Identificazione, diagnosi e classificazione dei tumori maligni della guaina dei nervi periferici in modelli murini geneticamente modificati

Summary

Abbiamo sviluppato una metodologia per valutare se le neoplasie del sistema nervoso nei topi geneticamente modificati ricapitolano accuratamente la patologia delle loro controparti umane. Qui, applichiamo queste tecniche istologiche, i criteri patologici definiti e le metodologie di coltura ai neurofibromi e ai tumori maligni della guaina dei nervi periferici che insorgono nel modello murino P 0-GGFβ3.

Abstract

I pazienti con la sindrome da suscettibilità al tumore autosomico dominante neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) sviluppano comunemente neurofibromi plessiformi (PN) che successivamente si trasformano in tumori maligni altamente aggressivi della guaina dei nervi periferici (MPNST). La comprensione del processo attraverso il quale un PN si trasforma in un MPNST sarebbe facilitata dalla disponibilità di modelli murini geneticamente modificati (GEM) che replicano accuratamente la progressione PN-MPNST osservata negli esseri umani con NF1. Sfortunatamente, i modelli GEM con ablazione di Nf1 non ricapitolano completamente questo processo. Questo ci ha portato a sviluppare topi P 0-GGFβ3, un modello GEM in cui la sovraespressione del mitogeno delle cellule di Schwann neuregulin-1 (NRG1) nelle cellule di Schwann provoca lo sviluppo di PN che progrediscono fino a diventare MPNST ad alta frequenza. Tuttavia, per determinare se la tumorigenesi e la progressione neoplastica nei topi P 0-GGFβ3 modellano accuratamente i processi osservati nei pazienti NF1, abbiamo dovuto prima dimostrare che la patologia dei tumori della guaina nervosa periferica P_0-GGFβ3 ricapitola la patologia delle loro controparti umane.

In questo articolo, descriviamo le metodologie specializzate utilizzate per diagnosticare e classificare accuratamente le neoplasie del sistema nervoso periferico in modelli GEM, utilizzando P 0-GGFβ3 e P_0-GGFβ3; Trp53^+/- topi come esempio. Descriviamo i metodi istologici, immunoistochimici e istochimici utilizzati per diagnosticare PN e MPNST, come distinguere queste neoplasie da altri tipi di tumore che ne imitano la patologia e come classificare queste neoplasie. Discutiamo la creazione di colture di passaggio precoce da MPNST GEM, come caratterizzare queste colture utilizzando l'immunocitochimica e come verificare la loro tumorigenicità stabilendo allotrapianti. Collettivamente, queste tecniche caratterizzano la patologia dei PN e degli MPNST che insorgono nei modelli GEM e confrontano criticamente la patologia di questi tumori murini con le loro controparti umane.

Introduction

Negli ultimi tre decenni, numerosi laboratori hanno tentato di creare modelli murini di tumori umani introducendo mutazioni associate al cancro umano nel genoma del topo o sovraesprimendo un prodotto genico che è sovraespresso nei tumori umani. I modelli murini geneticamente modificati (GEM) risultanti possono essere utilizzati per una varietà di scopi, come stabilire che la modifica genomica di nuova introduzione avvia la tumorigenesi, identificare altri cambiamenti genetici o epigenetici che si verificano successivamente che contribuiscono alla progressione del tumore e definire le vie di segnalazione chiave che guidano l'inizio e la progressione del tumore. A differenza dei modelli di xenotrapianto ortotopico, che si basano sull'uso di topi immunodeficienti, i modelli di cancro GEM hanno un sistema immunitario completamente funzionale e quindi modellano in modo più accurato le risposte agli agenti terapeutici candidati. Tuttavia, quando si utilizzano modelli di cancro GEM per scopi come questi, è essenziale che i ricercatori confermino che le osservazioni fatte con le neoplasie GEM sono rilevanti per le loro controparti umane. Tale convalida deve includere una valutazione approfondita della patologia delle neoplasie GEM e la determinazione se le caratteristiche patologiche delle neoplasie GEM ricapitolano la patologia del corrispondente tipo di tumore umano.

La sindrome da suscettibilità al tumore neurofibromatosi di tipo 1 (NF1) è la malattia genetica più comune che colpisce il sistema nervoso umano, che si verifica in circa 1 ogni 3.000-3.500 nati vivi ^1,2,3. Gli individui affetti da NF1 sviluppano tumori multipli benigni della guaina nervosa periferica noti come neurofibromi nella pelle (neurofibromi dermici) e nei grandi nervi e plessi nervosi (neurofibromi plessiformi). Mentre sia i neurofibromi cutanei che quelli plessiformi peggiorano la qualità della vita del paziente producendo compromissione fisica, comportamentale e/o sociale, i neurofibromi plessiformi (PN) sono particolarmente pericolosi ^4,5. Ciò è dovuto al fatto che i PN si trasformano spesso in tumori maligni della guaina dei nervi periferici (MPNST), che sono neoplasie aggressive a cellule fusiformi con un tasso di sopravvivenza eccezionalmente basso ^1,2. In gran parte, questo basso tasso di sopravvivenza è dovuto al fatto che i regimi radioterapici e chemioterapici attualmente utilizzati per trattare le MPNST sono inefficaci. Tuttavia, lo sviluppo di nuove terapie più efficaci è stato impegnativo. Questo perché, nonostante la frequenza con cui le MPNST si verificano nei pazienti NF1, si tratta comunque di neoplasie rare. Di conseguenza, è molto difficile ottenere un gran numero di tumori umani da studiare; è anche difficile reclutare un numero sufficiente di pazienti con MPNST per gli studi clinici. Per superare queste limitazioni, sono stati generati diversi modelli GEM con l'obiettivo di ottenere ulteriori informazioni sulle anomalie che guidano la patogenesi del neurofibroma e la progressione del PN-MPNST e di facilitare gli studi preclinici con agenti terapeutici candidati.

I pazienti affetti da NF1 presentano mutazioni inattivanti in una copia del gene NF1. La patogenesi del neurofibroma si innesca quando si verifica una mutazione inattivante nel gene NF1 funzionale rimanente in una cellula della linea cellulare di Schwann. Sorprendentemente, tuttavia, quando i topi sono stati generati con mutazioni Nf1 inattivanti la linea germinale, non hanno sviluppato neurofibromi ^6,7. La successiva dimostrazione che topi con cellule di Schwann Nf1-null e aploinsufficienza di Nf1 in tutti gli altri tipi cellulari (Krox20-Cre;Nf1^flox/- topi) hanno sviluppato neurofibromi plessiformi hanno suggerito che per la patogenesi del neurofibroma⁸ era necessario un dosaggio ridotto del gene Nf1 in altri tipi di cellule. Anche allora, i neurofibromi plessiformi in Krox20-Cre; I topi ^flox/- Nf1 non sono progrediti fino a diventare MPNST e quindi hanno imitato solo parzialmente la biologia delle loro controparti umane. La patogenesi delle MPNST si è verificata quando le mutazioni di Nf1 sono state associate a mutazioni in altri geni oncosoppressori come Trp53⁹ o Cdkn2a¹⁰, ma le MPNST in questi modelli GEM si sono sviluppate de novo o da neoplasie neurofibromatiche atipiche a potenziale biologico incerto (ANNUBPs)^11,12, piuttosto che da neurofibromi plessiformi benigni preesistenti (vedi^13,14 per eccellenti revisioni di questi modelli e di altri modelli che introducono ulteriori mutazioni con perdita di funzione associate a MPNST in geni come Suz12 e Pten¹⁵).

Questi modelli murini sono stati preziosi per stabilire il ruolo che geni come NF1, TP53 e CDKN2A svolgono nella patogenesi delle neoplasie del sistema nervoso periferico associate a NF1 e per studi preclinici che testano agenti terapeutici candidati. Tuttavia, abbiamo ancora una comprensione incompleta del processo attraverso il quale i neurofibromi plessiformi progrediscono fino a diventare neoplasie neurofibromatiche atipiche di potenziale biologico incerto (ANNUBPs¹⁶) e quindi MPNST. Recentemente sono stati compiuti alcuni progressi nella comprensione di questo processo con il recente rapporto secondo cui i topi con delezioni in Nf1 e Arf sviluppano ANNUBP che progrediscono fino a diventare MPNST¹¹. Tuttavia, non esistono ancora modelli murini basati sulla mutazione di Nf1 che ricapitolano completamente il processo di progressione del neurofibroma plessiforme-MPNST osservato nell'uomo. Inoltre, non è chiaro se esistano più percorsi distinti che portano allo sviluppo di MPNST. Alla luce di ciò, è possibile che i GEM sopra descritti modellino solo un sottoinsieme di diversi percorsi che portano alla progressione del neurofibroma-MPNST e alla patogenesi del MPNST. Questo punto è enfatizzato dal fatto che le MPNST si verificano anche sporadicamente e che alcune MPNST sporadiche apparentemente non hanno mutazioni NF1 ^17,18.

Sebbene quest'ultimo punto sia stato messo in discussione dal recente suggerimento di Magollon-Lorenz et al. secondo cui almeno alcuni MPNST sporadici privi di mutazioni NF1 sono melanomi o un diverso tipo di sarcoma¹⁹, abbiamo recentemente riportato un MPNST sporadico e una linea cellulare derivata da questo tumore (cellule 2XSB) che era NF1 wild-type²⁰. Durante la caratterizzazione del tumore genitore e della linea cellulare 2XSB, abbiamo sistematicamente escluso possibilità diagnostiche alternative, tra cui il melanoma e i molteplici altri tipi di sarcoma che sono considerati di routine nella diagnosi differenziale di un tumore maligno sporadico della guaina dei nervi periferici²⁰. Inoltre, notiamo che Magollon-Lorenz et al. hanno riconosciuto che i loro risultati nelle tre linee cellulari MPNST sporadiche che hanno studiato non potevano essere generalizzati per indicare che tutti i tumori identificati come MPNST sporadici non lo sono.

