Articolo metodologico

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule staminali della polpa dentale da denti decidui e permanenti umani

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DOI:

10.3791/65767

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17 maggio 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dentistry, Oral Health Institute, Hamad Medical Corporation, 2Pushpagiri Institute of Medical Sciences and Research Centre, 3Saveetha Dental College, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, 4College of Applied Medical Sciences, King Saud University

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo enfatizza l'estrazione, la coltura e la conservazione di cellule staminali multipotenti dalla polpa dentale attraverso la digestione enzimatica. Inoltre, dimostra il loro potenziale di differenziarsi in osteoblasti, adipociti e condrociti, evidenziando l'importanza della precisione e della coerenza nel processo.

Abstract

Nell'ambito della medicina rigenerativa e delle applicazioni terapeutiche, la ricerca sulle cellule staminali sta rapidamente guadagnando terreno. Le cellule staminali della polpa dentale (DPSC), che sono presenti sia nei denti decidui che in quelli permanenti, sono emerse come una fonte vitale di cellule staminali grazie alla loro accessibilità, adattabilità e capacità di differenziazione innate. Le DPSC offrono un serbatoio abbondante e prontamente disponibile di cellule staminali mesenchimali, mostrando una versatilità e un potenziale impressionanti, in particolare per scopi rigenerativi. Nonostante le loro promesse, l'ostacolo principale risiede nell'isolare e caratterizzare efficacemente le DPSC, data la loro rappresentazione come una frazione minuscola all'interno delle cellule della polpa dentale. Altrettanto cruciale è la corretta conservazione di questa inestimabile risorsa cellulare. I due metodi predominanti per l'isolamento della DPSC sono la digestione enzimatica (ED) e la crescita da espianti di tessuto (OG), spesso indicata come crescita spontanea. Questo protocollo si concentra principalmente sull'approccio di digestione enzimatica per l'isolamento del DPSC, descrivendo in dettaglio le fasi che comprendono l'estrazione, l'elaborazione in laboratorio e la conservazione delle cellule. Oltre all'estrazione e alla conservazione, il protocollo approfondisce l'abilità di differenziazione delle DPSC. In particolare, delinea le procedure impiegate per indurre queste cellule staminali a differenziarsi in adipociti, osteoblasti e condrociti, mostrando i loro attributi multipotenti. Il successivo utilizzo di tecniche di colorazione colorimetrica facilita la visualizzazione accurata e la conferma del successo della differenziazione, convalidando così il calibro e la funzionalità dei DPSC isolati. Questo protocollo completo funziona come un modello che comprende l'intero spettro dell'estrazione, coltivazione, conservazione e caratterizzazione delle cellule staminali della polpa dentale. Sottolinea il notevole potenziale dei DPSC, spingendo in avanti l'esplorazione delle cellule staminali e mantenendo la promessa di future scoperte rigenerative e terapeutiche.

Introduzione

La ricerca sulle cellule staminali è fiorita nella scienza biomedica grazie alle sue promettenti applicazioni nella medicina rigenerativa e nell'ingegneria tissutale. Le cellule staminali della polpa dentale (DPSC), derivate dal tessuto pulpare dei denti decidui umani e permanenti, hanno suscitato un notevole interesse come fonte di cellule staminali grazie alla loro pronta disponibilità e capacità multipotente 1,2. Queste cellule hanno il potenziale per differenziarsi in vari tipi di cellule, tra cui adipociti, osteoblasti e condrociti, come confermato da numerosi studi3.

Negli ultimi decenni, la ricerca e le applicazioni terapeutiche delle cellule staminali sono aumentate. Il potenziale espansivo delle cellule staminali richiede una diversificazione delle fonti da cui sono ottenute. Diversi fattori influenzano l'efficienza, la vitalità e la staminalità delle cellule scelte. Nonostante l'esistenza di vari serbatoi noti di cellule staminali, come il midollo osseo e i tessuti adiposi, le procedure invasive, la morbilità del sito e le preoccupazioni etiche legate a queste fonti spesso ne limitano l'esplorazione 4,5. Tra le varie fonti di cellule staminali, le cellule staminali dentali hanno attirato l'attenzione grazie alla loro facile accessibilità, all'elevata plasticità e alle diverse potenziali applicazioni. Le cellule staminali della polpa dentale umana, in particolare, sono state ampiamente studiate per le loro prospettive terapeutiche6. I denti, comunemente scartati come rifiuti medici, contengono una ricchezza di cellule staminali mesenchimali7. La salvaguardia di questo prezioso pool di cellule staminali richiede sforzi collettivi da parte di pazienti, dentisti e medici per garantire che queste risorse non vengano sprecate, rendendo ogni cellula staminale della polpa dentale disponibile per future esigenze rigenerative.

Le cellule staminali derivate dalla polpa dentale, come le cellule staminali della polpa dentale adulta umana (DPSC) e le cellule staminali dei denti decidui umani esfoliati (SHED), si trovano nella nicchia perivascolare della polpa dentale. Si ritiene che queste cellule provengano da cellule della cresta neurale cranica e mostrino marcatori precoci sia per le cellule staminali mesenchimali (MSC) che per le cellule staminali neuroectodermiche. DPSC e SHED hanno dimostrato multipotenza e la capacità di rigenerare diversi tipi di tessuto8.

Le potenziali fonti di cellule staminali dentali comprendono denti decidui sani e permanenti. Le cellule staminali costituiscono solo circa l'1% della popolazione cellulare totale nella polpa, evidenziando l'importanza di tecniche efficaci di isolamento ed espansione9. Di conseguenza, l'estrazione e l'espansione di queste cellule staminali sono passaggi fondamentali nell'isolamento DPSC10. I denti estratti o esfoliati devono essere conservati in un mezzo di trasporto ricco di sostanze nutritive, come la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o la soluzione salina tamponata con Hanks (HBSS).

L'ottenimento della polpa dentale può essere ottenuto attraverso vari metodi, a seconda del tipo di dente 7,11. Per i denti decidui con radici riassorbite, l'estrazione può essere eseguita attraverso l'apice della radice. Allo stesso modo, le brocce spinate sterili possono essere utilizzate per ottenere polpa da denti permanenti con un apice aperto immaturo. In caso di denti permanenti con radici completamente sviluppate, l'accesso alla camera pulpare comporta la separazione della corona dentale dalla radice. Ciò si ottiene tagliando il dente utilizzando un disco diamantato alla giunzione dello smalto cementizio. Questa incisione espone la camera pulpare, consentendo il recupero del tessuto pulpare 12,13,14.

