Valutazione del consumo di ossigeno mitocondriale utilizzando un saggio fluorescente basato su lettore di piastre

Summary

La valutazione del consumo di ossigeno fornisce informazioni integrali sulla funzione mitocondriale. Utilizzando una sonda fosforescente con un lettore di piastre fluorescenti, è possibile ottenere facilmente dati accurati e riproducibili senza apparecchiature specializzate. Questo test consente a qualsiasi laboratorio di misurare il consumo di ossigeno dei mitocondri isolati e di calcolare i rapporti di controllo respiratorio.

Abstract

I mitocondri svolgono molte funzioni importanti, tra cui la respirazione cellulare, la produzione di ATP, il controllo dell'apoptosi e l'agire come hub centrale delle vie metaboliche. Pertanto, la valutazione sperimentale della funzionalità mitocondriale può fornire informazioni sulle variazioni tra diverse popolazioni o stati patologici. Inoltre, è utile valutare se i mitocondri isolati sono abbastanza sani per procedere con gli esperimenti. Una caratteristica spesso utilizzata per confrontare la funzione mitocondriale in diversi campioni è il tasso di consumo di ossigeno. Il consumo di ossigeno e il successivo calcolo del rapporto di controllo respiratorio in cellule intatte o mitocondri isolati dal tessuto possono servire a tutti e tre gli scopi. Utilizzando mitocondri isolati dal fegato di lucertole a spazzola in combinazione con una sonda fosforescente sensibile alle fluttuazioni della concentrazione di ossigeno di una soluzione, abbiamo misurato il consumo di ossigeno utilizzando un lettore di piastre fluorescenti. Questo metodo non è solo rapido ed efficiente, ma può anche essere condotto con una piccola quantità di mitocondri e senza la necessità di attrezzature specializzate. Il protocollo passo-passo qui descritto aumenta l'accessibilità della valutazione funzionale mitocondriale per i ricercatori.

Introduction

I mitocondri sono organelli, delle dimensioni approssimativamente di un batterio, che si trovano nelle cellule eucariotiche. Sono organelli unici perché contengono DNA e hanno due membrane, una esterna e una interna. Le membrane esterne e interne dei mitocondri sono separate da uno spazio intermembrana e la membrana interna si ripiega in strutture chiamate cristae attorno al compartimento più interno, chiamato matrice. Queste cristae aumentano la superficie della membrana interna in modo che possano verificarsi contemporaneamente più processi che utilizzano le cristae. Sebbene i mitocondri siano coinvolti in molte funzioni cellulari come il controllo dell'apoptosi e l'alloggiamento di molteplici vie metaboliche, il loro ruolo vitale nella produzione di ATP è essenziale per la sopravvivenza cellulare. Infatti, il 90% dell'energia di una cellula deriva dai mitocondri¹. La produzione di ATP comporta la generazione di una differenza elettrochimica tra le membrane esterne e interne, chiamata potenziale di membrana mitocondriale (Δψ), che si verifica quando gli ioni H⁺ vengono pompati dalla matrice nello spazio intermembrana. La produzione di ATP viene infine sfruttata durante l'ossidazione degli equivalenti riducenti attraverso il movimento degli elettroni attraverso la catena respiratoria mitocondriale (ETC). L'accettore finale di elettroni è l'ossigeno molecolare (O₂). Man mano che l'ossigeno viene consumato, il differenziale di concentrazione di H⁺ raggiunge il suo massimo, a quel punto gli ioni H⁺ si spostano lungo il loro gradiente di concentrazione dallo spazio intermembrana alla matrice passando attraverso il complesso ATP sintasi. Il movimento degli ioni H⁺ provoca un cambiamento conformazionale nell'ATP sintasi e l'ADP viene portato in prossimità del fosfato inorganico per reagire e generare ATP. Infine, l'ATP viene traslocato dalla matrice mitocondriale nel citosol e può essere immagazzinato o utilizzato per facilitare le reazioni a causa della grande quantità di energia libera rilasciata durante l'idrolisi dei suoi fosfati. L'intero processo è chiamato fosforilazione ossidativa e, poiché l'ossigeno viene consumato, si dice che i mitocondri respirino².