Per costruire un modello GEM in cui il neurofibroma e la patogenesi di MPNST non dipendessero necessariamente da specifiche mutazioni del gene oncosoppressore, abbiamo generato topi transgenici in cui la sovraespressione del potente mitogeno delle cellule di Schwann neuregulin-1 (NRG1) era guidata dal promotore della proteina mielinica zero (P₀) specifica per le cellule di Schwann (topi P 0-GGFβ3)²¹. Abbiamo precedentemente dimostrato che i neurofibromi umani, gli MPNST e le linee cellulari MPNST esprimono diverse isoforme NRG1 insieme alle tirosin-chinasi del recettore erbB (erbB2, erbB3 e erbB4) che mediano la segnalazione di NRG1 e che questi recettori erbB sono costitutivamente attivati²². Abbiamo anche dimostrato che gli inibitori farmacologici delle chinasi erbB inibiscono potentemente la proliferazione^{MPNST 22}, la sopravvivenza²³ e la migrazione²⁴. In linea con le nostre osservazioni nell'uomo, i topi P 0-GGFβ3 sviluppano neurofibromi plessiformi²⁵ che progrediscono fino a diventare MPNST ad alta frequenza^21,25. Abbiamo dimostrato che le MPNST P 0-GGFβ3, come le loro controparti umane, sviluppano comunemente mutazioni di Trp53 e Cdkn2a, così come numerose altre anomalie genomiche che potenzialmente contribuiscono alla tumorigenesi²⁵. Le MPNST che insorgono nei topi P 0-GGFβ3 non hanno mutazioni inattivanti di Nf1. Tuttavia, utilizzando la complementazione genetica, abbiamo dimostrato che NRG1 promuove la tumorigenesi nei topi P 0-GGFβ3 prevalentemente attraverso le stesse cascate di segnalazione che sono alterate dalla perdita di Nf1 ²⁶; questa conclusione si basa sulla nostra scoperta che la sostituzione della sovraespressione di NRG1 con la perdita di Nf1 in presenza di aploinsufficienza di Trp53 (P 0-GGFβ3;Trp53^+/- topi) produce animali in cui le MPNST si sviluppano de novo, come si vede in cis-Nf1^+/-; Trp53^+/- topi²⁷.

Per ottenere queste e altre informazioni che dimostrino che i topi P 0-GGFβ3 modellano accuratamente i processi di patogenesi del neurofibroma e della progressione del neurofibroma-MPNST osservati nell'uomo con NF1, abbiamo sviluppato metodologie specializzate per l'elaborazione dei tessuti di questi animali, la diagnosi accurata dei loro tumori, la classificazione delle MPNST che insorgono in questi topi, la determinazione e la caratterizzazione di P_0-GGFβ3 e P_0-GGFβ3 a passaggio precoce; colture di Trp53^+/- MPNST e confronto critico della patologia di P 0-GGFβ3 PNs e MPNSTs e P 0-GGFβ3; Trp53^+/- MPNST a quello delle loro controparti umane. Molte di queste metodologie sono generalizzabili ad altri modelli GEM di neoplasia del sistema nervoso. Inoltre, molte di queste metodologie sono più ampiamente applicabili a modelli GEM in cui le neoplasie insorgono in altre sedi d'organo. Di conseguenza, qui presentiamo una descrizione dettagliata di queste metodologie.

Protocol

Le procedure qui descritte sono state approvate dall'IACUC dell'Università di Medicina della Carolina del Sud e sono state eseguite da personale adeguatamente addestrato in conformità con la Guida NIH per la cura e l'uso degli animali da laboratorio e le linee guida istituzionali per la cura degli animali del MUSC.

1. Determinazione della penetranza e della sopravvivenza del tumore nei topi P 0-GGFβ3 e identificazione dei tumori in questi animali per un'ulteriore caratterizzazione

1. Generare la coorte di topi che saranno valutati per la tumorigenesi. Il numero di topi necessari dipende dalla penetranza del fenotipo tumorale. Per compensare perdite come queste, inizia con una coorte superiore del 10-15% rispetto al numero finale di animali desiderato.
   NOTA: Abbiamo determinato empiricamente la penetranza del tumore nei topi P 0-GGFβ3 in una coorte iniziale di 50 topi (sei dei quali sono stati persi per motivi non correlati alla neoplasia (ad esempio, combattimento)⁾²⁵.
2. Valuta la salute degli animali tre volte alla settimana e registra i punteggi delle condizioni corporee, inclusi il peso e i cambiamenti comportamentali ad ogni esame. Terminare topi portatori di tumore o moribondi (vedi nota sotto) utilizzando l'eutanasia con anidride carbonica seguita da lussazione cervicale. Record di età alla morte in giorni. Se i tumori sono visibili esternamente, registrare le dimensioni del tumore (lunghezza, larghezza e altezza).
   NOTA: È essenziale che gli animali non siano autorizzati a procedere oltre la dimensione massima consentita del tumore approvata dalla IACUC e/o l'endpoint umano.
3. Utilizzando l'età alla morte, stabilire una curva di sopravvivenza di Kaplan-Meier per determinare l'età media alla morte e l'intervallo di sopravvivenza.
   NOTA: I topi P 0-GGFβ3 avevano un'età media alla morte di 261,5 giorni, con un intervallo di 74-533 giorni; Il 91% della nostra coorte aveva neurofibromi multipli e il 71% aveva MPNST²¹.
4. Determinare se sono presenti tumori grossolanamente visibili e, in caso affermativo, sezionarli in condizioni sterili per stabilire se il tumore è associato a un nervo periferico e quindi asportare il tumore. In P 0-GGFβ3 e P_0-GGFβ3; Topi Trp53^+/-, i tumori della guaina nervosa periferica si trovano più comunemente nei nervi trigemino e sciatico. Anche se non si osservano tumori grossolanamente visibili in associazione con questi nervi, fissare e incorporare questi nervi come descritto di seguito in modo che possano essere esaminati per la presenza di microtumori. I micro-tumori si verificano tipicamente all'interno dei gangli associati a questi nervi.
5. Tagliare in tre pezzi i tumori grossolanamente visibili (Figura 1A). Utilizzare il pezzo 1 per l'istologia (sezioni di paraffina, immunoistochimica e istochimica). Usa il pezzo 2 per stabilire le culture di primo passaggio. Congelare a scatto il pezzo 3 (utilizzando azoto liquido) per possibili esperimenti futuri (ad esempio, immunoblot, isolamento di RNA e DNA).
6. Fissare il pezzo 1 in paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per una notte a 4 ^oC. Fissare il resto del corpo dell'animale immergendolo in paraformaldeide al 4% per una notte a 4 °C.

2. Inclusione in paraffina di tumori grossolanamente visibili e preparazione di sezioni colorate con ematossilina ed eosina per la valutazione diagnostica iniziale

1. Inclusione di paraffina di tumori grossolanamente visibili
   1. Dopo aver fissato il tumore 1 per una notte in paraformaldeide al 4%, sciacquare il tessuto inserendolo in un volume di PBS almeno 10 volte maggiore del volume del tessuto per 15 min; Utilizzare lo stesso volume per tutti i risciacqui successivi. Ripetere altri due risciacqui PBS da 15 minuti, utilizzando un nuovo volume di PBS per ogni risciacquo.
   2. Trasferire il pezzo tumorale 1 al 70% di etanolo. Tenere il tessuto in etanolo al 70% per 24 ore a 4 °C. Se lo si desidera, conservare il tessuto a lungo termine in queste condizioni.
      NOTA: I passaggi da 2.1.1 a 2.1.7 sono forniti a beneficio degli sperimentatori che non hanno accesso a una macchina commerciale per il trattamento dei tessuti. Se lo sperimentatore ha accesso a un processatore di tessuti, il tessuto verrà processato attraverso etanoli e xileni graduati secondo il protocollo dello strumento programmato.
   3. Trasferire il pezzo di tumore da 1 a etanolo all'80% per 30 minuti a temperatura ambiente. Ripetere l'incubazione per altri 30 minuti in un volume fresco di etanolo all'80%.
   4. Trasferire il pezzo tumorale da 1 a etanolo al 95% per 75 minuti a temperatura ambiente. Ripetere l'incubazione altre due volte, ogni volta per altri 75 minuti in un volume fresco di etanolo al 95%.
   5. Trasferire il pezzo di tumore 1 al 100% di etanolo e incubare per 60 minuti a temperatura ambiente. Ripetere l'incubazione di 60 minuti altre due volte, ogni volta utilizzando un nuovo volume di etanolo al 100%.
   6. Trasferire il pezzo tumorale 1 in un solvente a base di d-limonene e incubare per 30-60 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il pezzo tumorale 1 in un volume fresco di solvente a base di d-limonene e incubare per altri 30-60 minuti a temperatura ambiente.
   7. Trasferire il pezzo tumorale 1 in solvente 1:1 a base di paraffina/d-limonene per 1 ora a 60 ^oC. Scartare il solvente 1:1 a base di paraffina/d-limonene e trasferire il pezzo tumorale da 1 a 60 ^oC di paraffina e incubare per 20 minuti a 60 ^oC. Ripetere l'incubazione in un nuovo volume di paraffina a 60 ^oC ancora una volta per 20 min. Incubare il tumore 1 in paraffina per una notte a 60 ^°C.
   8. Versare uno strato di base di paraffina in uno stampo istologico in acciaio e lasciarlo solidificare. Trasferire il pezzo tumorale 1 sulla superficie della paraffina di base e, subito dopo il posizionamento, coprire il tessuto con paraffina a 60 ^°C e posizionare la cassetta tissutale sopra e a contatto con la paraffina fusa. Trasferire lo stampo sul lato freddo della stazione di inclusione e lasciarlo solidificare per 10-15 minuti.
   9. Rimuovere lo stampo dal blocco di paraffina con la cassetta di tessuto attaccata. Utilizzare la cassetta di tessuto allegata per fissare il blocco al microtomo durante il sezionamento.
      NOTA: Il blocco di paraffina può ora essere conservato a tempo indeterminato a temperatura ambiente.
2. Preparare sezioni colorate con ematossilina ed eosina di tumori grossolanamente visibili.
   1. Tagliare sezioni di tessuto tumorale di 4-5 μm utilizzando un microtomo e montarle su vetrini caricati positivamente.
   2. Per eseguire la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E), deparaffinizzare le sezioni di tessuto incubando i vetrini in un solvente a base di d-limonene per 10 minuti a temperatura ambiente. Ripetere l'incubazione in un nuovo volume di solvente a base di d-limonene per 10 minuti.
   3. Trasferire i vetrini in etanolo al 100% e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini in un volume fresco di etanolo al 100% e incubare per altri 5 minuti a temperatura ambiente.
   4. Trasferire i vetrini in etanolo al 95% e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i vetrini in un volume fresco di etanolo al 95% e incubare per altri 5 minuti a temperatura ambiente.
   5. Trasferire i vetrini in etanolo al 70% e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Quindi, trasferire al 50% di etanolo e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   6. Trasferire i vetrini in acqua distillata e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente.
   7. Colorare i vetrini immergendoli nell'ematossilina per 5 minuti a temperatura ambiente. Risciacquare con acqua corrente per 1-2 min. Differenziare immergendo i vetrini 2-5 volte in acido cloridrico allo 0,5% in etanolo al 70%. Risciacquare a bagnomaria corrente per 1-2 minuti. Immergere i vetrini in etanolo al 95% con acido acetico allo 0,5% per 10 s.
   8. Colorare i vetrini con eosina-Y per 30 s a temperatura ambiente e poi trasferire i vetrini in etanolo al 100% per 5 min. Pulire i campioni in un solvente a base di d-limonene per 5 minuti.
   9. Montare i vetrini coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene mentre il vetrino è ancora bagnato con il solvente a base di d-limonene. Lasciare indurire il mezzo di montaggio durante la notte.
      NOTA : Non utilizzare un mezzo di montaggio a base d'acqua.
3. Preparare i tessuti senza tumori grossolanamente visibili per identificare i neurofibromi plessiformi e i micro-MPNST. Incorporare i tessuti in paraffina, preparare sezioni istologiche e colorare queste sezioni con ematossilina ed eosina.
   1. Rimuovere gli organi interni e incorporare porzioni rappresentative di ciascun organo nella paraffina per preparare sezioni colorate con H&E che verranno esaminate per l'evidenza microscopica di tumori (Figura 1B). Rimuovere la testa, gli arti anteriori, gli arti posteriori e la coda (Figura 1C). Esaminare il midollo spinale e le radici nervose in situ per l'evidenza di tumori delle radici nervose, decalcificare la colonna vertebrale e le costole associate e i tessuti molli mediante immersione in EDTA/4% paraformaldeide 0,3 M (pH 8,0) per 48-72 ore a 4 ^oC; quindi, risciacquare i campioni con 1x PBS. Al termine della decalcificazione, assicurarsi che la decalcificazione sia completa tentando di perforare la colonna vertebrale con un ago. La decalcificazione ha successo se l'ago penetra facilmente nell'osso senza scricchiolare.
   2. Tagliare la colonna vertebrale decalcificata e le strutture associate in blocchi che si adattino a una cassetta di tessuto. Disidratare mediante etanoli graduati seguiti da un solvente a base di d-limonene come descritto nei passaggi 2.1.2-2.1.7. Incorporare nella paraffina e preparare sezioni di 4-5 μm come descritto nei passaggi 2.1.7-2.2.1. Eseguire le colorazioni H&E come descritto nei passaggi 2.2.2-2.2.9; Lasciare indurire il mezzo di montaggio durante la notte.