Le cellule staminali della polpa dentale (DPSC) possono essere isolate attraverso la digestione enzimatica (DE) o la crescita da espianti di tessuto (OG), nota anche come crescita spontanea. Il metodo ED impiega enzimi, principalmente collagenasi I e dispasi, per scomporre il tessuto in sospensioni unicellulari15,16. Il metodo OG, più semplice e veloce, prevede il taglio dei frammenti di polpa e il loro inserimento diretto in una piastra di coltura, consentendo alle cellule di crescere dagli espianti di tessuto17. I ricercatori hanno utilizzato e confrontato entrambe le tecniche per valutare i tassi di proliferazione cellulare, la conservazione delle proprietà delle cellule staminali isolate, la differenziazione e l'espressione dei marcatori di superficie18. La definizione e la standardizzazione di protocolli per l'acquisizione di DPSC con elevata efficienza e staminalità può aprire la strada a terapie efficaci e sicure19. Questo protocollo comprende l'estrazione di DPSC mediante digestione enzimatica, elaborazione in laboratorio, conservazione e differenziazione cellulare con colorazione colorimetrica per adipogenesi, osteogenesi e condrogenesi.

Il protocollo descritto in questo articolo presenta una procedura passo-passo, che inizia con l'isolamento iniziale della polpa dentale dal dente, seguita dalla coltura e dal mantenimento delle DPSC in laboratorio, e si conclude con la loro caratterizzazione utilizzando specifici marcatori di cellule staminali (Figura 1). Vengono inoltre descritte le tecniche per indurre queste cellule staminali in diverse linee cellulari, evidenziandone la multipotenza.

Protocollo

Il protocollo qui delineato è conforme alle linee guida del comitato etico istituzionale per la ricerca umana (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). L'uso dei denti estratti è stato condotto seguendo standard etici per garantire l'integrità, la dignità e i diritti dei partecipanti. I partecipanti selezionati per questo studio erano individui sani di età inferiore ai 30 anni che necessitavano di estrazione dentale per il trattamento ortodontico. Quelli con carie dentale estesa o grave parodontite sono stati esclusi dallo studio. I denti decidui sono stati raccolti dai bambini che hanno richiesto l'estrazione dei denti trattenuti. Il consenso informato scritto è stato ottenuto anche dai soggetti coinvolti in questo studio.

1. Estrazione e trasporto dei denti

  1. Raccolta di denti decidui e permanenti
    1. Spiegare ai partecipanti lo scopo della procedura e il potenziale utilizzo dei denti estratti per scopi di ricerca.
    2. Eseguire l'estrazione dei denti in anestesia locale somministrando un agente anestetico in prossimità del dente da estrarre. In particolare, per questo studio sono stati iniettati 1,75 ml di lidocaina miscelata con epinefrina (vedi Tabella dei materiali) in rapporto 1:200.000. È preferibile selezionare denti che non presentino carie dentale grave o parodontite20,21.
  2. Trasporto dei denti estratti
    NOTA: Si consiglia di lavorare in condizioni asettiche per evitare contaminazioni. Ciò include l'uso di dispositivi di protezione individuale, come guanti e camice da laboratorio, e il lavoro in un ambiente sterile, come un cappuccio a flusso laminare a rischio biologico.
    1. Dopo che il dente è stato estratto, sciacquarlo con una soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere il sangue e altri detriti. Utilizzando una pinza sterile e un bisturi, rimuovere con cura eventuali residui di tessuto molle attaccati dalla superficie del dente (Figura 2A).
    2. Immergere il dente in una soluzione disinfettante, come etanolo al 70%, per 10 s. Dopo la disinfezione, sciacquare il dente con PBS sterile per lavare via eventuali residui di disinfettante.
    3. Mettere il dente in un contenitore sterile contenente il mezzo di trasporto.
      NOTA: Il mezzo di trasporto consisteva in Alpha-MEM, un terreno di coltura commerciale integrato con antibiotici: 100 U/mL di penicillina/streptomicina (vedi Tabella dei materiali). Questo mezzo forniva nutrienti essenziali alle cellule all'interno del dente estratto, garantendone la sopravvivenza fino all'elaborazione in laboratorio. Gli antibiotici servivano a inibire la crescita batterica.
    4. Mantenere una temperatura di 4 °C durante il trasporto per rallentare le attività metaboliche cellulari e ritardare la morte cellulare. Trasporta il dente in laboratorio per le fasi successive, tra cui l'elaborazione e l'isolamento delle cellule staminali della polpa dentale.

2. Raccolta del tessuto pulpare

  1. Fissare il dente utilizzando una pinza dentale per assicurarsi che rimanga in posizione durante la procedura. Utilizzare un disco diamantato per tagliare il dente in un manipolo dentale (vedere Tabella dei materiali) collegato a un refrigerante ad acqua (Figura 2B).
    NOTA: L'obiettivo è esporre la camera pulpare senza causare danni inutili al tessuto pulpare all'interno.
  2. Utilizzare un escavatore dentale (vedi Tabella dei materiali) per rimuovere il tessuto pulpare. Questo strumento consente l'estrazione della polpa senza infliggere danni, preservando così la vitalità delle cellule staminali della polpa dentale (Figura 2C).
  3. Posizionare il tessuto ottenuto su una capsula di Petri di vetro. Lavare il tessuto pulpare con soluzione fisiologica tamponata con fosfato.