L'accumulo e la forza di Δψ, la quantità di O₂ ridotta (chiamata consumo di ossigeno), così come la generazione di ATP possono essere utilizzati come indicazioni della salute delle cellule. Gli studi funzionali mitocondriali, come la misurazione di Δψ, il contenuto e la produzione totale di ATP e il consumo di ossigeno, possono essere quantificati con metodi biochimici tradizionali o con fluorescenza e luminescenza in saggi basati su piastra. Ad esempio, il potenziale della membrana mitocondriale può essere confrontato tra diversi campioni utilizzando coloranti fluorescenti come l'estere etilico tetrametilrodamina, che si lega specificamente ai mitocondri. La generazione di ATP può essere monitorata aggiungendo una proteina luminescente a una reazione le cui variazioni sono correlate alla concentrazione di ATP. La quantificazione dei tassi di consumo di ossigeno, o tassi assoluti di respirazione, durante l'OXPHOS, può aiutare a chiarire le cause delle disparità nella funzione mitocondriale e nel metabolismo energetico. La valutazione del consumo di ossigeno può essere utilizzata per calcolare i rapporti di controllo respiratorio (RCR). I valori di RCR descrivono la capacità dei mitocondri di produrre ATP in risposta all'afflusso di ADP, che è la funzione principale dei mitocondri. I valori di RCR indicano la condizione generale dei mitocondri isolati e consentono il confronto delle risposte a diversi trattamenti sperimentali. Le differenze nei valori di RCR possono rappresentare una disfunzione mitocondriale o indicare una differenza biologica tra diversi mitocondri isolati da due o più fonti. Un'altra importante misura della funzione nei mitocondri isolati è l'efficienza mitocondriale definita come moli di ATP sintetizzato per moli di O₂, o il rapporto P/O³.

Data la quantità di informazioni che possono essere raccolte dalla misurazione dei parametri mitocondriali e i vari casi in cui queste informazioni possono essere utilizzate, la capacità di raccogliere in modo efficiente dati funzionali può essere utile in molte aree di ricerca diverse. Le misurazioni del consumo di ossigeno mitocondriale sono state eseguite per decenni con strumentazione molto specifica, utilizzando un elettrodo di Clark, che può essere limitato dalla dimensione del campione necessario per eseguire le misurazioni, e, più recentemente, strumenti sofisticati in grado di misurare la respirazione mitocondriale e molti altri parametri, ma possono essere proibitivi in termini di costi. Questo protocollo è un approccio alternativo adattato che utilizza una sonda fosforescente sensibile all'ossigeno (MitoXpress)^4,5. Il segnale della sonda viene rilevato con un lettore di piastre in modalità fluorescenza risolta nel tempo per misurazioni continue nel tempo. La fosforescenza ha una differenza di energia maggiore tra il fotone assorbito ed emesso rispetto alla fluorescenza e, pertanto, è più adatta per il monitoraggio continuo dei cambiamenti nel segnale. Ciò consente a quasi tutti i laboratori di eseguire queste misurazioni, non solo a quelli che si concentrano sul metabolismo mitocondriale o che possono permettersi apparecchiature altamente specializzate. Il sistema modello che utilizziamo è costituito da mitocondri isolati da tre lucertole arboricole, due specie parentali e una introgredita (contenente DNA nucleare da una specie parentale e mitocondri dall'altra, ibridi). Queste lucertole sono state scelte perché abbiamo ipotizzato che ci siano conseguenze metaboliche ed energetiche per gli ibridi che hanno diverse fonti di DNA nucleare e mitocondriale. Abbiamo utilizzato un kit di analisi disponibile in commercio con un lettore di piastre multimodale in grado di aumentare l'accesso a questo tipo di test a un maggior numero di ricercatori e campi di ricerca.

Protocol

Le lucertole sono state soppresse mediante asfissia da CO₂ seguita da decapitazione immediata in conformità con le politiche delineate dall'Office of Animal Laboratory Welfare e dalle linee guida del Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali di Elon.

1. Isolamento dei mitocondri⁶

NOTA: Mantenere tutte le soluzioni fredde (Tabella 1) e i campioni sul ghiaccio durante questi passaggi.

