In questo articolo, descriviamo un protocollo semplice che consente la valutazione in vitro dell'abbondanza di microRNA marcati con fluorescenza per studiare le dinamiche dell'impacchettamento e dell'esportazione dei microRNA in vescicole extracellulari (EV).
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Articolo metodologico
Monitoraggio del rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari utilizzando la citometria a flusso
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le vescicole extracellulari (EV) sono importanti mediatori della comunicazione cellulare che vengono secreti da una varietà di cellule diverse. Queste vescicole extracellulari trasportano molecole bioattive, tra cui proteine, lipidi e acidi nucleici (DNA, mRNA, microRNA e altri RNA non codificanti), da una cellula all'altra, portando a conseguenze fenotipiche nelle cellule riceventi. Di tutti i vari carichi di EV, i microRNA (miRNA) hanno attirato una grande attenzione per il loro ruolo nel modellare il microambiente e nell'educare le cellule riceventi a causa della loro chiara disregolazione e abbondanza nelle EV. Ulteriori dati indicano che molti miRNA sono attivamente caricati nelle vescicole extracellulari. Nonostante questa chiara evidenza, la ricerca sulle dinamiche di esportazione e sui meccanismi di smistamento dei miRNA è limitata. Qui, forniamo un protocollo che utilizza l'analisi della citometria a flusso di EV-miRNA che può essere utilizzato per comprendere le dinamiche del carico di EV-miRNA e identificare i meccanismi coinvolti nell'esportazione di miRNA. In questo protocollo, i miRNA predeterminati per essere arricchiti in vescicole extracellulari e impoveriti dalle cellule donatrici vengono coniugati a un fluoroforo e trasfettati nelle cellule donatrici. I miRNA marcati con fluorescenza vengono quindi verificati per il caricamento nelle vescicole extracellulari e la deplezione dalle cellule utilizzando qRT-PCR. Sia come controllo della trasfezione che come strumento per il gating della popolazione di cellule trasfettate, è incluso un RNA cellulare marcato in modo fluorescente (trattenuto dalle cellule e impoverito di EV). Le cellule trasfettate sia con il miRNA EV che con il miRNA trattenuto dalle cellule vengono valutate per i segnali fluorescenti nel corso di 72 ore. L'intensità del segnale di fluorescenza specifica per i miRNA EV diminuisce rapidamente rispetto al miRNA trattenuto dalle cellule. Utilizzando questo semplice protocollo, è ora possibile valutare la dinamica del carico di miRNA e identificare vari fattori responsabili del caricamento dei miRNA nelle vescicole extracellulari.
Introduzione
I microRNA (miRNA) sono uno dei sottoinsiemi meglio caratterizzati di piccoli RNA non codificanti, noti per il loro ruolo critico nella regolazione genica post-trascrizionale. L'espressione e la biogenesi della maggior parte dei miRNA seguono una serie coordinata di eventi che inizia con la trascrizione dei miRNA primari (pri-miRNA) nel nucleo. A seguito dell'elaborazione nucleare da parte del complesso microprocessore in miRNA precursori (pre-miRNA), i pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma, dove subiscono un'ulteriore elaborazione da parte dell'endonucleasi RNasi III, suddividendosi in duplex di miRNA maturi a 21-23 nucleotidi1. Uno dei f....
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Protocollo
NOTA: Come prerequisito per l'utilizzo di questa tecnica, è richiesta l'identificazione e la convalida dei miRNA esportati selettivamente. Poiché le diverse linee cellulari variano in base al carico di miRNA smistato nelle loro vescicole extracellulari, si raccomanda di valutare la linea cellulare di interesse e le vescicole extracellulari associate per i miRNA prima dell'uso. Inoltre, la trasfezione a base di lipofectamina è uno dei passaggi critici del protocollo; Si raccomanda di predeterminare l'efficienza di trasfezione prima di impostare l'esperimento.
1. Cellule in crescita in coltura e trasfezione di cellule con EV-miRNA coniu....
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Risultati
Qui, utilizziamo la citometria a flusso come un potente strumento per studiare il rilascio di miRNA dalle cellule alle vescicole extracellulari. Utilizzando questo protocollo, l'analisi della citometria a flusso di cellule trasfettate con miRNA cellulare ed EV-miRNA ha rivelato una diminuzione sequenziale del segnale di fluorescenza corrispondente all'EV-miRNA, mentre il segnale corrispondente al miRNA cellulare è stato mantenuto nelle cellule. Per garantire che la coniugazione del fluoroforo non interferisca con il rila.......
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Discussione
Il protocollo di nuova istituzione consente di catturare la cinetica del rilascio di miRNA nelle vescicole extracellulari dopo la trasfezione di miRNA extracellulari. L'approccio consente l'analisi simultanea di più miRNA EV e miRNA cellulari, in base alle capacità del citometro. Inoltre, sebbene l'analisi della citometria a flusso possa fornire preziose informazioni sulla biologia dei miRNA EV, non è priva di limitazioni. Tuttavia, alcune delle limitazioni possono essere superate se utilizzate in combinazione con altre .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Riconosciamo il supporto e la consulenza della Dott.ssa Jill Hutchcroft, Direttore della Flow Cytometry Core Facility presso la Purdue University. Questo lavoro è stato sostenuto da R01CA226259 e R01CA205420 ad A.L.K., un premio per l'innovazione dell'American Lung Association (ANALA2023) IA-1059916 ad ALK, una sovvenzione della Purdue Shared Resource Facility P30CA023168 e una borsa di studio di dottorato Fulbright assegnata dal Dipartimento di Stato, USA a S.H.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Fisher | 05-408-129 | |
| Provette Falcon da 15 mL | Corning | 352097 | |
| Piastre per coltura tissutale trattate con fondo piatto trasparente a 6 pozzetti | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | Per impostare il gating e i parametri per il rilevamento delle particelle |
| Citometro a flusso Attune Nxt | ThermoFisher Scientific | N/A | Per l'analisi della fluorescenza nelle vescicole extracellulari |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | Per l'analisi della fluorescenza nelle cellule |
| Incubatore per colture cellulari | N/A | N/A | Temperatura di mantenimento di 37 ° C e 5% CO2 |
| Terreno di coltura cellulare | N/A | N/A | specifico per la linea cellulare di interesse |
| Linea cellulare di interesse | N/A | N/A | Qualsiasi linea cellulare testata e valutata per l'EV e l'abbondanza cellulare di miRNA in base all'interesse. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNA predeterminati per essere conservati dalla linea cellulare di interesse e non esportati selettivamente in EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNA predeterminati per essere selezionati selettivamente in EV | |
| Microscopio a fluorescenza | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Terreno a siero ridotto | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Emocitometro | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (per colture cellulari) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Trascrittasi inversa | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR PCR VERDE | Qiagen | ||
| mirVana Isolamento dell'RNA | Qiagen | AM1561 | |
| Acqua priva di nucleasi | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldeide, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Serbatoio reagente non sterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX PCR in tempo reale | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Tripsina 0,25% | Fisher | ||
| Ultracentrifuga | N/A | N/A |
Riferimenti
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G.
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Ristampe e permessi