3. Digestione del tessuto pulpare e isolamento cellulare

  1. Macinazione e digestione dei tessuti
    1. Con una lama chirurgica sterile, tritare accuratamente il tessuto pulpare in piccoli frammenti (Figura 2D) e posizionarlo in un mini trituratore di tessuti con PBS per ottenere una miscela finemente omogeneizzata. Questo processo aumenta la superficie del tessuto, facilitando un'azione enzimatica più efficiente durante la digestione.
    2. Trasferire i frammenti di tessuto omogeneo tritati in una provetta da 15 mL e digerire enzimaticamente utilizzando una miscela di 3 mg/mL di collagenasi di tipo I e 4 mg/mL di dispasi (vedere la Tabella dei materiali). Questi enzimi sono stati disciolti nella soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) per ottenere le concentrazioni desiderate.
    3. Incubare il tessuto pulpare nella miscela enzimatica (punto 3.1.2) per circa 2 ore a 37 °C. Dopo l'incubazione, neutralizzare gli enzimi e raccogliere le cellule mediante centrifugazione (passaggio 3.2.1) per un'ulteriore coltura.
  2. Centrifugazione e risospensione
    1. Dopo l'incubazione, trasferire il tessuto digerito in una provetta da centrifuga da 15 ml e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule. Questo passaggio separa le cellule dai frammenti di tessuto rimanenti e dagli enzimi non digeriti. Eliminare con cura il mezzo surnatante, assicurandosi di non disturbare il pellet della cella sul fondo della provetta.
    2. Risospendere il pellet cellulare in un terreno di coltura fresco. Questo mezzo fornisce i nutrienti e l'ambiente necessari per la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule isolate.

4. Coltura cellulare

  1. Placcatura e incubazione delle cellule
    1. Trasferire con cura le cellule risospese in un pallone di coltura di 25 cm².
      NOTA: Tutto il materiale di una singola polpa viene trasferito in un unico pallone per colture cellulari da 25 cm2 . Un volume del terreno di 5-7 mL garantisce una copertura e una disponibilità di nutrienti sufficienti per le cellule. Assicurarsi che il terreno di coltura per i DPSC sia il Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco, integrato con il 10%-20% di siero fetale bovino (FBS) (vedere la Tabella dei materiali) per fornire i fattori di crescita necessari. Inoltre, integrare il terreno con l'1% di penicillina/streptomicina per prevenire la contaminazione batterica. Assicurarsi che le cellule siano distribuite uniformemente in tutto il pallone per favorire una crescita omogenea.
    2. Incubare il matraccio a 37 °C in un'atmosfera contenente il 5% di CO2.
  2. Variazione del fluido e confluenza di monitoraggio
    1. Cambiare il terreno di coltura ogni 2-3 giorni per fornire nutrienti freschi e rimuovere le scorie metaboliche. Per fare ciò, aspirare con cura il vecchio terreno utilizzando una pipetta sierologica sterile e sostituirlo con un terreno nuovo.
    2. Monitorare regolarmente la coltura cellulare al microscopio per monitorare la crescita delle cellule e verificare la presenza di eventuali segni di contaminazione.
    3. Continuare questo processo fino a quando le celle raggiungono l'80%-90% di confluenza, il punto in cui le celle coprono la maggior parte della superficie del pallone ma non sono eccessivamente affollate.
  3. Tripsinizzazione e passaggio o congelamento cellulare
    1. Una volta che le cellule raggiungono l'80%-90% di confluenza, rimuovere il terreno di coltura e lavare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere il terreno residuo e le cellule non aderenti.
    2. Aggiungere una soluzione di tripsina-EDTA allo 0,25% al matraccio per staccare le cellule dalla superficie del pallone. Incubare per 2-5 minuti a 37 °C fino al distacco delle cellule.
    3. Neutralizzare la tripsina aggiungendo un volume uguale di terreno di coltura, quindi pipettare delicatamente la sospensione cellulare su e giù per garantire il completo distacco delle cellule.
    4. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per pellettare le cellule.
    5. Risospendere le cellule in un terreno di coltura fresco e ripiastarle (passaggio) per un'ulteriore crescita o congelarle per un uso futuro. Durante il congelamento, utilizzare un mezzo di congelamento che contenga un crioprotettore, come il DMSO, per proteggere le cellule dai danni durante il congelamento.

5. Caratterizzazione dei DPSC

  1. Analisi di citometria a flusso
    1. Per confermare la natura delle cellule staminali mesenchimali delle cellule isolate, eseguire l'analisi di citometria a flusso22,23. Inizialmente, tripsinizzare e raccogliere le cellule come descritto nel passaggio 4.3.
    2. Determinare la vitalità cellulare mediante la tecnica di esclusione del colorante tripano. Eseguire l'analisi utilizzando un analizzatore di vitalità cellulare (vedi Tabella dei materiali) durante il 2° e l'8° passaggio. Eseguire l'analisi fenotipica tramite un citometro a flusso durante il 3° e il 7° passaggio.
    3. Dopo l'incubazione, lavare le cellule in un tampone per citometria a flusso per rimuovere gli anticorpi in eccesso e analizzare le cellule utilizzando un citometro a flusso.
      NOTA: Il tampone per citometria a flusso è composto da soluzione salina tamponata con fosfato (1x PBS), siero fetale bovino (FBS) all'1%-2% e sodio azide allo 0,1% (NaN3). L'FBS o BSA blocca il legame aspecifico degli anticorpi, mentre l'azoturo di sodio agisce come conservante. Un'alta percentuale di cellule dovrebbe esprimere i marcatori delle cellule staminali mesenchimali e mancare dei marcatori ematopoietici, confermando la loro identità come DPSC24.
    4. Staccare le DPSC e colorarle con anticorpi in immunofluorescenza per l'analisi della citometria a flusso.
      NOTA: La selezione dei marcatori per l'analisi della citometria a flusso delle cellule staminali mesenchimali (MSC) si basa sul consenso stabilito dalla Società Internazionale di Terapia Cellulare (ISCT), che afferma che le MSC dovrebbero esprimere CD105, CD73 e CD90 e non hanno l'espressione di CD45, CD34, CD14 o CD11b, CD79a o CD19 e HLA di classe II25. Questi marcatori sono comunemente usati negli studi che studiano le cellule staminali della polpa dentale26. Le concentrazioni di anticorpi per la colorazione possono variare a seconda dell'anticorpo specifico utilizzato e si raccomanda di seguire le istruzioni del produttore (vedere la Tabella dei materiali) per le diluizioni degli anticorpi e le condizioni di incubazione25.
    5. Stabilire i criteri di classificazione 27,28 per l'espressione dei marcatori CD come detto: meno del 10%, nessuna espressione; tra l'11% e il 40%, bassa espressione; un intervallo compreso tra il 41% e il 70%, espressione moderata; superiore al 71%, alta espressione.
    6. Inoltre, confermare l'assenza di marcatori ematopoietici incubando un'aliquota cellulare separata con anticorpi contro CD34 e CD45.

