Una tecnica di politrasfezione inversa ottimizzata basata su cellule staminali embrionali di topo per una rapida esplorazione dei rapporti degli acidi nucleici

Summary

Il presente protocollo descrive un metodo per la politrasfezione inversa di cellule staminali embrionali di topo durante la coltura con terreni 2i e LIF. Questo metodo offre una maggiore fattibilità ed efficienza rispetto ai tradizionali protocolli di trasfezione diretta, consentendo al contempo l'ottimizzazione one-pot dei rapporti plasmidici.

Abstract

Grazie alla sua relativa semplicità e facilità d'uso, la trasfezione transitoria di linee cellulari di mammifero con acidi nucleici è diventata un pilastro della ricerca biomedica. Sebbene le linee cellulari più utilizzate dispongano di protocolli robusti per la trasfezione in coltura bidimensionale aderente, questi protocolli spesso non si traducono bene in linee meno studiate o con morfologie atipiche e difficili da trasfettare. Utilizzando cellule staminali pluripotenti di topo coltivate in terreni 2i/LIF, un modello di coltura ampiamente utilizzato per la medicina rigenerativa, questo metodo delinea un protocollo di trasfezione inversa rapido e ottimizzato in grado di ottenere una maggiore efficienza di trasfezione. Sfruttando questo protocollo, viene eseguita una politrasfezione a tre plasmidi, sfruttando l'efficienza superiore al normale nel rilascio di plasmidi per studiare una gamma ampliata di stechiometria plasmidico. Questo protocollo di politrasfezione inversa consente un metodo sperimentale one-pot, consentendo agli utenti di ottimizzare i rapporti plasmidici in un singolo pozzetto, piuttosto che in diverse co-trasfezioni. Facilitando la rapida esplorazione dell'effetto della stechiometria del DNA sulla funzione complessiva dei circuiti genetici consegnati, questo protocollo riduce al minimo i tempi e i costi di trasfezione delle cellule staminali embrionali.

Introduction

La consegna di DNA e RNA nelle cellule di mammifero è un pilastro fondamentale della ricerca biomedica¹. Un metodo comune per introdurre acidi nucleici esogeni (NA) nelle cellule di mammifero è attraverso la trasfezione transitoria ^2,3. Questa tecnica si basa sulla miscelazione di NA con reagenti di trasfezione disponibili in commercio in grado di veicolarli nelle cellule riceventi. Tipicamente, la NA viene consegnata tramite trasfezione diretta, in cui le cellule aderenti a una superficie bidimensionale ricevono il complesso di trasfezione. Mentre la trasfezione i....

Protocol

1. Preparazione di reagenti per la coltura di mPSC

1. Preparare l'integratore N2.
   1. In condizioni non sterili, preparare le seguenti soluzioni madre (fase 1.1.1.1) in una cappa di sicurezza chimica. Aggiungere la polvere solida di ciascuna sostanza chimica in una provetta conica da 50 ml prepesata. Pesare ogni provetta dopo aver aggiunto la polvere e aggiungere una quantità appropriata di solvente per ottenere le concentrazioni seguenti. Per un lotto di supporti, preparare la quantità minima indicata.
      NOTA: I seguenti reagenti sono pericolosi e devono essere maneggiati in conformità con le linee guida locali sulla sicurezza chimica. Gar....

Results

Sia le trasfezioni dirette che quelle inverse si basano sull'interazione tra la membrana cellulare e i complessi reagente-DNA di trasfezione in entrata, consentendo la consegna di NA alle cellule riceventi. Dove queste tecniche differiscono è lo stato della cellula al momento della consegna: mentre il DNA viene tipicamente consegnato a monostrati di cellule aderenti nella tradizionale trasfezione diretta, la trasfezione inversa si basa invece sul fatto che il complesso reagente-DNA incontra le cellule mentre si trova in .......

Discussion

Una delle ragioni principali per l'adozione diffusa dei protocolli di trasfezione è la loro riproducibilità e accessibilità; Tuttavia, questi protocolli richiedono l'ottimizzazione in contesti sperimentali. Non menzionato sopra è il test standard richiesto quando si tenta di trasfettare una nuova linea cellulare per la prima volta. In primo luogo, la scelta del reagente di trasfezione è fondamentale, poiché i reagenti disponibili in commercio non sono uguali per tutti e variano nell'efficienza della vitalità della sommin.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrina	Integratore MilliporeSigma	T1147-500MG
B27	ThermoFisher Scientific
Beta-mercaptoetanolo	ThermoFisher Scientific
BSA frazione V (7,5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Perle di standardizzazione per citometria a flusso	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatina	Integratore MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX	ThermoFisher Scientific
Insulina	Gibco	12585-0014
Lipofectamina 2000	Invitrogen	11668-019	Reagente di trasfezione
Terreni neurobasali	ThermoFisher Scientific
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Pericolo chimico - consultare le linee guida di sicurezza locali, assicurarsi che siano indossati DPI adeguati e lavorare con la forma di polvere solida solo in una cappa chimica
Putrescina	MilliporeSigma	P6780	Pericolo chimico - consultare le linee guida di sicurezza locali, assicurarsi che siano indossati DPI adeguati e lavorare con la forma di polvere solida solo in una cappa chimica
mMLIF ricombinante	BioTechne	8878-LF-500/CF
Selenito di sodio	MilliporeSigma	S5261-25G	Rischio chimico - consultare le linee guida di sicurezza locali, assicurarsi che vengano indossati DPI adeguati e lavorare con la polvere solida solo in una cappa chimica
Tripsina-EDTA	ThermoFisher Scientific