3. Identificare potenziali neurofibromi plessiformi ed eseguire colorazioni speciali per confermare le diagnosi

NOTA: Si consiglia vivamente di includere un patologo umano o veterinario esperto nella valutazione dell'H&E e delle colorazioni speciali delle sezioni tumorali GEM.

1. Esaminare i vetrini colorati con H&E preparati come descritto sopra utilizzando la microscopia in campo chiaro per identificare potenziali tumori della guaina nervosa periferica. Poiché i neurofibromi e gli MPNST insorgono all'interno dei nervi periferici, è importante determinare se i tumori microscopici sono associati a un nervo periferico. Identificare i blocchi con potenziali tumori della guaina nervosa periferica in modo che le immunocolorazioni e altre colorazioni speciali possano essere eseguite per confermare o confutare le diagnosi.
2. Distinguere i potenziali PN dalle MPNST/altre neoplasie di alto grado in base alle caratteristiche istologiche osservate durante l'esame in campo chiaro delle sezioni colorate con H&E. Le PN umane sono neoplasie lievemente ipercellulari composte prevalentemente da cellule con nuclei allungati, spesso ondulati. In molte aree, le cellule sono debolmente impacchettate e possono essere separate da materiale extracellulare mixoide; I PN nei topi P 0-GGFβ3 hanno un aspetto simile. Le mitosi in genere non sono presenti; se lo sono e il tumore è da moderatamente a altamente ipercellulare, il tumore è un MPNST o un altro tipo di neoplasia di alto grado (vedi sotto).
3. I PN sono composti da una miscela di cellule di Schwann neoplastiche e altri tipi di cellule non neoplastiche come i mastociti. Per confermare l'identità di un PN, eseguire immunocolorazioni per i marcatori delle cellule di Schwann S100β e Sox10 e il marcatore dei mastociti CD117 (c-Kit) su sezioni di blocchi contenenti potenziali PN identificati all'esame H&E (vedere paragrafo 3.4 per opzioni alternative di colorazione dei marcatori dei mastociti). Eseguire immunocolorazioni Ki67 per confermare bassi tassi di proliferazione.
   NOTA: La Tabella 1 elenca i marcatori antigenici utilizzati per l'identificazione di routine dei neurofibromi plessiformi GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), la diagnosi di MPNST e per una valutazione completa di altri tipi di cellule presenti nei neurofibromi; coloriamo questi ultimi antigeni solo quando descriviamo per la prima volta un nuovo modello GEM. Consultare la scheda tecnica del produttore dell'anticorpo per le condizioni consigliate. Notare se il foglietto illustrativo del produttore dell'anticorpo raccomanda il recupero dell'antigene; Non tutti gli antigeni richiedono il recupero per essere rilevabili.
   1. Preparare sezioni di 4-5 μm dai blocchi di paraffina selezionati e montarli su vetrini caricati positivamente. Deparaffinizzare le sezioni come descritto nei passaggi 2.2.2-2.2.6.
   2. Risciacquare le sezioni con 1x PBS per 3-5 min.
   3. Se il produttore dell'anticorpo raccomanda il recupero dell'antigene, preparare un tampone citrato. Combinare 9 mL di soluzione di acido citrico (10,5 g di acido citrico in 500 mL di acqua distillata) e 41 mL di soluzione di citrato di sodio (14,7 g di citrato di sodio in 500 mL di acqua distillata).
   4. Eseguire il recupero dell'antigene posizionando i vetrini in un tampone citrato per 20 minuti in un cuociriso riscaldato.
   5. Trasferire i vetrini in perossido di idrogeno al 3%/1x PBS per 10 minuti per eliminare l'attività della perossidasi nel tessuto.
      NOTA: Rendere questa soluzione fresca ogni volta e non utilizzare la soluzione madre di perossido di idrogeno se è più vecchia di 3-4 mesi.
   6. Risciacquare le sezioni in 1x PBS.
   7. Bloccare le sezioni utilizzando il buffer di blocco (2% BSA, 0,1% Triton X-100 in 1x PBS) per 1 ora. Sciacquare brevemente i vetrini in PBS 1x.
   8. Aggiungere l'anticorpo primario alle sezioni di tessuto. Preparare gli anticorpi primari in tampone bloccante diluito. Incubare i vetrini per 2 ore a 37 ^°C o per una notte a 4 ^°C.
   9. Lavare i vetrini in PBS 1x per 5 min. Ripetere 3 volte.
   10. Incubare il tessuto con anticorpi secondari biotinilati per 1-2 ore.
   11. Preparare la soluzione di diaminobenzidina (DAB) in base al protocollo del produttore e immergere i vetrini nella soluzione per 2-10 minuti. Lavare i vetrini in acqua per 5 min.
   12. Controcolorare le sezioni immergendole nell'ematossilina per 10-15 minuti. Esporre all'acqua corrente fino a quando non diventa limpido. Immergere rapidamente i vetrini nell'alcool e sciacquarli in acqua.
   13. Disidratare i vetrini in etanoli graduati immergendo rapidamente i vetrini, 4-5 volte per soluzione, in etanolo al 70%, etanolo al 95% e poi etanolo al 100%. Incubare i vetrini in un solvente a base di d-limonene per 2 min. Incubare i vetrini in un secondo lotto di solvente a base di d-limonene per 2 minuti.
   14. Montare le guide con un mezzo di montaggio a base di xilene.
   15. Esaminare i vetrini mediante microscopia in campo chiaro.
   16. Per l'immunofluorescenza, omettere i passaggi 3.3.10-3.3.15. Invece, incubare il tessuto con l'anticorpo secondario specie-specifico diluito in tampone bloccante per 1-2 ore.
   17. Sciacquare i vetrini in 1x PBS per 5 min. Ripetere 3 volte.
   18. Montare i vetrini utilizzando 1x PBS/glicerolo.
   19. Esaminare i vetrini utilizzando la microscopia a fluorescenza.
4. Metodo alternativo per colorare i mastociti: colorazione con blu di toluidina
   1. Preparare la soluzione madre blu di toluidina sciogliendo 1 g di blu di toluidina O in 100 mL di etanolo al 70%.
   2. Preparare una soluzione di cloruro di sodio (NaCl) all'1% sciogliendo 0,5 g di NaCl in 50 mL di acqua distillata. Mescolare per sciogliere. Regolare il pH a circa 2,0-2,5 utilizzando HCl.
      NOTA: Questa soluzione di NaCl deve essere resa fresca ogni volta che vengono eseguite le colorazioni.
   3. Preparare la soluzione di lavoro blu di toluidina aggiungendo 5 mL di soluzione madre blu di toluidina a 45 mL di soluzione di NaCl all'1%. Mescolare bene e assicurarsi che il pH sia di circa 2,3.
      NOTA: Un pH superiore a 2,5 comporterà una colorazione con meno metacromasia. Rendere questa soluzione fresca ogni volta che viene eseguita la colorazione.
   4. Deparaffinizzare sezioni da 4-5 μm montate su vetrini caricati positivamente come descritto nei passaggi 2.2.2-2.2.6. Lavare le sezioni deparaffinate in acqua corrente per 2 min.
   5. Colorare le sezioni in soluzione di lavoro blu di toluidina per 2-3 min. Lavare in acqua distillata per 2 min.
   6. Disidratare le sezioni immergendole 10 volte in etanolo al 95%. Immergere i vetrini in etanolo al 100% 10x. Immergere i vetrini in etanolo fresco al 100% altre 10 volte.
   7. Incubare i vetrini in un solvente a base di d-limonene per 2 min. Incubare i vetrini in un secondo lotto di solvente a base di d-limonene per 2 minuti.
   8. Montare i vetrini coprioggetti utilizzando un mezzo di montaggio a base di xilene mentre il vetrino è ancora bagnato con un solvente a base di d-limonene.
      NOTA : Non utilizzare un mezzo di montaggio a base d'acqua.
   9. Esaminare i vetrini mediante microscopia in campo chiaro. Identifica i mastociti dalla presenza di granuli viola scuro nel loro citoplasma. Altri tipi di cellule sono colorati di azzurro.