6. Differenziazione multilineage

NOTA: I seguenti passaggi delineano i protocolli per la differenziazione osteogenica, adipogenica e condrogenica delle cellule staminali dentali. Iniziare seminando le colture a una densità di 1 x 105 cellule per pozzetto in una piastra di coltura tissutale rivestita di fibronectina con terreno completo (CM). Monitorare la crescita cellulare fino al raggiungimento della confluenza dell'80%-90% prima di avviare il protocollo di differenziazione desiderato. Per valutare il potenziale di differenziazione multilineage delle DPSC, avviare il processo di differenziazione verso osteoblasti, adipociti e condrociti seminando le cellule in piastre a 24 pozzetti e coltivandole in terreni di differenziazione appropriati.

  1. Differenziamento osteogenico
    1. Inizia coltivando i DPSC in un terreno di coltura regolare in condizioni standard fino a raggiungere la confluenza del 70%-80%.
    2. Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule, quindi lavare le cellule una volta con 1x PBS. Aggiungere il mezzo di differenziazione osteogenico (ODM) alle cellule.
      NOTA: L'ODM è costituito da Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) integrato con il 10% di FBS, 100 unità/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina, 0,25 μg/mL di amfotericina B, 50 μg/mL di acido ascorbico, 10 mM di beta-glicerofosfato e 100 nM di desametasone (vedi Tabella dei materiali).
    3. Incubare le cellule nel terreno osteogenico a 37 °C con CO2 al 5%. Cambiare il terreno osteogenico ogni 2-3 giorni.
      NOTA: Dopo 14-21 giorni, le DPSC dovrebbero essersi differenziate in cellule simili agli osteoblasti. Ciò può essere confermato controllando un aumento dell'espressione di marcatori specifici per gli osteoblasti, come la fosfatasi alcalina, o utilizzando tecniche di colorazione per rilevare la matrice mineralizzata, come la colorazione S rosso di alizarina.
    4. Fissare le cellule incubandole con etanolo ghiacciato al 70% per 1 ora a -20 °C.
    5. Colorare le cellule fissate con una soluzione colorante 40 nM di Alizarina Rosso S (pH 4,2) a temperatura ambiente al buio per 10-15 minuti. Visualizzare la colorazione al microscopio per confermare la differenziazione osteogenica (Figura 3). Confermare la differenziazione colorando le cellule con Alizarina Red S, che identifica i depositi di calcio indicativi di mineralizzazione29,30.
  2. Differenziazione adipogenica
    1. Come descritto nella sezione precedente, i DPSC vengono coltivati in condizioni standard in un'atmosfera umidificata con il 5% di CO2 a 37 °C. Passaggio delle celle quando raggiungono circa il 70%-80% di confluenza.
    2. Aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con 1x PBS. Sostituire il mezzo di derivazione lavato con un mezzo di differenziazione adipogenico. Questo terreno è generalmente costituito da DMEM, 10% FBS, 10 μg/mL di insulina, 1 μM di desametasone, 200 μM di indometacina e 0,5 mM di IBMX (vedi Tabella dei materiali).
    3. Cambiare il mezzo di differenziazione ogni 3-4 giorni. Dopo circa 3 settimane, lavare le DPSC adipogenico-differenziate con PBS e fissarle con paraformaldeide (PFA) al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente.
    4. Colorare le cellule fissate con Oil Red O (vedi Tabella dei materiali) per visualizzare l'accumulo di goccioline lipidiche (Figura 4). Per confermare ulteriormente la differenziazione adipogenica, eseguire l'analisi dell'espressione genica di marcatori adipogenici come il recettore gamma attivato dal proliferatore dei perossisomi (PPARγ) e l'adiponectina31,32.
  3. Differenziazione condrogenica
    1. Per la differenziazione condrogenica vengono utilizzate colture di DPSC mantenute in atmosfera umidificata con il 5% di CO2 a 37 °C. Passaggio delle celle quando raggiungono circa il 70%-80% di confluenza.
    2. Aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con 1x PBS. Sostituire il terreno di derivazione condrogenico, che in genere contiene il Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ad alto contenuto di glucosio, l'1% di ITS, 100 nM di desametasone, 50 μg/mL di ascorbato-2-fosfato, 40 μg/mL di prolina e 10 ng/mL di Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3) (vedere la Tabella dei materiali).
    3. Mantenere le cellule nel mezzo di differenziazione condrogenico, cambiando il terreno ogni 2-3 giorni. Dopo circa tre settimane, le DPSC dovrebbero essersi differenziate in cellule simili ai condrociti.
    4. Fissare le cellule incubandole con paraformaldeide al 4% (PFA) per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo la fissazione, colorare le cellule con Alcian Blue (vedi Tabella dei materiali) e visualizzarle al microscopio per confermare la differenziazione condrogenica (Figura 5).
    5. Confermare la differenziazione delle DPSC in condrociti utilizzando tecniche come la colorazione con Alcian Blue per i proteoglicani o l'analisi dell'espressione genica di marcatori condrogenici come l'aggrecano, SOX9 e il collagene di tipoII 33,34.

Risultati

L'esecuzione con successo del protocollo delineato ha prodotto cellule staminali della polpa dentale (DPSC) in grado di differenziare più lignaggi, dimostrando la loro multipotenza.

Saggi di vitalità
La vitalità dei DPSC è stata valutata utilizzando un test di esclusione del Trypan Blue in vari punti temporali. I risultati mostrano una vitalità costantemente elevata (superiore al 95%) durante tutto il periodo di coltura, dimostrando la robustezza del nostro protocollo di isolamento e coltura.

Saggi dell'Unità Formante Colonie (CFU)
Sono stati condotti saggi CFU per valutare la capacità di auto-rinnovamento dei DPSC. Una sospensione a cellula singola è stata placcata a bassa densità e coltivata per 14 giorni. Le colonie formate venivano poi colorate e contate. I risultati mostrano molte colonie, indicando un'alta percentuale di cellule che si autorinnovano all'interno della popolazione DPSC.

Tempo di raddoppio delle celle
Il tempo di raddoppio delle cellule è stato calcolato in base alla curva di crescita delle DPSC. Le cellule sono state seminate a una densità specifica e contate regolarmente per costruire una curva di crescita. Il tempo di raddoppio è stato quindi calcolato utilizzando la fase di crescita esponenziale della curva. I risultati mostrano un tempo di raddoppio coerente con quello riportato per le MSC, suggerendo una popolazione cellulare sana e proliferativa (Figura 6).

