)Decon Laboratories5989-27-5
Acido criticoFisher ScientificA104-500
CitocheratinaABCAMC-11, ab7753
DesminAgilent Dako clone D33 (M0760)
Diaminobensizdina (DAB) SoluzioneVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosin YThermo Scientific7111
Etanolo (200 Proof)Decon Laboratories2716
Siero fetale di vitelloOmega ScientificFB-01
ForksolinSigma-AldrichF6886
GliceroloSigma-AldrichG6279
salina bilanciata di Hank (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylinFisherbrand245-677
EmatocitometroBrightline-Hauser Scientific1490
Acido cloridricoFisher ScientificA144-212
Perossido di idrogenoFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
Kit di polimeri ImmPRESS HRP (perossidasi), mouse su mouseVector LaboratoriesMP-2400
Kit di polimeri ImmPRESS HRP (perossidasi), Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatoreThermo ScientificHeracell 240i Incubatore
IsofluranoPiramalNDC 66794-017-25
IsopropanoloFisher ScientificA415
Ki-67Segnalazione cellulare 12202
LamininThermo Fisher Scientific23017015
Azoto
MART1ABCAM M2-9E3, ab187369
Microtomo
NestinaMilliporo Umano: MAD5236 (10C2), Umano: MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 betaRealizzato internamenteda S.L.C. (disponibile anche come 396-HB-050/CF da R& Sistemi D)Neurofibromina
Santa Cruz Biotecnologia sc-67
NODO. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ topiJackson Laboratory5557
Latte in polvere scrematoWalmartMarchio
P0-GGFβ 3 topiCera
Paraplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldeide (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (mezzo di montaggio xilene)PHmetro Fisher ScientificSP15-100
Mettler ToldedoSeven Excellence, 8603
Soluzione salina tamponata con fosfato (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAM EP4863(2), ab137078
Bromidrato di poli-L-lisinaSigma-AldrichP5899-5MG
Macchina portatile per isofluranzaanestesia per inalazione
PVA-DABCO (mezzo di montaggio acquoso)Millipore Sigma10981100ML
CuocirisoFaggio Hamilton
S100BAgilent Dako Z0311  (ora GA504)
SMAVentana Medical Systems clone 1A4
Cloruro di SodioFisher ScientificS640
Citrato di Sodio (Diidrato)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAM ab212843
per istologia in acciaio
Superfrost Plus Vetrini per microscopioFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2 Segnalazione cellulare (CH48H11) #2569
tissutale
Toluidina BluACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzolInvitrogen15596026
TripsinaCorning25-051-31
Soluzione a CO2Liquidodi grande valore di paraffina Leica VetEquip Sistemi di Stampo Cassetta

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