4. Colorazioni speciali per diagnosticare MPNST ed escludere diagnosi alternative

1. L'aspetto istologico delle MPNST umane è molto variabile e diversi tipi di tumore hanno un aspetto simile a quello delle MPNST²⁸. Poiché le MPNST derivano dalla linea cellulare di Schwann, determinare se il tumore deriva da un nervo periferico o all'interno di una PN benigna esistente mediante esame macroscopico o esame microscopico in campo chiaro di sezioni colorate con H&E. Sebbene le MPNST non siano occasionalmente in associazione con un nervo periferico o PN (di solito a causa della separazione involontaria dal nervo durante la dissezione, distruzione della PN preesistente tramite crescita eccessiva di MPNST o perché la lesione è metastatica), cercare l'associazione del tumore con un nervo o PN poiché la diagnosi è meno probabile se il tumore non è associato a un nervo o PN.
2. Preparare sezioni di 4-5 μm da blocchi di paraffina contenenti potenziali MPNST e montarle su vetrini caricati positivamente come descritto al punto 2.2.1. Deparaffinizzare le sezioni come descritto nei passaggi 2.2.2-2.2.6.
3. Eseguire l'immunoistochimica con il pannello di anticorpi indicato nella Tabella 2 come descritto nei passaggi 3.3.1-3.3.15.
4. Esaminare le immunocolorazioni mediante microscopia in campo chiaro. Poiché le MPNST dimostrano una differenziazione schwanniana, cercare un'immunoreattività uniforme o irregolare per S100β, nestina e Sox10. Se i tumori non sono positivi per questi tre marcatori, fare riferimento alla Tabella 2 per stabilire la diagnosi.
   NOTA: Gli MPNST umani e murini possono dimostrare una differenziazione divergente. Ad esempio, alcuni MPNST umani dimostrano una differenziazione rabdomioblastica focale (queste varianti sono note come tumori tritoni maligni); sebbene queste neoplasie si colorino per i marcatori schwanniani, esprimono anche marcatori muscolari come desmina, MyoD1 e miogenina. L'immunoreattività per questi ultimi marcatori non dovrebbe dissuadere i ricercatori dal diagnosticare il tumore come MPNST. Sebbene siano stati stabiliti diversi modelli murini che esprimono condizionatamente il gene di fusione SS18-SSX per modellare la patogenesi del sarcoma sinoviale²⁹, per quanto ne sappiamo, non sono noti modelli di sarcoma sinoviale che generano spontaneamente il trascritto di fusione equivalente. Di conseguenza, non cerchiamo trascritti di fusione SS18-SSX nei tumori GEM e ci affidiamo invece ai profili immunoistochimici.

5. Classificazione degli MPNST

1. Determinare se è presente necrosi tumorale, un segno distintivo delle MPNST di grado IV dell'OMS. Per le MPNST di grado IV, cercare l'ipercellularità prominente, l'attività mitotica vivace (≥4 mitosi per 10 campi ad alta potenza (40x)) e l'atipia citologica.
   1. Se la necrosi non è presente, valutare il tumore per determinare se sono presenti ipercellularità, attività mitotica vivace e atipia citologica. Se queste caratteristiche sono tutte presenti in assenza di necrosi, classificare il tumore come MPNST di grado III dell'OMS.
   2. I tumori di grado II dell'OMS sono caratterizzati da una cellularità aumentata, ma in misura minore rispetto agli MPNST di grado III e IV dell'OMS. I nuclei delle cellule tumorali in un MPNST di grado II dell'OMS dimostrano un aumento delle dimensioni (più di 3 volte le dimensioni dei nuclei delle cellule tumorali nei neurofibromi) e dell'ipercromia. L'aumento dell'attività mitotica (<4 mitosi per 10 campi ad alta potenza) è associato, ma non un requisito per, i tumori di grado II dell'OMS.
      NOTA: Poiché i tumori di grado superiore in genere progrediscono da gradi inferiori, le regioni di basso grado e di alto grado possono essere presenti nello stesso MPNST. In questa circostanza, il grado del tumore è determinato dalla regione di grado più alto presente.
      NOTA: C'è controversia tra i patologi umani sul fatto che il sistema di classificazione dell'OMS sopra descritto sia predittivo degli esiti dei pazienti e alcuni di questi patologi preferiscono invece classificare semplicemente gli MPNST come di basso grado o di alto grado. In base a questo schema, le MPNST di alto grado hanno un'atipia citologica prominente, un'attività mitotica vivace (>5 mitosi per 10 campi ad alta potenza) e una marcata ipercellularità con o senza necrosi. Le MPNST di basso grado mancano di necrosi ma mostrano attività mitotica, atipia citologica e cellularità intermedia tra una MPNST di alto grado e una neoplasia neurofibromatosa atipica con potenziale biologico sconosciuto (ANNUBP). Preferiamo il sistema sopra descritto perché distinguere tra un ANNUBP e un MPNST di basso grado può essere difficile per gli investigatori che non hanno una lunga esperienza con queste entità.

6. Preparazione di colture dicellule MPNST P 0-GGFβ3 di passaggio precoce

1. Coltura di cellule tumorali P 0-GGFβ3 a passaggio precoce da un tumore fresco 2 (fase 1.5, Figura 1A). Mantenere le condizioni sterili da questo punto in poi.
   1. Dissociare il tumore tagliandolo in piccoli pezzi (2-4 mm) e tritandolo in DMEM10 (il terreno essenziale minimo di Dulbecco) contenente il 10% di siero fetale di vitello, 2 μmol/L di forskolina e 10 nmol/L di neuregulina 1β (NRG1β) in piastre di coltura tissutale da 100 mm.
   2. Lasciare che le cellule crescano dai frammenti di tessuto tritato a 37 ^oC al 5% di CO₂ fino a quando le piastre non sono confluenti. Cambiare supporto ogni 3-4 giorni.
   3. Dividere la coltura cellulare. Rimuovere il supporto dal piatto da 100 mm e lavare le celle con PBS; Rimuovere ed eliminare il tessuto tritato. Rimuovere il PBS e aggiungere 1 ml di tripsina allo 0,25% per 2-5 minuti a temperatura ambiente. Per favorire il distacco cellulare, picchiettare delicatamente la piastra e verificare il distacco utilizzando un microscopio ottico; Prolungare l'incubazione della tripsina secondo necessità.
   4. Neutralizza la tripsina aggiungendo 2 mL di DMEM10. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga e le celle di pellet a 500 × g per 5 minuti. Rimuovere il terreno e aggiungere 5 mL di DMEM10 fresco al pellet.
   5. Distribuire la sospensione cellulare in due o quattro piastre da 100 mm contenenti DMEM10. Non dividere le cellule per più di cinque passaggi (passaggi 6.1.3 e 6.1.4) e mantenerle in DMEM senza forskolina e NRG1β. Ricordarsi di congelare le celle al passaggio 2 per un uso futuro.

7. Verifica dell'identità delle cellule MPNST di passaggio precoce mediante immunocitochimica

1. Posizionare vetrini coprioggetti rotondi sterili da 18 mm #1,5 nei pozzetti delle piastre sterili per coltura di tessuti a 6 pozzetti.
   1. Versare la soluzione di poli-L-lisina/laminina nei pozzetti in un volume sufficiente a coprire il vetrino coprioggetto. Sigillare la piastra con pellicola trasparente per ridurre al minimo l'evaporazione. Incubare a 4 °C per una notte. La mattina successiva, lavare i vetrini coprioggetti 3 volte con PBS sterile.
      NOTA: Abbiamo tentato di placcare le cellule MPNST a passaggio precoce su vetrini coprioggetti non rivestiti e abbiamo scoperto che le cellule non aderiscono bene in assenza di rivestimento in poli-L-lisina/laminina.
   2. Placcare 10.000 cellule sul vetrino coprioggetto aggiungendo delicatamente 2 ml di sospensione cellulare in terreno di coltura in ciascun pozzetto contenente il vetrino coprioggetto. Incubare le piastre per una notte a 37 °C con il 5% di CO₂ in un incubatore per colture tissutali.
   3. La mattina successiva, sciacquare i vetrini coprioggetti per 2 x 5 minuti con PBS.
   4. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS per 18 minuti a temperatura ambiente.
   5. Risciacquare i vetrini coprioggetti 3 x 5 minuti con PBS. Se lo si desidera, sigillare la piastra con pellicola di plastica e conservarla a 4 °C a questo punto.
   6. Preparare 50 mM NH₄Cl freschi in PBS. Estinguere le aldeidi incubando vetrini coprioggetti in 50 mM NH₄Cl in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente.
   7. Permeabilizzare le cellule incubando vetrini coprioggetti in Triton X-100 allo 0,3% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Lavare i vetrini coprioggetti per 3 x 5 minuti con PBS.
   8. Bloccare il legame non specifico incubando i vetrini coprioggetti in tampone bloccante (1x PBS contenente l'1% di albumina sierica bovina, lo 0,2% di latte scremato in polvere e lo 0,3% di Triton X-100) per 1 ora a temperatura ambiente.
   9. Rimuovere il tampone bloccante e aggiungere anticorpi primari che riconoscono i marcatori MPNST presenti nel tumore genitore (tipicamente S100β, Nestin e Sox10) diluiti alla diluizione ottimale predeterminata nel tampone bloccante. Avvolgere la piastra con pellicola di plastica e incubare a 4 °C per una notte in una camera umidificata.
   10. Lavare 3 x 5 minuti con PBS per rimuovere l'anticorpo primario non legato. Aggiungere l'anticorpo secondario marcato con fluorescenza diluito in tampone bloccante e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Proteggere dalla luce.
   11. Lavare 3 x 5 min con PBS. Incubare i vetrini coprioggetti in 1-5 μg di colorante Hoechst per 10 min. Continuare a proteggere dalla luce.
   12. Lavare i vetrini coprioggetti con PBS per 5 min. Montare i vetrini utilizzando PBS/glicerolo 1:1 1x. Immagine con un microscopio a fluorescenza.