Analisi di citometria a flusso
L'analisi della citometria a flusso ha mostrato che la grande maggioranza delle DPSC (ad esempio, >95%) era positiva per CD90, CD73 e CD105, confermando la loro identità come MSC (Figura 7). Inoltre, meno del 2% delle cellule era positivo per CD45, CD34 e HLA-DR, confermando l'assenza di una significativa contaminazione delle cellule ematopoietiche o endoteliali.

Differenziamento osteogenico
Al termine della differenziazione osteogenica, le cellule presentavano una matrice mineralizzata, che viene visualizzata mediante colorazione con Alizarin Red S (Figura 3). La presenza di colorazione rossa nelle cellule colorate indica la riuscita deposizione di una matrice mineralizzata, caratteristica essenziale del differenziamento osteogenico. L'incapacità di ottenere con successo la colorazione per differenziazione potrebbe essere potenzialmente collegata alle sfide affrontate durante la procedura di raccolta del campione.

Differenziazione adipogenica
Durante la differenziazione adipogenica, le DPSC hanno accumulato goccioline lipidiche, indicative di adipogenesi. Le goccioline lipidiche possono essere osservate con la colorazione Oil Red O (Figura 4). Una differenziazione riuscita ha portato a goccioline lipidiche colorate di rosso-arancio all'interno delle cellule.

Differenziazione condrogenica
Infine, dopo la differenziazione condrogenica, le DPSC hanno prodotto glicosaminoglicani, un componente critico della cartilagine confermato dalla colorazione con Alcian Blue, che si lega a questi glicosaminoglicani. Le cellule sottoposte con successo alla condrogenesi hanno mostrato una colorazione blu dopo la colorazione (Figura 5).

Le cellule che non sono riuscite a mostrare i rispettivi cambiamenti di colore nelle procedure di colorazione potrebbero essere dovute a una differenziazione non ottimale, probabilmente a causa di problemi con i mezzi di differenziazione o la qualità iniziale dei DPSC. Garantire la qualità dei terreni e degli integratori e la salute e il numero di passaggi dei DPSC utilizzati è importante. Il successo della differenziazione delle DPSC in osteoblasti, adipociti e condrociti convalida la natura multipotente di queste cellule e sottolinea il loro potenziale nella medicina rigenerativa e nelle applicazioni terapeutiche.

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Figura 1: Panoramica sull'isolamento, la caratterizzazione e la differenziazione delle cellule staminali della polpa dentale. Questa figura fornisce una rappresentazione schematica del flusso di lavoro per l'isolamento, la caratterizzazione e la differenziazione delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC). Il processo inizia con l'estrazione del dente (o dei denti), seguita dall'isolamento del tessuto pulpare, da cui derivano le DPSC. Dopo l'isolamento, le DPSC vengono sottoposte a vari test di caratterizzazione per confermare la loro identità di cellule staminali e valutarne la vitalità, il tasso di proliferazione e altri attributi chiave. La fase finale rappresentata in questo diagramma prevede l'induzione del differenziamento, in cui le DPSC vengono trattate con fattori specifici per guidare la loro trasformazione in tipi cellulari specializzati, come osteoblasti, adipociti o condrociti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Prelievo della polpa dai denti estratti. (A) Un dente estratto preparato per l'estrazione del tessuto pulpare. (B) Sezionamento del dente estratto utilizzando una fresa diamantata. (C) Rimozione del tessuto pulpare dalla camera pulpare. (D) Frammentazione del tessuto pulpare mediante lama chirurgica. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Differenziazione osteogenica delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) evidenziata dalla colorazione con Alizarin Red S (40x). La colorazione rosso vivo rivela la deposizione della matrice mineralizzata, una caratteristica degli osteoblasti, confermando il successo della differenziazione osteogenica. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Differenziazione adipogenica delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) dimostrata mediante colorazione con O rosso olio. La presenza di goccioline rosso vivo rappresenta l'accumulo di lipidi, un segno distintivo degli adipociti, confermando il successo della differenziazione adipogenica. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Differenziazione condrogenica delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) dimostrata mediante colorazione Alcian Blue (40x). Il colore blu intenso indica la presenza di una matrice extracellulare ricca di proteoglicani, caratteristica dei condrociti, che conferma il successo della differenziazione condrogenica. Barra della scala = 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Tempo di raddoppio cellulare per le cellule staminali della polpa dentale (DPSC). Questa figura illustra la curva di crescita dei DPSC nel tempo. Le cellule sono state inizialmente seminate a una densità specifica e la conta delle cellule è stata misurata a intervalli regolari (rappresentati sull'asse x) per monitorare il tasso di proliferazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 7: Espressione del marcatore di superficie delle cellule staminali in coltura DPSC. Questa figura mostra l'espressione di specifici marcatori di superficie sui DPSC. I marcatori delle cellule staminali mesenchimali CD44, CD90 e CD105 mostrano alti livelli di espressione, indicando la presenza di tratti mesenchimali in queste cellule. Al contrario, l'espressione dei marcatori ematopoietici (CD34 e CD45) e della molecola del complesso maggiore di istocompatibilità di classe II (HLA-DR) è quasi trascurabile, confermando l'assenza di cellule di linea ematopoietica nella coltura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Il protocollo delinea l'isolamento, la coltura e la caratterizzazione delle cellule staminali della polpa dentale (DPSC) da denti decidui e permanenti umani. Include una descrizione dell'immagazzinamento e della proliferazione di queste cellule, nonché la valutazione del loro potenziale di differenziazione in vitro in osteoblasti, adipociti e condrociti35.

Chen et al.36 hanno dimostrato che le cellule staminali della polpa dentale (DPSC) possono essere ottenute da varie fonti, inclusi denti umani vitali infetti afflitti da condizioni come parodontite, riassorbimento radicolare, pericoronite e fratture dei denti, nonché denti soprannumerari e disallineati. Questa scoperta è stata ulteriormente corroborata da studi successivi che hanno identificato i denti vitali infetti come potenziali fonti di DPSC 37,38,39,40. Tuttavia, Bernardi et al.10 hanno sottolineato che un aumento del riassorbimento radicale potrebbe influire negativamente sulla vitalità di queste cellule staminali. Un ostacolo significativo nel processo è la conservazione delle cellule e la prevenzione della loro degradazione, che inizia immediatamente dopo l'estrazione o l'esfoliazione del dente. Inoltre, è importante notare che i denti affetti da condizioni gravi come ascessi periapicali, tumori o cisti non dovrebbero essere utilizzati per estrarre le cellule staminali40,41.