1. Rimuovere il fegato, pesarlo e poi sciacquarlo con ~3 ml di soluzione salina ghiacciata tamponata con fosfato (1x, -/-).
2. Tritare il fegato in 1 mL di L-MIB con una lametta fresca.
3. Portare il volume totale di tessuto più L-MIB a 2 mL e disgregare meccanicamente le cellule epatiche per quattro passaggi con un omogeneizzatore Dounce.
4. Centrifugare l'omogeneizzato a 300 × g (37 °C, 10 min).
5. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo e metterlo sul ghiaccio.
6. Risospendere il pellet in 2 mL di L-MIB, riomogeneizzare e centrifugare nuovamente a 300 × g (37 °C, 10 minuti).
7. Unire i surnatanti di entrambe le centrifughe e centrifugare a 10.000 × g (37 °C, 10 min).
8. Risospendere il pellet in ~0,350 mL di L-MIB.
9. Determinare la quantità di proteine totali (mg di mitocondri/mL di L-MIB) da utilizzare come approssimazione per il contenuto mitocondriale ^4,5,6.

2. Consumo di ossigeno

1. Preriscaldare tutte le soluzioni utilizzate (Tabella 1) nei passaggi seguenti a 30 °C a bagnomaria.
2. Diluire i mitocondri in LEB a 6 mg/mL in base ai risultati del saggio della concentrazione proteica al punto 1.9.
3. Impostare il test in una piastra sterile a fondo trasparente a 96 pozzetti con parete nera (Tabella 2).
   1. Aggiungere 50 μl del campione (tampone L-EB o campione mitocondriale) nei pozzetti appropriati.
   2. Aggiungere 50 μL di trattamento (L-EB, glutammato/malato o glutammato/malato con ADP).
   3. Diluire il brodo della sonda 1:10 in L-EB e quindi aggiungere 100 μl della sonda fluorescente a ogni pozzetto.
   4. Aggiungere delicatamente 50 μl di olio minerale pesante a ogni pozzetto per escludere l'ossigeno ambientale.
4. Leggere le misure fluorescenti dal fondo della piastra a 380/650 nm di eccitazione/emissione ogni 1,5 minuti per 45 minuti. Utilizzare la modalità cinetica con un ritardo di 30.000 μs e una finestra di misura di 100 μs.

3. Analisi dei dati

1. Esportare il file di dati grezzi dal computer lettore di piastre come file .xls.
2. Apri il file, quindi copia e incolla i dati non elaborati in una nuova scheda ed etichetta le righe e le colonne in modo appropriato.
3. Tracciare il tampone L-EB solo sul campione di controllo e L-EB + G/M come unità fluorescenti relative (RFU) in funzione del tempo.
   NOTA: Queste linee dovrebbero essere relativamente piatte in quanto non sono presenti mitocondri e, pertanto, non dovrebbe essere rilevato alcun cambiamento nella concentrazione di ossigeno.
4. Traccia i valori del campione L-EB + G/M come RFU in funzione del tempo.
5. Determina dove le letture diventano più coerenti e si appiattiscono per i controlli.
   NOTA: È qui che dovrebbe iniziare l'analisi dei dati per i campioni sperimentali (contrassegnati da frecce nella Figura 1A). Le reazioni possono richiedere 10-15 minuti per appiattirsi e raggiungere il loro massimo.
6. Crea un nuovo grafico contenente solo i dati successivi al punto temporale stabilito nel passaggio 3.5 (chiamati dati "tagliati") e aggiungi la linea più adatta per visualizzare i dati grezzi da analizzare.
7. Calcolare il valore RFU medio dei dati del solo buffer di controllo trimmato (evidenziato in giallo). Questo valore viene utilizzato come valore RFU minimo come valore di base nel calcolo dell'ossigeno riportato di seguito.
8. Calcolo del tasso di consumo di ossigeno (μM Ø₂/min)
   1. Copia e incolla la regione lineare dei dati grezzi del passaggio 3.6 (cioè i dati tagliati) per determinare la concentrazione di ossigeno nei campioni mitocondriali in trattamento G/M + ADP in ogni punto temporale 7,8,9,10.
   2. Utilizzare l'equazione (1)⁵ per determinare la concentrazione di ossigeno in ogni punto temporale. [O₂]_a è la concentrazione di ossigeno nel tampone saturo d'aria (235 mM a 30 °C). I(t), Ia e Io sono rispettivamente il segnale fluorescente del campione + sonda al tempo t (ad esempio, campione + G/M + ADP), il segnale medio della sonda in tampone saturo d'aria calcolato al passo 3.7 e il segnale massimo in tampone deossigenato (impostato al segnale massimo ottenibile).
      (1)
   3. Tracciare i valori [O₂]_t calcolati nel passaggio 3.8.2 rispetto al tempo e aggiungere una linea di tendenza lineare insieme all'equazione della linea più adatta.
      NOTA: Utilizzare la pendenza di ciascuna linea come tasso di consumo di ossigeno. I duplicati o i triplicati di qualsiasi campione possono essere aggregati e utilizzati per il confronto del tasso di consumo.
9. Calcola l'RCR dividendo la respirazione mitocondriale con e senza ADP, che rappresentano rispettivamente gli stati 3 e 2.