8. Allotrapianto di cellule tumorali di passaggio precoce per dimostrare la tumorigenicità

1. Far crescere cellule MPNST P 0-GGFβ3 a passaggio precoce in confluenza DMEM10 all'80%. Sciacquare le cellule una volta con la soluzione salina bilanciata (HBSS) di Hanks a temperatura ambiente. Trattare le cellule per 30 secondi a 1 minuto con una soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica per rimuoverle dal substrato. Aggiungere 5 mL di DMEM10 per 1 mL di un reagente di dissociazione cellulare non enzimatico.
   NOTA: La dissociazione cellulare può richiedere molto più tempo, fino a 10-20 minuti. Si prega di fare riferimento al protocollo del produttore.
   NOTA: Non far crescere le cellule fino alla confluenza in quanto ciò ridurrà l'efficacia dell'innesto.
   1. Conta le cellule usando un emocitometro. Centrifugare le cellule a 5 × g per 5 minuti e risospenderle a una concentrazione di 1-2 × 10⁶ cellule per 100 μL di DMEM10. Tenere le cellule sul ghiaccio fino al momento dell'iniezione.
   2. Anestetizzare topi NOD-SCIDγ (NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1wjl/SzJ) nella camera di induzione di un vaporizzatore di isoflurano. Posizionare l'animale a pancia in giù e sterilizzare il sito di iniezione con etanolo al 70%. Lasciare asciugare il sito all'aria prima dell'iniezione. Prima dell'iniezione, lasciare che le cellule raggiungano la temperatura ambiente.
   3. Iniettare 1-2 x 10⁶ cellule per via sottocutanea nel fianco destro. Metti il topo da solo in una gabbia senza lettiera e lascialo riprendere. Assicurarsi che solo una parte della gabbia sia su un termoforo per evitare l'ipotermia. In questo modo si ottiene una zona in cui il mouse può spostarsi in caso di surriscaldamento.
      NOTA: Innestiamo un minimo di tre topi con ogni coltura di passaggio precoce poiché alcuni innesti potrebbero non prendere.
   4. Lasciare crescere l'innesto per 15-60 giorni; Valuta la salute degli animali 3 volte alla settimana e registra i punteggi delle condizioni corporee, inclusi il peso e i cambiamenti comportamentali ad ogni esame. Terminare i topi che hanno raggiunto la dimensione massima consentita dell'innesto o i topi moribondi utilizzando l'eutanasia con anidride carbonica seguita da lussazione cervicale. Record di età alla morte in giorni. Man mano che i tumori diventano visibili esternamente, registrare le dimensioni del tumore (lunghezza, larghezza e altezza).
      NOTA: In base alla nostra esperienza, diverse colture MPNST di passaggio precoce si innestano con efficienza variabile e differiscono nel tempo necessario per la crescita dell'innesto. Agli animali non deve essere consentito di procedere oltre la dimensione massima consentita del tumore approvata dalla IACUC e/o l'endpoint umano.
2. Prelevare il tumore, fissarlo in paraformaldeide al 4%, incorporarlo in paraffina ed eseguire le colorazioni H&E come descritto nei paragrafi 2.1-2.2.9 per verificare che l'allotrapianto sia un tumore piuttosto che un tessuto reattivo. Se necessario, immunocolorare l'innesto per i marcatori che erano presenti nel tumore genitore.

Results

La Figura 2 illustra esempi di neoplasie grossolanamente evidenti che insorgono in topi P 0-GGFβ3. I tumori che sono facilmente identificabili ad occhio nudo possono essere visti come masse che distendono le regioni del corpo, come mostrato nella Figura 2A (freccia). Quando si determina se la neoplasia è potenzialmente un tumore della guaina dei nervi periferici, è essenziale stabilire che il tumore è associato a un nervo periferico. In questo caso, una risonanza magnetica (Figura 2B) dimostra che il tumore è associato al nervo sciatico (punta di freccia); Questa associazione è stata confermata dopo l'eutanasia del topo e la dissezione del tumore. Va notato che una grande dimensione non indica necessariamente che il tumore è maligno. In questo caso, un esame istologico del tumore (Figura 2C) ha dimostrato che si trattava di un neurofibroma. Più comunemente, tuttavia, i tumori grossolanamente evidenti non vengono identificati fino a quando non si esegue l'autopsia del topo. La Figura 2D illustra un MPNST grande e carnoso che si è formato all'interno del plesso brachiale di questo animale.

La Figura 3 illustra esempi rappresentativi di MPNST e neurofibromi da topi P 0-GGFβ3 preparati secondo le procedure descritte nella sezione 1 del protocollo. La Figura 3A-J illustra dieci esempi di MPNST che sorgono indipendentemente dalla nostra colonia murina P_0-GGFβ3. Si noti che l'aspetto istologico delle MPNST può essere molto variabile, anche tra MPNST che si presentano indipendentemente nello stesso animale. Questa variabilità istologica illustra il motivo per cui confermiamo di routine la diagnosi di MPNST P 0-GGFβ3 con colorazioni immunoistochimiche. Vorremmo anche sottolineare che altri tipi di tumore, apparentemente non correlati, si verificano sporadicamente a bassa frequenza in alcuni ceppi murini consanguinei (ad esempio, abbiamo incontrato più volte linfomi in topi P 0-GGFβ3 portatori del transgene su un background C57BL/6J), sottolineando ulteriormente l'importanza di utilizzare l'immunoistochimica per confermare le diagnosi di tumore. Nonostante la variabilità del loro aspetto istologico, tutti e dieci i tumori illustrati nella Figura 3A-J erano immunoreattivi per S100β e nestina e negativi per i marcatori di altri tipi di tumore. La Figura 3K illustra un'immagine rappresentativa di una colonna vertebrale correttamente decalcificata e dei tessuti associati. Si noti che il midollo spinale, le radici nervose, il corpo vertebrale e il muscolo scheletrico mantengono tutti la loro corretta relazione anatomica tra loro. La Figura 3L è un'immagine ad alta potenza del corpo vertebrale e del midollo spinale sovrastante. Poiché questo tessuto è adeguatamente decalcificato, l'osso ha tagliato facilmente senza sminuzzarsi o piegarsi e il midollo osseo è facilmente identificabile negli spazi del midollo. Se il tessuto non fosse stato decalcificato correttamente, si sarebbe impigliato nella lama del microtomo e sarebbe stato strappato dalla sezione, causando danni significativi ai tessuti adiacenti (midollo spinale, radici nervose spinali e muscolo scheletrico). La Figura 3M presenta un'immagine rappresentativa di un neurofibroma che insorge all'interno di una radice del nervo dorsale in un topo P 0-GGFβ3. Si noti che questo tumore è meno cellulare rispetto agli MPNST mostrati nella Figura 3A-J. La diagnosi chiave per i neurofibromi è che sono composti da una miscela complessa di cellule di Schwann neoplastiche e mastociti non neoplastici, macrofagi, fibroblasti ed elementi simili a quelli perineurali che si infiltrano nel nervo e diffondono gli assoni.

La Figura 4 illustra esempi delle colorazioni più utili per l'identificazione iniziale di un neurofibroma plessiforme e per distinguere tra un neurofibroma plessiforme e un MPNST. La Figura 4A illustra l'immunoreattività S100β in un neurofibroma plessiforme P 0-GGFβ3. Si noti che l'immunoreattività S100β è evidente solo in una sottopopolazione di cellule, il che è in linea con il fatto che i neurofibromi sono composti da una miscela di cellule di Schwann neoplastiche e altri elementi non neoplastici (fibroblasti, mastociti, macrofagi, cellule perineuriali, una popolazione cellulare immunoreattiva CD34 scarsamente definita e vascolarizzazione). Sfortunatamente, la colorazione a chiazze di S100β non distingue tra neurofibromi plessiformi e MPNST, poiché la colorazione di S100β può essere irregolare nelle MPNST (la colorazione H&E è utile a questo scopo; tuttavia, poiché le MPNST sono in genere più cellulari dei neurofibromi plessiformi [vedi Figura 3]). Le cellule neoplastiche di Schwann sono anche immunoreattive per il filamento intermedio nestina, come dimostrato nella MPNST P 0-GGFβ3 presentata nella Figura 4B. Le cellule neoplastiche di Schwann spesso dimostrano anche immunoreattività nucleare per il fattore di trascrizione Sox10, come mostrato in un MPNST nella Figura 4C. Le caratteristiche utili per distinguere tra neurofibromi plessiformi e MPNST sono la presenza di mastociti e una prominente immunoreattività per il marcatore di proliferazione Ki67. La Figura 4D illustra una colorazione di Unna eseguita su un neurofibroma plessiforme P 0-GGFβ3 per evidenziare la presenza di mastociti, che sono facilmente identificabili dalla prominente colorazione viola metacromatica dei loro granuli citoplasmatici. I mastociti non sono presenti nelle MPNST. Al contrario, l'immunoreattività di Ki67 è praticamente inesistente nei neurofibromi plessiformi, come si vede nel tumore P 0-GGFβ3 mostrato nella Figura 4E. La marcatura nucleare di Ki67 è tipicamente presente in una frazione molto elevata di cellule tumorali, come si vede nel microscopico MPNST che si verifica nel ganglio trigemino di un topo P 0-GGFβ3 (Figura 4F).