Le DPSC possono essere ottenute attraverso la tecnica della digestione enzimatica (ED) o il metodo della crescita da espianti tissutali (OG), noto anche come tecnica di crescita spontanea14,15. I ricercatori utilizzano queste strategie per studiare l'efficienza della proliferazione cellulare o il mantenimento degli attributi morfologici e fenotipici delle cellule staminali isolate17. Gli studi hanno scoperto che le cellule staminali isolate con il metodo OG mostrano un tasso di proliferazione più lento e un'espressione più debole dei marcatori delle cellule staminali18. Al contrario, le DPSC isolate attraverso il metodo ED hanno dimostrato una proliferazione, una differenziazione e una maggiore espressione più rapide di marcatori di superficie aggiuntivi rispetto a quelle isolate con il metodo OG. È interessante notare che le cellule staminali immature della polpa dentale (IDPSC) estratte dai denti decidui utilizzando la tecnica OG hanno dimostrato che la coltura cellulare incoraggia la proliferazione selettiva delle IDPSC, prevenendo così la differenziazione precoce42.

La purificazione delle DPSC è fondamentale per ottenere cellule altamente rigenerative e richiede specifici marcatori cellulari. La selezione cellulare viene eseguita utilizzando metodi di selezione cellulare a fluorescenza o attivati magneticamente. Oltre ai suddetti marcatori, vengono utilizzati anche numerosi altri antigeni di superficie a causa della natura eterogenea delle DSC43. Tuttavia, non è stato identificato un singolo marcatore per segregare le sottopopolazioni.

Rispetto alle cellule staminali mesenchimali derivate dal midollo osseo, le DPSC sono state riconosciute come una fonte promettente di cellule multipotenti grazie al loro potenziale multilineage44. Questa staminalità è probabilmente il risultato della relativa immaturità dei tessuti di origine, poiché i denti del giudizio, spesso la fonte dell'estrazione delle DPSC, sono gli ultimi denti permanenti a svilupparsi e sono quindi meno maturi del midollo osseo45. Questo protocollo esplora con successo la natura multipotente delle cellule staminali della polpa dentale inducendo queste cellule a subire adipogenesi, osteogenesi e condrogenesi. In particolare, le DPSC sono l'unico tipo di cellula che sovraregola l'espressione di DSPP quando coltivate in condizioni osteogeniche, indicativo della loro futura differenziazione in odontoblasti46.

Le cellule staminali dentali, isolate da varie fonti, mostrano molti potenziali di proliferazione e differenziazione47. I significativi progressi compiuti nei sistemi in vitro hanno avuto un profondo impatto sulla biologia e sulle terapie delle cellule staminali. Nonostante questi progressi, permangono sfide nella traduzione delle terapie con cellule staminali dal laboratorio al letto del paziente. Particolare attenzione deve essere prestata alla sopravvivenza e alla stabilità delle cellule staminali per garantire che le tecniche di conservazione non compromettano la vitalità di tali cellule. Sebbene la ricerca sulle cellule staminali dentali abbia prodotto risultati promettenti in modelli animali, vi è un urgente bisogno di estendere questi risultati agli studi sull'uomo. Continuando a guidare una ricerca e uno sviluppo rigorosi, le cellule staminali dentali sono pronte a svolgere un ruolo sostanziale nel progresso del campo della banca delle cellule staminali.