Results

Il tasso di consumo di ossigeno e l'RCR mitocondriale sono stati determinati dai mitocondri di tre diverse lucertole utilizzando un kit di analisi con una sonda di rilevamento dell'ossigeno fosforescente e un lettore di piastre a fluorescenza standard. Ricerche precedenti hanno stabilito che la sonda in questo kit è direttamente correlata al consumo di ossigeno, dove la fosforescenza viene attenuata dall'ossigeno molecolare e il segnale fluorescente aumenta al diminuire dei livelli di ossigeno a causa della respirazione mitocondriale ^7,11. I valori di RFU vengono registrati nel tempo sia per i campioni di controllo che per quelli sperimentali e quindi analizzati. Le letture RFU per i pozzetti di controllo (solo tampone, tampone trattato con glutammato/malato e tampone trattato con glutammato/malato + ADP) sono state tracciate nel tempo per stabilire che eventuali cambiamenti nella fluorescenza nei pozzetti del campione sperimentale sono dovuti alla presenza di mitocondri. Inoltre, il controllo glutammato/malato + ADP consente di utilizzare la quantità di ossigeno di base durante la raccolta dei dati. Anche i campioni sperimentali contenenti mitocondri isolati sono stati tracciati sullo stesso grafico dei controlli.

La Figura 1A dimostra che le RFU aumentano nel tempo da un campione di mitocondri isolati, rispetto ai valori relativamente piatti di RFU dei controlli. Poiché le reazioni richiedono tempo per equilibrarsi, le prime 10 letture circa, fino a quando le letture del campione di controllo non sono così rumorose e livellate, vengono rimosse dal set di dati (Tabella supplementare S1 e Figura supplementare S1). Successivamente, i valori rimanenti del campione di mitocondri trattato con glutammato/malato + ADP vengono trasformati nella concentrazione di ossigeno in ogni punto temporale utilizzando l'equazione (1) (vedere la fase 3.2 del protocollo) e quindi tracciati in funzione del tempo. La Figura 1B mostra l'esito del campione sperimentale visto in Figura 1A (croci) dove il valore di R² è molto vicino a 1 e la pendenza della retta può essere calcolata. La pendenza della linea è negativa perché man mano che l'ossigeno viene consumato, la concentrazione totale di ossigeno in quel campione diminuisce. Questo stesso processo viene ripetuto per gli stessi campioni mitocondriali trattati con glutammato/malato senza ADP per ottenere tassi di consumo di ossigeno (Tabella S2 e Figura S2). Quindi, la respirazione mitocondriale con e senza ADP, che rappresentano rispettivamente gli stati 3 e 2, può essere utilizzata per calcolare l'RCR per ciascun tipo di campione (Figura supplementare S2). Se confrontato fianco a fianco, l'RCR medio tra i tre diversi tipi di lucertole arboricole indica che l'RCR dell'ibrido con mitocondri introgressi è significativamente inferiore a quello di entrambi i tipi parentali (Figura 1C). I mitocondri ibridi di lucertola avevano tassi di consumo di ossigeno intermedi rispetto ai due tipi parentali (Figura 2).