La Figura 5 illustra esempi delle colorazioni che eseguiamo per caratterizzare completamente la composizione cellulare dei neurofibromi in un modello GEM di nuova concezione. Sebbene le colorazioni mostrate in questa figura siano state ottenute nei neurofibromi dermici umani, sono identiche nell'aspetto a quelle che abbiamo visto nei tumori GEM. L'immunoreattività per CD117 (c-Kit) è presente nei mastociti all'interno dei neurofibromi e quindi ha una distribuzione molto simile a quella osservata con le colorazioni Unna (vedi Figura 3A). I macrofagi sono presenti anche sparsi in tutti i neurofibromi, come si vede con il marcatore pan-macrofago Iba1 (vedi Figura 5D); ciò include sottoclassi di macrofagi che sono immunoreattivi per CD163 e CD86 (vedi Figura 5B e Figura 5C, rispettivamente). Una frazione dell'elemento schwanniano nei neurofibromi dimostra anche immunoreattività nucleare per Sox10. I fibroblasti possono essere evidenziati dalla loro immunoreattività per TCF4. Nella Figura 5G, CD31 marca gli elementi vascolari all'interno del neurofibroma, mentre CD34, dimostrato nella Figura 5H, etichetta un'enigmatica popolazione dendritica di cellule che è stata suggerita essere una sottopopolazione di macrofagi tissutali residenti³⁰ o una nuova popolazione di cellule della guaina nervosa che non sono né cellule di Schwann né fibroblasti³¹.

La Figura 6 è inclusa per consentire il confronto dei neurofibromi plessiformi umani e degli MPNST con i tumori osservati nei topi P 0-GGFβ3 e per fornire esempi rappresentativi di alcuni dei tipi di tumore umani che possono essere confusi con gli MPNST. La Figura 6A illustra un neurofibroma plessiforme insorto nel plesso brachiale di un paziente NF1, mentre la Figura 6B presenta la MPNST di grado IV dell'OMS che si è verificata all'interno di questo stesso neurofibroma plessiforme. La Figura 6B mostra alcune delle caratteristiche di un MPNST di grado IV dell'OMS, tra cui una marcata ipercellularità e atipia cellulare, una vivace attività mitotica e necrosi tumorale. Per fare un confronto, la Figura 6C mostra una MPNST di grado II dell'OMS che presenta una significativa atipia cellulare ma è meno ipercellulare della MPNST di grado IV e, sebbene siano presenti mitosi, dimostra una minore attività mitotica. La Figura 6D illustra un fibrosarcoma con il suo caratteristico schema a "spina di pesce" di guaine intrecciate di cellule tumorali. Tuttavia, questo modello non distingue necessariamente tra fibrosarcomi e MPNST, perché alcuni MPNST avranno un modello simile. Inoltre, la vista ad alta potenza presentata nella Figura 6E mostra una morfologia cellulare simile a quella osservata nell'MPNST di grado IV dell'OMS presentato nella Figura 6B. La Figura 6F illustra un leiomiosarcoma. A differenza della maggior parte delle MPNST, i leiomiosarcomi sono immunoreattivi per i marcatori muscolari come l'actina della muscolatura liscia e la desmina. Tuttavia, l'immunoreattività dell'actina della muscolatura liscia può variare da tumore a tumore, con alcuni tumori che dimostrano un'intensa immunoreattività uniforme (Figura 6G) e altri che mostrano un'immunoreattività che mostra variabilità cellulare all'interno del tumore (Figura 6H). L'immunoreattività della desmina può anche essere a chiazze nei leiomiosarcomi (Figura 6I). I melanomi sono molto variabili nella morfologia, con alcuni tumori composti da cellule poligonali (Figura 6J) e altri composti da cellule fusiformi che possono imitare la morfologia delle cellule MPNST. I melanomi possono essere distinti dagli MPNST per immunoreattività per i marcatori dei melanosomi come MART1 (Figura 6K). Tuttavia, i melanomi, come gli MPNST, sono spesso positivi per S100β e Sox10 (Figura 6L).

La Figura 7 illustra le caratteristiche patologiche delle MPNST di grado II, III e IV dell'OMS isolate da topi P0-GGFβ3. La Figura 8 mostra immagini rappresentative di celle MPNST P 0-GGFβ3 a passaggio precoce a bassa (Figura 7A) e ad alta potenza (Figura 7B). La tumorigenicità di queste cellule è dimostrata sia dalla loro capacità di formare colonie quando sospese in agar molle (Figura 7C) sia di formare innesti quando allotrapiantate per via sottocutanea in topi immunodeficienti (Figura 7D).