Sebbene ampiamente utilizzato, l'approccio della digestione enzimatica per isolare le cellule staminali della polpa dentale (DPSC) presenta diverse limitazioni. Innanzitutto, il processo può compromettere la vitalità cellulare, poiché enzimi come la collagenasi e la dispasi possono inavvertitamente danneggiare le membrane cellulari, producendo meno cellule staminali vive17. Inoltre, questo metodo spesso provoca la degradazione della matrice extracellulare vitale (ECM), che è fondamentale per preservare le proprietà intrinseche delle cellule staminali48. La procedura può anche alterare i marcatori della superficie cellulare, ostacolando l'identificazione e la caratterizzazione accurate delle DPSC43. Al di là di questi vincoli biologici, l'approccio richiede molto tempo, aumentando i rischi di contaminazione microbica dovuti a incubazioni prolungate a 37 °C. Inoltre, l'incoerenza tra i lotti di enzimi può portare a risultati variabili, mettendo a dura prova la riproducibilità della procedura di isolamento. L'onere finanziario non può essere trascurato, poiché gli enzimi di alta qualità adatti alla digestione dei tessuti sono costosi49. Inoltre, le conseguenze della digestione potrebbero vedere un'attività enzimatica residua che potrebbe influenzare negativamente le colture cellulari, influenzandone la salute, la proliferazione e la differenziazione. Infine, il potenziale della digestione enzimatica di isolare preferenzialmente alcune sottopopolazioni di DPSC rispetto ad altre potrebbe inavvertitamente distorcere il pool cellulare risultante, influenzando il loro potenziale terapeutico50.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori sono grati al Dr. Mathew Mazhavancheril, direttore e capo del Centro di ricerca Pushpagiri a Thiruvalla, per il suo supporto nella documentazione delle procedure presso il Centro di ricerca.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3-isobuty-l-metil-xantina Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Acido acetico Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Blu Alciano Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Soluzione colorante rosso alizarinaSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Fosfatasi alcalina -Kit di colorazioneThermo Fisher Scientific, MA 02451, USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USAGibco
Alpha Minimo Essenziale Mezzo (α-MEM) Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USAGibco
Alpha-MEM, o Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific, MA 02451, USAGibco
Alpha-MEM, o Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific, MA 02451, USAGibco
Antibiotic/AntimicoticSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Ascorbato-2-fosfatoSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-glicerofosfato Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Cabina di biosicurezza-Cappa a flusso laminareLabconco Corporation, MO 64132-2696, USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45 e HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121, USA
Filtro cellulare (70 & micro; m )Laboratori HiMedia  Ltd.Mumbai, IndiaTCP025Filtro cellulare
CentrifugaREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrifugaHiMedia Laboratories Ltd.Mumbai,India1101 | 1102
CO2 IncubatoreThermo Fisher Scientific, MA 02451, USA
Collagenasi tipo IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Collagenasi tipo IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Mezzo di crescita completoHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndiaAT006DMEM
Provette coniche (15 o 50Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P / 546041P15 mL e 50 ml
Contenitore per congelamento criogenicoThermo Fisher Scientific, MA 02451, USA15-350-50
Etichetta criogenicaIndia:
scatole di conservazione crioviale di conservazione Cryostore
CryovialsThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAPW1282Fiaschetta di coltura autoportante
(25 cm²)Corning Inc.NY 14831, Stati Uniti d'America
Fiasche di colturaHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndiaTCG4 / TCG6T25 / T75
Piastre di colturaHiMedia Laboratories Ltd.Mumbai, IndiaTCP129/TCP00860 mm/100 mm
Dischi diamantati dentaliKomet SC 29730, USAKomet 
Cucchiaio dentale escavatoreBrasseler, GA 31419, USA5023591U0
DesametasoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DesametosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DesametosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimetil solfossido (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics, Mannheim, Germania.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germania
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA
Etanolo (70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndiaMB106
Etanolo -70%Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USAPinze di estrazione Fisher Scientific
.Dentsply Sirona, USA
Siero fetale bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Siero fetale bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Siero fetale bovino (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaRM9954
Siero fetale bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Siero fetale bovino (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Piastra di coltura tissutale rivestita di fibronectinaCorning Inc.Corning, NY 14831,USA
Citometro a flussoBD Biosciences,CA 95131,USA
tampone per citometria a flussoBD Biosciences,CA 95131,USA
Vetrino coprioggetto 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai, IndiaTCP017
Soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS)Lonza Group Ltd, 4002 Basilea, Svizzera
Manipolo dentale ad alta velocità NSK Ltd, Tokyo 8216, Giapponeserie Ti-Max Z
Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USA
IBMX, o 3-isobutil-1-metilxantinaSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
IndometacinaPfizer Inc. NY 10017, USA
Insulina-transferrina-selenio (ITS)Thermo Fisher Scientific, MA 02451, USAI5523
Insulina-transferrina-selenio (ITS)Thermo Fisher Scientific, MA 02451,USAI5523
Premiscela di insulina-transferrina-selenio (ITS)Corning Incorporated,MA 01876,USA
Microscopio invertitoOlympus Corp.,Tokyo 163-0914,Giappone
Isopropanolo (60%)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Alcool isopropilico Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Cappa a flusso laminareThermo Fisher Scientific, MA 02451, USA
Lidocaina miscelata con epinefrinaDENTSPLY, NC 28277, USACitanest
Azoto liquidoAir Liquide, 75007 Parigi, Francia
Serbatoio di stoccaggio di azoto liquidoCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MicropipetteEppendorf AG,22339 Amburgo,Germania30020Accupipet-2-20 &; micro; L
Mini trituratore di tessutiBio-Rad Lab, Inc. CA 94547, USAMini smerigliatrici ReadyPrep
Meno 80 congelatoreBlue Star Limited
Neubauer camera di conteggioMarienfeld Superior, arktheidenfeld, Germania
Olio rosso O macchiaSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Mezzo di differenziazione osteogenica (ODM) STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, BC, V5Z 1B3, Canada
Paraformaldeide (PFA) Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Penicillina-StreptomicinaGibco-Thermo Fisher Scientific Inc., MA 02451, USA
Soluzione tamponata con fosfato (PBS) senza Ca++ e Mg++HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTS1101
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, USA
Soluzione salina tamponata con fosfato Gibco (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Thermo Fisher Scientific, MA, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7,4
Prolina Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Lama per bisturi Misura 15 Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ, REGNO UNITOBDF-6955C
Ipoclorito di sodioHiMedia Laboratories Ltd.Mumbai, IndiaAS1024% w/v soluzione
Provette da centrifuga steriliTarsons Products Pvt. Ltd.
Contenitore sterile -20 mL3M Center, MN 55144-1000,USA3 M
Soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS)Sigma Aldrich, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7.4
Pipette sterili (2, 5 e 10 mLEppendorf AG,22339 Amburgo,Germania
Pipette e puntali steriliEppendorf India Limited
Surgical Blade ManigliaBecton, Dickinson and Co.,NJ,USA371030BP Maniglia 3
Fattore di crescita trasformante-beta 3 (TGF-β 3)R & D Systems, Inc.MN 55413, USA
Fattore di crescita trasformante-beta 3 (TGF-β 3)R & D Systems, Inc.MN 55413, USA
Trypan Blue 0.4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Blu Tripano 0,4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Blu Tripano 0,4% Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Tripsina-EDTA Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Tripsina-EDTA 0,25%Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Bagno d'acquaThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USABSW-01D
) Scatole Siero di cavallo )