Figura 1: Esempi di risultati del test sul consumo di ossigeno. (A) Dati grezzi provenienti da reazioni di controllo solo tampone e reazioni che includono mitocondri isolati trattati con glutammato e malato (G/M), con o senza l'aggiunta di ADP. La fluorescenza è stata monitorata nel tempo. Man mano che l'ossigeno viene consumato, la fluorescenza aumenta. Le reazioni tampone (G/M, indicato da cerchi, e G/M + ADP, indicato da triangoli) e i mitocondri con trattamento G/M (indicati da quadrati) non hanno mostrato alcun cambiamento. I mitocondri trattati con G/M + ADP (indicato dai segni più) consumavano ossigeno. (B) Variazioni della concentrazione di ossigeno nel tempo calcolate dai dati grezzi per i mitocondri trattati con G/M + ADP presentati in A. (C) Valori RCR per i mitocondri di tre diversi tipi di lucertole misurati a temperatura ambiente. Questa figura è riprodotta da Haenel e Del Gaizo Moore¹². L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando le ANOVA in R. Abbreviazioni: G = glutammato; M = malato; RCR = rapporto di controllo respiratorio. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Tassi di consumo di ossigeno dei mitocondri di tre tipi di lucertole. I boxplot mostrano i tassi di consumo medio di ossigeno come una barra e le medie come un punto. I tipi parentali, Urosaurus graciosus e Urosaurus ornatus, erano significativamente diversi l'uno dall'altro. La forma introgressa (ibrida) era intermedia rispetto ai tipi parentali e non significativamente diversa da nessuno dei due. Questa figura è riprodotta da Haenel e Del Gaizo Moore¹². Abbreviazioni: Ug= Urosaurus graciosus; Uo = Urosaurus ornatus. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Composizione delle soluzioni utilizzate nel protocollo. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Mappa su piastra per il saggio del consumo di ossigeno. Per ogni campione, mettere da parte almeno 6 pozzetti (3 pozzetti di controllo: solo L-EB, L-EB con trattamento G/M, L-EB con trattamento G/M + ADP; 3 pozzetti sperimentali/campione: mitocondri con trattamento L-EB, L-EB + G/M e L-EB G/M + trattamento ADP). Quando possibile, eseguire ogni campione sperimentale in doppio o triplice copia. Abbreviazioni: G = glutammato; M = malato; L-EB = tampone sperimentale specifico per lucertola. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Figura supplementare S1: Grafici dei dati. (A) Grafico di tutti i dati grezzi per il confronto tra campioni e controlli. (B) Grafico dei dati grezzi bordati dalle colonne evidenziate nella Tabella Supplementare S1, dimostrando che solo i pozzetti che contenevano campioni di mitocondri avevano un aumento apprezzabile delle RFU. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Consumo di ossigeno e rapporti di controllo respiratorio. (A) Grafico dei dati sul consumo di ossigeno dalla Tabella supplementare S1 per determinare i valori di Stato 2 e Stato 3 trovando le equazioni delle linee più adatte. (B) Calcolo del rapporto RCR utilizzando le pendenze delle linee in (A), che rappresentano lo Stato 2 e lo Stato 3. Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S1: Esempio rappresentativo di dati grezzi. Le colonne evidenziate sono dati utilizzati per figure e calcoli (ad esempio, dati tagliati). Clicca qui per scaricare questo file.

Tabella supplementare S2: Esempio rappresentativo di dati tagliati e successivi calcoli del consumo di ossigeno. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussion

La misurazione della funzione mitocondriale è utile quando si confrontano campioni diversi, come stati di malattia rispetto a stati non patologici, diversi tipi di tessuto dello stesso animale o tra diversi tipi di campioni. Abbiamo usato il confronto successivo per testare la nostra ipotesi che ci sia una conseguenza metabolica per le lucertole arboricole ibride che hanno introgredito i mitocondri. Esistono diversi modi per accertare sperimentalmente la funzione dei mitocondri, tra cui la quantificazione del Δψ, il contenuto totale di ATP, la produzione di ATP, il controllo respiratorio e il tasso di consumo di ossigeno. Le misurazioni del consumo di ossigeno dei mitocondri isolati possono essere effettuate con apparecchiature specializzate come un elettrodo di Clark o i più sofisticati Seahorse XFs. Tuttavia, questi metodi possono essere limitati dalla dimensione del campione necessario per effettuare le misurazioni o proibitivi in termini di costi. I lettori di piastre multimodali in grado di leggere la fluorescenza sono diventati un'apparecchiatura standard nei laboratori di biologia cellulare e biochimica. Pertanto, un approccio alternativo per analizzare quantitativamente il consumo di ossigeno mitocondriale consiste nell'utilizzare un kit disponibile in commercio con un lettore di piastre fluorescenti. Questo protocollo passo dopo passo descrive come misurare il consumo di ossigeno ed eseguire i calcoli. ed economicamente nei mitocondri isolati. La misurazione precisa della capacità dei mitocondri di produrre ATP quando alimentati con ADP, indicata come respirazione di Stato 3, consente il confronto diretto di OXPHOS tra i campioni e le differenze possono significare disparità funzionali. Inoltre, la respirazione dello Stato 3 indica anche la qualità dei mitocondri che sono stati isolati, il che può determinare se una procedura di isolamento ha funzionato e/o se il campione è abbastanza buono da essere utilizzato in altri test. I valori RCR, che vengono calcolati utilizzando i valori di Stato 2 (solo glutammato e malato, per costruire Δψ) e di Stato 3 (glutammato e malato più ADP, per consentire l'utilizzo di Δψ per la produzione di ATP), forniscono un'altra informazione per il confronto e sulla salute dei mitocondri isolati. I dati presentati dimostrano che il metodo offerto in questo documento può aiutare a decifrare le variazioni tra i diversi tipi di campioni e misurare i tassi di consumo di ossigeno e i valori RCR senza la necessità di apparecchiature altamente specializzate, rendendo così questi tipi di misurazione più accessibili.

In questo protocollo, abbiamo appena isolato i mitocondri dalle lucertole e il consumo di ossigeno è stato determinato utilizzando un test MitoXpress Xtra Hs seguendo il protocollo del produttore e modificato secondo Hynes et ^al.4 e Will et ^al.5 Le lucertole variavano da 3,3 g a 5,1 g di massa corporea totale con una media di 0,170 g di tessuto epatico/lucertola, che ha prodotto ~0,350 mL di mitocondri grezzi concentrati. I mitocondri isolati sono stati utilizzati nel test di consumo di ossigeno a 6 mg/mL di proteine. Se la concentrazione di proteina mitocondriale, come determinato nella fase 1.7 del protocollo, è bassa, il campione può essere rifilato a 10.000 × g e il pellet risospeso in un volume minore di L-MIB. Va anche notato che abbiamo utilizzato con successo un minimo di 4 mg/mL per piccoli campioni di fegato o quando l'intero fegato non era disponibile.

Per garantire l'equilibrio dei gas e della temperatura dei campioni all'inizio del saggio, tutte le soluzioni utilizzate nella sezione 2 del protocollo devono essere preriscaldate a 30 °C in un bagno d'acqua. Nella sezione 3 del protocollo, i tassi di variazione dell'ossigeno disciolto (mM/min) sono estrapolati dalle pendenze iniziali dei profili di concentrazione di ossigeno decrescenti per ciascun campione (fase 3.3 del protocollo; Tabella supplementare S1 e Figura supplementare S1). Le percentuali di trattamento campione + G/M rappresentano la respirazione mitocondriale di Stato 2, mentre il campione con le percentuali di trattamento G/M + ADP rappresentano la respirazione mitocondriale di Stato 3. Pertanto, gli RCR vengono calcolati per ciascun campione dividendo i valori dello stato 3 per i valori dello stato 2 per ciascun campione (Tabella supplementare S2).

Il consumo di ossigeno può essere confrontato tra campioni unici, come dimostrato qui, o tra diversi trattamenti in un campione. In quest'ultimo caso, possono essere necessari controlli supplementari, come il controllo del solo veicolo con e senza mitocondri, per escludere la possibilità che il trattamento chimico stesso non interagisca con la sonda fosforescente. Inoltre, i dati sul consumo di ossigeno e RCR raccolti possono essere utilizzati insieme ai dati raccolti dagli stessi campioni con altri saggi. Una volta isolati, i mitocondri possono essere utilizzati in più saggi per fornire un quadro più completo della loro funzione¹². La misurazione di Δψ, il contenuto totale di ATP e il tasso di turnover dell'ATP sono alcuni dei saggi che sono stati combinati. Inoltre, l'uso di inibitori di ETC, OXPHOS e ATP sintasi con i saggi offre una comprensione ancora più completa dei diversi tipi di campioni mitocondriali, rafforzando le conclusioni tratte dai dati generati.