Figura 1: Flusso di lavoro utilizzato per elaborare il tumore e altri tessuti di topi P 0-GGFβ3. (A) I tumori grossolanamente visibili vengono raccolti e segmentati in tre porzioni per 1) fissazione in paraformaldeide al 4% seguita da immunoistochimica e istochimica, 2) creazione di colture cellulari tumorali a passaggio precoce e/o analisi genomiche e 3) congelamento istantaneo utilizzando azoto liquido per l'isolamento di proteine, DNA o RNA. (B) Dopo l'escissione del tumore, il corpo del topo viene fissato in paraformaldeide al 4% e gli organi interni vengono rimossi. Questi organi vengono campionati per l'esame istologico eseguito per identificare le evidenze microscopiche di neoplasia e altri processi patologici. (C) Dopo l'asportazione degli organi interni, le estremità (testa, arti, coda) e la pelle vengono rimosse dalla carcassa. La colonna vertebrale, le costole adiacenti e il muscolo scheletrico adiacente vengono decalcificati utilizzando EDTA 0,3 M/paraformaldeide al 4% (pH 8,0). I tessuti decalcificati vengono quindi inclusi in paraffina e sezioni dei tessuti vengono preparate per l'esame immunoistochimico e istochimico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini rappresentative di neurofibromi e MPNST grossolanamente evidenti in topi P 0-GGFβ3. (A) Topo P 0-GGFβ3 con un tumore grande grossolanamente evidente sul fianco destro (freccia). (B) Una risonanza magnetica di questo topo mostra che il tumore è collegato al nervo sciatico (punta di freccia) e che è cresciuto attraverso la fascia sovrastante per espandersi all'interno del sottocutaneo (freccia, massa tumorale di massa). (C) L'esame microscopico di questo tumore mostra che, nonostante le sue grandi dimensioni, il tumore è un neurofibroma. (D) Grande MPNST carnoso che si è formato nel plesso brachiale di un topo P 0-GGFβ3. Barra della scala = 100 μm. (C). Abbreviazioni: MPNSTs = tumori maligni della guaina dei nervi periferici; RM = risonanza magnetica. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Immagini rappresentative di MPNST, colonna vertebrale decalcificata e neurofibromi preparate come descritto nella sezione 1 del protocollo. (A-J) Le MPNST P 0-GGFβ3 asportate e colorate con H&E mostrano variabilità istologica. Tutte le immagini sono MPNST che sorgono in modo indipendente. Nonostante questa variabilità istologica, tutti questi tumori hanno mostrato una marcatura appropriata per i marcatori MPNST indicati nella Tabella 1. Barre di scala = 200 μm. (K) Immagine rappresentativa di una sezione trasversale colorata con H&E della colonna vertebrale decalcificata. In questa immagine sono facilmente visualizzabili le seguenti strutture: il midollo spinale; osso vertebrale; i gangli della radice dorsale sulla radice del nervo spinale dorsale; e muscolo scheletrico paravertebrale. Ingrandimento 4x. (L) Un'immagine ad alta potenza del midollo spinale e della vertebra mostrata in K dimostra il corretto aspetto dell'osso dopo la decalcificazione con questa metodologia. Ingrandimento 10x. (M) Immagine rappresentativa di un neurofibroma della radice del nervo dorsale in un topo P 0-GGFβ3. Ingrandimento 40x. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazioni: MPNSTs = tumori maligni della guaina dei nervi periferici; H&E = ematossilina ed eosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Colorazione diagnostica utilizzata per l'identificazione iniziale dei neurofibromi plessiformi e la loro distinzione dagli MPNST. (A) Immunocolorazioni per S100β in un neurofibroma plessiforme P 0-GGFβ3. Si noti che l'intensa colorazione marrone per questo antigene è presente solo in un sottogruppo di cellule in questo tumore, coerentemente con il fatto che i neurofibromi sono composti da cellule di Schwann neoplastiche e da molti altri tipi di cellule non neoplastiche. (B) Immagine in immunofluorescenza di un MPNST P 0-GGFβ3 colorato per la nestina del filamento intermedio (rosso) e controcolorato con bisbenzimide (blu, colorazione nucleare). (C) MPNST colorato per il fattore di trascrizione Sox10. L'immunoreattività intensa (marrone) è evidente nei nuclei di un sottogruppo di cellule tumorali. (D) Vista ad alta potenza di un neurofibroma plessiforme P 0-GGFβ3 dopo una colorazione Unna. Questa colorazione produce una colorazione metacromatica (viola) dei granuli nei mastociti. I neurofibromi plessiformi possono essere distinti dagli MPNST perché questi ultimi mancano di mastociti. (E,F) Immunoistochimica Ki67 nel neurofibroma plessiforme (E) a P 0-GGFβ3 e (F) in un P_0-GGFβ3 MPNST. Entrambe le sezioni sono state controcolorate con ematossilina (colorazione nucleare blu), con l'immunoreattività Ki67 evidente come colorazione nucleare marrone in queste colorazioni immunoperossidasi. Si noti che nessuna colorazione nucleare marrone è evidente nel neurofibroma plessiforme, mentre la maggior parte dei nuclei delle cellule tumorali sono positivi nel MPNST. Barre di scala = 100 μm. Abbreviazione: MPNST = tumore maligno della guaina dei nervi periferici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Immagini rappresentative delle immunocolorazioni utilizzate per identificare le sottopopolazioni di cellule che compongono i neurofibromi. Queste immagini immunofluorescenti di un neurofibroma dermico umano sono state colorate per (A) CD117 (c-Kit; un marcatore di mastociti), (B) CD163 (macrofagi M2), (C) CD86 (macrofagi M1), (D) Iba1 (marcatore pan-macrofagico), (E) Sox10 (marcatore delle cellule di Schwann), (F) TCF4 (marcatore dei fibroblasti), (G) CD31 (marcatore di vascolarizzazione) e (H) CD34 (indica una sottopopolazione distinta e poco conosciuta di cellule nei neurofibromi). Ingrandimento 60x, barre della scala = 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Immagini rappresentative di neurofibromi plessiformi, MPNST e alcuni altri tipi di tumore umano che vengono presi in considerazione nella diagnosi differenziale di un MPNST. (A) Neurofibroma plessiforme che insorga nel plesso brachiale di un paziente NF1, che mostra la cellularità complessivamente inferiore e l'aspetto benigno di questa neoplasia. Sebbene non sia facilmente visualizzabile nelle sezioni colorate con H&E, è presente una complessa miscela di tipi cellulari. Le mitosi non si vedono. Ingrandimento: 40x. (B) Un MPNST di grado IV dell'OMS che è derivato dal neurofibroma plessiforme illustrato in A. Si noti il grado molto più elevato di cellularità. La freccia indica una figura mitotica e l'asterisco indica una regione di necrosi tumorale nella parte in alto a destra di questo campo microscopico. Ingrandimento: 40x. (C) Un MPNST di grado II dell'OMS. Questo tumore ha un grado di cellularità inferiore rispetto all'MPNST di grado IV dell'OMS illustrato in B. Tuttavia, c'è più atipia nucleare e ipercromasia di quanto non sia evidente nel neurofibroma plessiforme illustrato in A. La freccia indica una delle figure mitotiche occasionali che si sono incontrate in questa neoplasia. Ingrandimento: 63x. (D) Una vista a bassa potenza di un fibrosarcoma di tipo adulto che illustra il modello a "spina di pesce" (le guaine intrecciate delle cellule tumorali) tipicamente visto in questo tipo di tumore. Sfortunatamente, l'architettura a spina di pesce si riscontra anche in alcuni MPNST umani e quindi non può essere utilizzata per distinguere tra fibrosarcomi e MPNST. Ingrandimento: 20x. (E) Una visione ad alta potenza del fibrosarcoma illustrata in D. Si noti la somiglianza tra la morfologia cellulare in questo fibrosarcoma e la morfologia cellulare evidente nel MPNST di grado IV dell'OMS mostrato in B. Ingrandimento: 40x. (F) Immagine ad alta potenza di un leiomiosarcoma, che dimostra la morfologia cellulare che rientra nell'intervallo di variazione osservato nelle MPNST. Ingrandimento: 40x. (G) Immunocolorazioni per l'actina della muscolatura liscia nel leiomiosarcoma illustrate in F. Si noti che le cellule tumorali mostrano un'immunoreattività intensa uniforme per questo antigene. Ingrandimento: 40x. (H) Immunocoloranti per l'actina della muscolatura liscia in un altro leiomiosarcoma. In questo tumore, c'è una maggiore variabilità nel grado di immunoreattività, con alcune cellule che colorano più intensamente di altre. Non è raro che l'immunoreattività per lo stesso antigene sia uniformemente presente in un tumore e sia presente solo in un sottogruppo di cellule tumorali in una diversa neoplasia. Ingrandimento: 40x. (I) Immunocolorazione per desmina in un terzo leiomiosarcoma. In questo tumore, solo un sottogruppo di cellule tumorali è intensamente immunoreattivo per questo antigene. (J) Melanoma metastatico. I melanomi sono noti per avere una morfologia altamente variabile che può variare da cuboidale a fusiforme; I tumori con quest'ultima morfologia sono più probabilmente confusi con gli MPNST, in particolare dato che sia i melanomi che gli MPNST possono dimostrare immunoreattività S100β e Sox10. Ingrandimento: 40x. (K) Immunoreattività per il marcatore di melanoma MART1 nel tumore illustrato in J. Ingrandimento: 40x. (L) Immunoreattività nucleare per il fattore di trascrizione Sox10 nel melanoma mostrato in J. Ingrandimento: 40x, barre della scala = 100 μm. Abbreviazione: MPNST = tumore maligno della guaina dei nervi periferici. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 7: Immagini rappresentative degli MPNST di grado II-IV P 0-GGFβ3 dell'OMS. (A) Fotomicrografie a bassa e (B) alta potenza di un MPNST di grado II dell'OMS. Si noti che la cellularità è inferiore alla MPNST di grado III dell'OMS illustrata nel pannello C e che i nuclei delle cellule tumorali in D sono più ipercromatici (più scuri) di quelli osservati nel pannello B. (C) Fotomicrografie a bassa e (D) alta potenza di un MPNST di grado III dell'OMS. Questo tumore ha dimostrato >4 figure mitotiche per 10 campi ad alta potenza, con cellule più densamente impacchettate e nuclei più ipercromatici e atipici. (E) Visioni a bassa e (F) ad alta potenza di un MPNST di grado IV dell'OMS. Si noti il fuoco della necrosi nella parte centrale inferiore del pannello F. Bassa potenza = 20x. Alta potenza = 40x, barre graduate = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 8: Immagini rappresentative delle cellule MPNST P 0-GGFβ3 a passaggio precoce e della loro tumorigenicità come dimostrato dalla crescita in agar molle e dalla loro capacità di crescere come allotrapianti. (A) Immagini a contrasto di fase a bassa e (B) alta potenza di cellule MPNST P_0-GGFβ3 a passaggio precoce. (C) cellule P 0-GGFβ3 MPNST cresciute in agar molle e colorate con nero Sudan; Le colonie sono evidenti come puncta neri nell'agar. (D) Immagine colorata con ematossilina ed eosina di un tumore che si è formato dopo che le cellule P 0-GGFβ3 MPNST sono state allotrapiantate per via sottocutanea in un topo immunodeficiente come descritto nel protocollo. (E) Proliferazione di cellule MPNST P 0-GGFβ3 a passaggio precoce in un periodo di 5 giorni come determinato da un citometro a immagine Celigo. Bassa potenza = 10x, alta potenza = 40x; Barra di scala = 100 μm per tutti i pannelli Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Nome	Uso	Reattività/Classe delle specie
CD117	Prediluito	monoclonale di coniglio
CD163	1:200	monoclonl di topo
CD31	1:50	policlonale di coniglio
CD34	1:2000	monoclonale di coniglio
CD86	1:1000	monoclonale di coniglio
Citocheratina	1 μg/mL	monoclonale di topo
Desmin	1:50	monoclonale di topo
IBA1	1:500	coniglio policlonale
Ki-67	1:50	monoclonale di coniglio
MART1	1 μg/mL	monoclonale di topo
Nestina	1:1,000	monoclonale di topo
PMEL	1:100	Rabbot monoclonale
Visualizzazione del materiale S100B	1:200	policlonale di coniglio
SMA	1:100	monoclonale di topo
Sox10	1:10	monoclonale di topo
TCF4/TCFL2	1:100	monoclonale di coniglio

Tabella 1: Anticorpi utilizzati per la diagnosi di neurofibroma plessiforme e tumori maligni della guaina dei nervi periferici. Anticorpi utilizzati per l'identificazione di routine dei neurofibromi plessiformi GEM (S100β, Sox10, CD117, Ki67), la diagnosi di MPNST e una valutazione completa di altri tipi di cellule presenti nei neurofibromi. Abbreviazione: MPNST = tumore maligno della guaina dei nervi periferici.

		Visualizzazione del materiale S100β	Nestina	Sox10	MART1	PMEL	Desmin	Actina della muscolatura liscia	Citocheratina	SS18-SSX Fusione
MPNST		50-90%, di solito focale	Positivo1	~30%	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo
Fibrosarcoma		Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo
Leiomyosarcoma		Raro	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	50-100%	Positivo	~40%	Negativo
Sarcoma epiteloide		Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Positivo	Negativo
Melanoma		Positivo	Positivo	85%	Positivo	Positivo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo
Sarcoma sinoviale monofasico		~30%	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Negativo	Positivo	Positivo

Tabella 2: Marcatori utilizzati per stabilire l'identità del tumore nell'uomo. Questi marcatori immunoistochimici e istochimici, insieme a una valutazione della morfologia microscopica tumorale, vengono utilizzati per distinguere le MPNST da altre neoplasie che le imitano. La diagnosi differenziale tipicamente considerata per le MPNST umane si pone con il fibrosarcoma di tipo adulto, il sarcoma epitelioide, il leiomiosarcoma, il sarcoma sinoviale monofasico e il melanoma. I fibrosarcomi di tipo adulto hanno un pattern a spina di pesce al microscopio e si colorano per la vimentina, ma non per S100β. I leiomiosarcomi, ma non le MPNST, sono immunoreattive per la desmina; I leiomiosarcomi hanno anche nuclei con una morfologia notevolmente smussata. I sarcomi epiteloidi, ma non gli MPNST, sono immunoreattivi per la citocheratina. I melanomi, come gli MPNST, possono essere S100β-positivi, ma sono anche immunoreattivi per MART-1 e PMEL. Abbreviazione: MPNST = tumore maligno della guaina dei nervi periferici. ¹Combinazione di S100β e nestina altamente predittiva di MPNST.

Discussion

I metodi istologici e biochimici qui presentati forniscono un quadro di riferimento per la diagnosi e la caratterizzazione di modelli GEM di neurofibroma e patogenesi MPNST. Nel corso degli anni, abbiamo trovato queste metodologie molto utili per valutare la patologia dei tumori della guaina nervosa periferica che insorgono nei modelli GEM 21,25,26. Tuttavia, mentre i protocolli qui delineati sono utili per determinare l'accuratezza con cui i tumori nei modelli GEM ricapitolano la patologia delle loro controparti umane, ci sono alcune limitazioni a queste strategie che dovrebbero essere apprezzate. Per cominciare, i topi P 0-GGFβ3 mostrano una penetranza quasi completa del loro fenotipo tumorale, il che rende relativamente facile ottenere un gran numero di topi con neurofibromi e MPNST 21,25,26 che possono essere utilizzati per studi genomici e screening shRNA su scala genomica. L'elevata penetranza del fenotipo in questo modello rende anche i topi P 0-GGFβ3 molto utili per gli studi preclinici. Va riconosciuto, tuttavia, che questo non sarà il caso di tutti i modelli di cancro GEM. Questo è il motivo per cui abbiamo sottolineato l'importanza di determinare la frazione di animali che si può prevedere sviluppino tumori. Quando si lavora con un modello animale che sviluppa meno comunemente tumori, abbiamo trovato vantaggioso utilizzare modalità di imaging come la risonanza magnetica o la tomografia a emissione di positroni per identificare definitivamente gli animali portatori di tumori che possono essere inseriti in studi preclinici o altri studi. Tuttavia, questo approccio può essere proibitivo dal punto di vista dei costi, se sono necessarie scansioni ripetute. Questo è il motivo per cui abbiamo anche sottolineato l'importanza di stabilire il tempo medio di sopravvivenza del modello GEM di interesse²⁶: capire quando ci si può aspettare che un animale sviluppi un tumore riduce il numero di scansioni necessarie per identificare gli animali con il fenotipo desiderato e i costi associati.