Riferimenti

  1. Bakopoulou, A., About, I. Stem cells of dental origin: current research trends and key milestones towards clinical application. Stem Cells International. 2016, 4209891(2016).
  2. Yamada, Y., Nakamura-Yamada, S., Konoki, R., Baba, S. Promising advances in clinical trials of dental tissue-derived cell-based regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 175(2020).
  3. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  4. Bissels, U., Diener, Y., Eckardt, D., Bosio, A. Regenerative medicine-from protocol to patient. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. 1-25 (2016).
  5. Hyun, I. The bioethics of stem cell research and therapy. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 71-75 (2010).
  6. Ledesma-Martinez, E., Mendoza-Nunez, V. M., Santiago-Osorio, E. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem Cells International. 2016, 4709572(2016).
  7. Egusa, H., Sonoyama, W., Nishimura, M., Atsuta, I., Akiyama, K. Stem cells in dentistry--part I: stem cell sources. Journal of Prosthodontic Research. 56 (3), 151-165 (2012).
  8. Galler, K. M., Eidt, A., Schmalz, G. Cell-free approaches for dental pulp tissue engineering. Journal of Endodontics. 40, 41-45 (2014).
  9. Smith, A. J., Patel, M., Graham, L., Sloan, A. J., Cooper, P. R. Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling. Oral Biosciences & Medicine. 2, 127-132 (2005).
  10. Bernardi, L., et al. The isolation of stem cells from human deciduous teeth pulp is related to the physiological process of resorption. Journal of Endodontics. 37 (7), 973-979 (2011).
  11. Saha, R., Tandon, S., Rajendran, R., Nayak, R. Dental pulp stem cells from primary teeth quality analysis: laboratory procedures. Journal of Clinical Pediatric Dentistry. 36 (2), 167-173 (2011).
  12. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  13. Ferro, F., Spelat, R., Beltrami, A. P., Cesselli, D., Curcio, F. Isolation and characterization of human dental pulp derived stem cells by using media containing low human serum percentage as clinical grade substitutes for bovine serum. PLoS One. 7 (11), 48945(2012).
  14. Spath, L., et al. Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1635-1644 (2010).
  15. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  16. Takeda-Kawaguchi, T., et al. Derivation of iPSCs after culture of human dental pulp cells under defined conditions. PLoS One. 9 (12), 115392(2014).
  17. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  18. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from permanent teeth by using two different methods. Journal of Visualized Experiments. (69), e4372(2012).
  19. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC Biotechnology. 15, 114(2015).
  20. Perry, B. C., et al. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (2), 149-156 (2008).
  21. Zainuri, M., Putri, R. R., Bachtiar, E. W. Establishing methods for isolation of stem cells from human exfoliated deciduous from carious deciduous teeth. Interventional Medicine & Applied Science. 10 (1), 33-37 (2018).
  22. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  23. Nakayama, H., Iohara, K., Hayashi, Y., Okuwa, Y., Kurita, K., Nakashima, M. Enhanced regeneration potential of mobilized dental pulp stem cells from immature teeth. Oral Diseases. 23 (5), 620-628 (2017).
  24. Cunningham, R. E. Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells. Methods in Molecular Biology. 588, 335-339 (2010).
  25. Zimmerlin, L., Donnenberg, V. S., Rubin, J. P., Donnenberg, A. D. Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells. Cytometry A. 83 (1), 134-140 (2013).
  26. Alansary, M., Drummond, B., Coates, D. Immunocytochemical characterization of primary teeth pulp stem cells from three stages of resorption in serum-free medium. Dental Traumatology. 37 (1), 90-102 (2021).
  27. Lei, T., Zhang, X., Du, H. Characteristics, classification, and application of stem cells derived from human teeth. Stem Cells International. 2021, 8886854(2021).
  28. Kalina, T., et al. CD Maps-dynamic profiling of CD1-CD100 surface expression on human leukocyte and lymphocyte subsets. Frontiers in Immunology. 10, 2434(2019).
  29. Luzuriaga, J., et al. Osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in decellularised adipose tissue solid foams. European Cells & Materials eCM. 43, 112-129 (2022).
  30. Volponi, A. A., Gentleman, E., Fatscher, R., Pang, Y. W., Gentleman, M. M., Sharpe, P. T. Composition of Mineral Produced by Dental Mesenchymal Stem Cells. Journal of Dental Research. 94 (11), 1568-1574 (2015).
  31. Nozaki, T., Ohura, K. Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage. Journal of Pharmacological Sciences. 115 (3), 354-363 (2011).
  32. Kobayashi, T., Torii, D., Iwata, T., Izumi, Y., Nasu, M., Tsutsui, T. W. Characterization of proliferation, differentiation potential, and gene expression among clonal cultures of human dental pulp cells. Human Cell. 33 (3), 490-501 (2020).
  33. Westin, C. B., Trinca, R. B., Zuliani, C., Coimbra, I. B., Moraes, A. M. Differentiation of dental pulp stem cells into chondrocytes upon culture on porous chitosan-xanthan scaffolds in the presence of kartogenin. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 80, 594-602 (2017).
  34. Rizk, A., Rabie, A. B. Human dental pulp stem cells expressing transforming growth factor beta3 transgene for cartilage-like tissue engineering. Cytotherapy. 15 (6), 712-725 (2013).
  35. Anil, S., Ramadoss, R., Thomas, N. -G., George, J. -M., Sweety, V. -K. Dental pulp stem cells and banking of teeth as a lifesaving therapeutic vista. Biocell. 47 (1), 71-80 (2023).
  36. Chen, Y. K., Huang, A. H., Chan, A. W., Shieh, T. Y., Lin, L. M. Human dental pulp stem cells derived from different cryopreservation methods of human dental pulp tissues of diseased teeth. Journal of Oral Pathology & Medicine. 40 (10), 793-800 (2011).
  37. Pereira, L. O., et al. Comparison of stem cell properties of cells isolated from normal and inflamed dental pulps. International Endodontic Journal. 45 (12), 1080-1090 (2012).
  38. Malekfar, A., Valli, K. S., Kanafi, M. M., Bhonde, R. R. Isolation and characterization of human dental pulp stem cells from cryopreserved pulp tissues obtained from teeth with irreversible pulpitis. Journal of Endodontics. 42 (1), 76-81 (2016).
  39. Werle, S. B., et al. Carious deciduous teeth are a potential source for dental pulp stem cells. Clinical Oral Investigations. 20 (1), 75-81 (2016).
  40. Tsai, A. I., et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human deciduous teeth pulp. Biomed Research International. 2017, 2851906(2017).
  41. Paglia, L. Stem cells, a resource for patients and dentists. European Archives of Paediatric Dentistry. 17 (2), 89(2016).
  42. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  43. Rodas-Junco, B. A., Villicana, C. Dental pulp stem cells: current advances in isolation, expansion and preservation. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 333-347 (2017).
  44. Shi, S., Robey, P. G., Gronthos, S. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. 29 (6), 532-539 (2001).
  45. Mortada, I., Mortada, R. Dental pulp stem cells and osteogenesis: an update. Cytotechnology. 70 (5), 1479-1486 (2018).
  46. Pagella, P., Neto, E., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Investigation of orofacial stem cell niches and their innervation through microfluidic devices. European Cells & Materials eCM. 29, 213-223 (2015).
  47. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417702531(2017).
  48. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica (Praha). 65 (3), 124-133 (2019).
  49. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, A., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  50. Ducret, M., et al. Manufacturing of dental pulp cell-based products from human third molars: current strategies and future investigations. Frontiers in Physiology. 6, 213(2015).

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