Sviluppo e caratterizzazione di idrogel di matrice extracellulare polmonare decellularizzata

Summary

Il protocollo chiarisce due distinte metodologie di decellularizzazione applicate ai tessuti polmonari bovini nativi, fornendo un resoconto completo delle rispettive caratterizzazioni.

Abstract

L'uso di idrogel derivati dalla matrice extracellulare (ECM) nell'ingegneria tissutale è diventato sempre più popolare, in quanto possono imitare l'ambiente naturale delle cellule in vitro. Tuttavia, mantenere il contenuto biochimico nativo dell'ECM, raggiungere la stabilità meccanica e comprendere l'impatto del processo di decellularizzazione sulle proprietà meccaniche degli idrogel dell'ECM sono impegnativi. In questo studio, sono stati descritti una pipeline per la decellularizzazione del tessuto polmonare bovino utilizzando due diversi protocolli, la caratterizzazione a valle dell'efficacia della decellularizzazione, la fabbricazione di idrogel ECM polmonari decellularizzati ricostituiti e la valutazione delle loro proprietà meccaniche e di citocompatibilità. La decellularizzazione del polmone bovino è stata perseguita utilizzando un metodo fisico (cicli di gelo-disgelo) o chimico (a base di detergenti). La colorazione con ematossilina ed eosina è stata eseguita per convalidare la decellularizzazione e la ritenzione dei principali componenti dell'ECM. Per la valutazione del contenuto residuo di collagene e glicosaminoglicani solfatati (sGAG) all'interno dei campioni decellularizzati, sono state impiegate rispettivamente le tecniche di colorazione del rosso Sirio e del blu Alciano. Le proprietà meccaniche degli idrogel ECM polmonari decellularizzati sono state caratterizzate dalla reologia oscillatoria. I risultati suggeriscono che gli idrogel polmonari bovini decellularizzati possono fornire un'alternativa organotipica affidabile ai prodotti ECM commerciali, conservando la maggior parte dei componenti nativi dell'ECM. Inoltre, questi risultati rivelano che il metodo di decellularizzazione scelto influisce in modo significativo sulla cinetica di gelificazione, nonché sulla rigidità e sulle proprietà viscoelastiche degli idrogel risultanti.

Introduction

Le condizioni convenzionali di coltura monostrato non offrono una rappresentazione fedele dei microambienti tissutali nativi e non sono in grado di fornire un'impalcatura tridimensionale (3D) con ligandi istruttivi che consentano le interazioni cellula-matrice e cellula-cellula¹. La composizione della matrice extracellulare (ECM) e le proprietà meccaniche sono altamente tessuto-specifiche, tempo-dipendenti e subiscono alterazioni in condizioni patologiche. Pertanto, c'è bisogno di modelli tissutali 3D biomimetici che consentano la sintonizzabilità di tali caratteristiche, la modulazione del comportamento cellulare e il raggiungimento della funz....

Protocol

I polmoni autoctoni freschi di giovani (1-2 anni) donatori bovini sono stati ottenuti da un macello locale e trasportati in un contenitore di plastica sigillato su ghiaccio al laboratorio. Il sacrificio animale viene eseguito per il consumo generale di carne (polmoni scartati come rifiuti) e non è correlato o dovuto allo studio. Confermiamo che il macello è conforme alle leggi e ai regolamenti nazionali in materia di sacrifici animali. Inoltre, confermiamo di aver utilizzato solo materiale di scarto e che il progetto di ricerca non ha influito sul numero di animali sacrificati.

1. Prelievo di organi e preparazione dei tessuti....

Results

Decellularizzazione
La decellularizzazione del tessuto polmonare bovino per produrre idrogel dECM che ricapitolerebbero il microambiente polmonare nativo è stata ottenuta sia con metodi fisici (congelamento-disgelo) che chimici (Triton-X-100). Dopo la dissezione, i pezzi di tessuto sono stati lavati in antibiotici contenenti dH₂O per rimuovere gli agenti patogeni che possono successivamente influenzare la sterilità degli idrogel dECM. Un totale di cinque cicli alternati tra azoto liquido e .......

Discussion

Gli idrogel derivati da organi sono diventati modelli promettenti che ricapitolano l'ECM tissutale nativa e imitano la funzione cellulare organotipica. Sebbene l'ECM polmonare decellularizzata sia stata spesso utilizzata nell'ingegneria tissutale, una caratterizzazione approfondita della composizione del biomateriale e delle proprietà meccaniche favorirà una migliore comprensione di come le interazioni cellula-ECM possono essere modulate per modellare i processi biologici durante l'omeostasi o la malattia. In particolare.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Etanolo assoluto	ISOLAB	64-17-5
Acido acetico	ISOLAB	64-19-7
Soluzione di blu alciano	Sigma-Aldrich	B8438
Desossiribonucleasi I da pancreas bovino	Sigma-Aldrich	DN25
Reometro Discovery HR-2	TA Instruments
Mezzo di montaggio Entellan	Merck	107960
Soluzione di eosina	Bright-slide	2.BS01-105-1000
microscopia elettronica	formaldeide	50-980-485
Acido cloridrico	Merck	100317
Iodio	Sigma-Aldrich	3002
Cloruro di magnesio	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Soluzione colorante per ematossilina di Mayer	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T	compound Tissue-Tek	4583
Penicillina/Streptomicina	Biowest	L0018-100
Pepsina da mucosa gastrica suina	Sigma-Aldrich	P6887
Acido picrico	Polysciences	88-89-1
Rosso	SirioPolysciences	09400-25
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich	S5881
Saccarosio	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298