Un altro parametro che può essere misurato nei mitocondri isolati è l'efficienza mitocondriale, che è definita come il rapporto P/O delle moli di ATP sintetizzato per mole di O₂³. I rapporti P/O potrebbero essere calcolati in un'estensione di questo protocollo consentendo ai mitocondri dello Stato 3 di esaurire l'ADP fornito nella reazione e quindi aggiungendo un'aliquota di substrato ADP seguita dall'inibizione dell'ATP sintasi mediante l'aggiunta di oligomicina. Questi passaggi aggiuntivi consentono il calcolo dello Stato 4, che si verifica quando i mitocondri continuano a consumare ossigeno e mantengono un forte Δψ per produrre ATP massimo, fornisce informazioni sulla permeabilità dei mitocondri (se gli ioni H⁺ stanno tornando nella matrice senza l'uso dell'ATP sintasi e quindi dissipano Δψ), indicando in ultima analisi la disfunzione dei mitocondri. Inoltre, le misurazioni dello Stato 4 possono anche rivelare se il traslocatore ADP/ATP, che sposta l'ATP di nuova formazione dalla matrice e allo stesso tempo porta il substrato di ADP, è funzionale e se si sta verificando una perdita di ADP e ATP attraverso le membrane. L'aggiunta di oligomicina, che inibisce l'ATP sintasi, è un controllo per determinare se i mitocondri perdono a causa di una disfunzione effettiva. Mentre misurare lo Stato 4 in modo che il rapporto P/O potesse essere calcolato era al di là dell'ambito delle informazioni che abbiamo cercato per il confronto tra i tre tipi di campioni mitocondriali, è un altro pezzo di dati sulla funzione mitocondriale e potrebbe essere fatto come estensione di questo protocollo. Infine, vale la pena notare che i mitocondri possono essere isolati da cellule in coltura e da diversi tessuti di un topo o di un ratto (ad esempio, fegato, cuore, midollo spinale) tra gli altri. Potrebbero essere necessari aggiustamenti alle formulazioni MIB ed EB e ai protocolli di isolamento 4,13,14,15,16. Inoltre, secondo le istruzioni del produttore, questo test potrebbe essere eseguito con cellule intere e intatte. Pertanto, il metodo presentato non è limitato alle lucertole o ai mitocondri epatici, consentendogli di essere adatto a un'ampia gamma di modelli sperimentali in molte diverse sottodiscipline scientifiche.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastre inferiori nere/ottiche a 96 pozzetti	Thermo Fisher	265301	Piastre a parete nera non trattate con fondo trasparente.
ADP	Sigma	A2754	Diluire 100 &; micro; M stock con EB immediatamente prima dell'uso.
BSA	Thermo Fisher	BP1600-100	Produrre 2 mg/mL di brodo in acqua per il dosaggio delle proteine.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)	Sigma	D8537	Assicurarsi che il PBS sia privo di ioni Mg2+ o Ca2+.
EGTA	Sigma	E3889
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
Acido L-glutammico	Sigma	G1251
Acido L-glutammico sale di potassio	Sigma	S372226
acido L-malico	Sigma	M8304
Sale monopotassico dell'acido L-malico	Sigma	49601
Kit per il consumo di ossigeno MitoXpress	Agilent	MX-200-4	Il kit contiene la sonda e l'olio minerale HS.
MOPS	Sigma	M3183
Protien Assay Dye (5x)	BioRad	500-0006	Qualsiasi test proteico può sostituirlo.
R versione 3.3	R Core Development Team 2016
Lettore di micropiastre Thermomax Lettore di piastre multimodale EnSpire e software	PerkinElmer		Lettore di piastre fluorescenti standard
Base Trisma	Sigma	T6066	È possibile utilizzare qualsiasi versione della base Tris.