È anche importante riconoscere che un tumore di grandi dimensioni in un topo è ancora in realtà una quantità piuttosto piccola di tessuto. In questo protocollo, si raccomanda un processo in cui il tessuto tumorale viene diviso in terzi, con porzioni dedicate all'istologia/immunoistochimica, alla creazione di colture cellulari di passaggio precoce e all'isolamento delle biomolecole (proteine, RNA, DNA) di interesse. Tuttavia, le dimensioni del tumore variano e se il tumore è piuttosto piccolo, ciò può precludere la possibilità di avere abbastanza tessuto da dividere in questo modo. In tal caso, lo sperimentatore deve determinare se la diagnosi del tumore o un altro uso del tessuto tumorale ha la priorità³². In queste circostanze, il nostro pregiudizio è che dobbiamo avere una diagnosi corretta per capire con cosa stiamo lavorando prima di intraprendere altri esperimenti. Abbiamo scoperto che le diagnosi di tumore di solito possono essere prontamente stabilite utilizzando meno di un terzo della neoplasia. Quando si ha a che fare con tumori di piccole dimensioni, in genere si rimuove un piccolo frammento di tessuto tumorale, lo si avvolge in tessuto istologico e lo si posiziona in una cassetta tissutale per garantire che il tessuto non vada perso durante la lavorazione. Lo svantaggio di questo approccio è che può indurre lo sperimentatore a sottovalutare la neoplasia se si desidera la classificazione dell'OMS; Questo perché le regioni di grado inferiore e superiore coesistono comunemente nei tumori e, se viene prelevato un campione molto piccolo, il grado ottenuto dipenderà da dove è stato prelevato il campione tumorale.

I protocolli che descriviamo per stabilire l'identità tumorale della guaina dei nervi periferici si basano fortemente sull'immunoistochimica. Sebbene esistano approcci alternativi occasionali che possono essere utilizzati per alcuni tipi di cellule (ad esempio, l'esecuzione di colorazioni Unna per identificare i mastociti), ciò non è uniformemente vero per la maggior parte dei tipi di cellule presenti nei neurofibromi e nelle MPNST. Di conseguenza, è necessario prestare molta attenzione per stabilire che le procedure immunoistochimiche che verranno utilizzate siano state adeguatamente ottimizzate. In base alla nostra esperienza, diversi problemi possono compromettere l'immunoistochimica diagnostica. È di fondamentale importanza che lo sperimentatore esegua una serie di diluizioni con un anticorpo primario che non ha mai utilizzato prima; Inoltre, una serie di diluizioni deve essere eseguita quando si utilizza un nuovo lotto di un anticorpo precedentemente ottimizzato³³. È inoltre necessario prestare attenzione per garantire che siano disponibili nuovi lotti di reagenti. Nella nostra esperienza, quando invecchiano, il perossido di idrogeno e il DAB sono particolarmente inclini a non funzionare correttamente, il che può portare lo sperimentatore a decidere in modo inappropriato che le loro macchie sono negative.

I profili immunoistochimici che descriviamo per i neurofibromi plessiformi, le MPNST e i diversi tipi di neoplasie che vengono considerate nella diagnosi differenziale delle MPNST sono quelli che abbiamo più comunemente riscontrato 21,25,26,34. Tuttavia, poiché la differenziazione divergente non è rara nelle MPNST e in queste altre neoplasie, lo sperimentatore può incontrare profili di colorazione che differiscono in qualche modo da quelli che descriviamo qui. Queste sfumature sono il motivo per cui raccomandiamo vivamente che il team che caratterizza un nuovo modello GEM di tumorigenesi includa un patologo umano o veterinario esperto. In questo protocollo, abbiamo applicato la classificazione dell'OMS alle MPNST GEM e umane. Preferiamo questo sistema di classificazione perché i criteri di classificazione sono relativamente ben definiti e sono facili da confrontare tra MPNST umani e murini ^2,28. Vorremmo notare, tuttavia, che i criteri di classificazione dell'OMS non sono uniformemente accettati dai patologi. Questo perché non è chiaro se i tre gradi dell'OMS applicati alle MPNST siano predittivi degli esiti clinici nei pazienti. Per questo motivo, molti patologi preferiscono classificare le MPNST semplicemente come neoplasie maligne di basso o alto grado. Utilizzando questo approccio, circa l'85% delle MPNST sono considerate neoplasie maligne di alto grado caratterizzate da attività mitotica vivace, marcata atipia cellulare e ipercromasia che può essere accompagnata da necrosi tumorale. Gli MPNST di basso grado mostrano meno cellularità, ipercromasia e attività mitotica.

Abbiamo scoperto che l'allotrapianto di cellule MPNST di passaggio precoce è un mezzo semplice per verificare la tumorigenicità di queste colture. Tuttavia, alcuni problemi dovrebbero essere considerati quando le cellule non stabiliscono un allotrapianto³². Nella nostra esperienza, mentre la stragrande maggioranza delle cellule MPNST di passaggio precoce stabilirà un alloinnesto, occasionalmente abbiamo incontrato colture di passaggio precoce che non lo fanno. Nonostante questo fallimento, l'ibridazione genomica comparativa array (aCGH) e il sequenziamento dell'intero esoma hanno dimostrato che queste colture di passaggio precoce presentavano anomalie genomiche multiple coerenti con il fatto che si trattava di cellule tumorali^25,26. Abbiamo anche trovato colture di passaggio precoce che non sono sane, di solito perché le colture sono state lasciate diventare confluenti prima di raccoglierle per l'innesto. Anche le cellule danneggiate da una manipolazione brusca (ad esempio, incubate troppo a lungo con soluzione di dissociazione cellulare non enzimatica pipettata su e giù un numero eccessivo di volte) hanno scarse prestazioni quando vengono trapiantate. Segnaliamo inoltre che i tempi che abbiamo indicato per l'insediamento dell'innesto sono una stima basata sulla nostra esperienza. A volte, abbiamo incontrato culture di primo passaggio che stabiliscono con successo gli allotrapianti, ma impiegano più tempo per farlo.

Gli approcci sopra descritti forniscono un mezzo completo per caratterizzare gli aspetti chiave di un modello GEM di neoplasia del sistema nervoso periferico di nuova concezione e diagnosticare correttamente eventuali neurofibromi e MPNST che questi animali sviluppano. I metodi che delineiamo per stabilire colture MPNST di passaggio precoce e utilizzare queste colture per l'allotrapianto forniscono anche una chiara evidenza della tumorigenicità delle neoplasie identificate nei modelli GEM. Vorremmo sottolineare che non stiamo eseguendo la selezione di singoli cloni quando stabiliamo colture di passaggio precoce. Sebbene riconosciamo che una certa selezione è inevitabile quando si collocano cellule tumorali in coltura, questi risultati iniziali suggeriscono che le mutazioni identificate nelle colture GEM MPNST a passaggio precoce rimangono molto simili a quelle presenti nel tumore genitore. Tuttavia, utilizzando l'aCGH, abbiamo anche scoperto che continuare a portare queste colture di passaggio precoce per passaggi più estesi provoca cambiamenti genomici che iniziano a divergere da ciò che si vede nei passaggi precedenti di queste cellule tumorali.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastre per colture tissutali da 100 mm Corning	Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidina (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
Piastre a 6 pozzetti	Corning Costar	3516
Acido acetico	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secondario (Capra Anti-Topo)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secondario (Capra Anti-Topo)	Invitrogen	A21043 o A11004
Alexa Fluor 568 Secondario (Capra Anti-Coniglio)	Invitrogen	A11036
Cloruro di ammonio (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
Kit per il dosaggio delle proteine BCA	Thermo Scientific	23225
Albumina	sierica bovinaFisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Raschietto cellulare	Sarstedt	83.183
Spogliarellista	cellulare Corning	25-056-CI
Coprioggetto	circolare Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (solvente a base di d-limonene)	Decon Laboratories	5989-27-5
Acido critico	Fisher Scientific	A104-500
Citocheratina	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	clone D33 (M0760)
Diaminobensizdina (DAB) Soluzione	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Etanolo (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Siero fetale di vitello	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G6279
salina bilanciata di Hank (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Ematocitometro	Brightline-Hauser Scientific	1490
Acido cloridrico	Fisher Scientific	A144-212
Perossido di idrogeno	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
Kit di polimeri ImmPRESS HRP (perossidasi), mouse su mouse	Vector Laboratories	MP-2400
Kit di polimeri ImmPRESS HRP (perossidasi), Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubatore	Thermo Scientific	Heracell 240i Incubatore
Isoflurano	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanolo	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Segnalazione cellulare	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Azoto
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtomo
Nestina	Milliporo	Umano: MAD5236 (10C2), Umano: MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	Realizzato internamente	da S.L.C. (disponibile anche come 396-HB-050/CF da R& Sistemi D)Neurofibromina
	Santa Cruz Biotecnologia	sc-67
NODO. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ topi	Jackson Laboratory	5557
Latte in polvere scremato	Walmart	Marchio
P0-GGFβ 3 topi	Cera
		Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldeide (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (mezzo di montaggio xilene)	PHmetro Fisher Scientific	SP15-100
	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Soluzione salina tamponata con fosfato (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Bromidrato di poli-L-lisina	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Macchina portatile per isofluranza			anestesia per inalazione
PVA-DABCO (mezzo di montaggio acquoso)	Millipore Sigma	10981100ML
Cuociriso	Faggio Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (ora GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	clone 1A4
Cloruro di Sodio	Fisher Scientific	S640
Citrato di Sodio (Diidrato)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
			per istologia in acciaio
Superfrost Plus Vetrini per microscopio	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Segnalazione cellulare	(CH48H11) #2569
			tissutale
Toluidina Blu	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Tripsina	Corning	25-051-31