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Articolo metodologico

Metodologia per inattivare metabolicamente i batteri per la ricerca su Caenorhabditis elegans

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DOI:

10.3791/65775

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28 luglio 2023

 ,  ,  ,  , 
1Molecular and Integrative Physiology Department, University of Michigan, Ann Arbor, 2Department of Internal Medicine, University of Michigan, Ann Arbor

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

La fonte di cibo per Caenorhabditis elegans in laboratorio è l'Escherichia coli vivo. Poiché i batteri sono metabolicamente attivi, presentano una variabile confondente negli studi metabolici e farmacologici in C. elegans. Un protocollo dettagliato per inattivare metabolicamente i batteri utilizzando la paraformaldeide è descritto qui.

Abstract

Caenorhabditis elegans è un organismo modello comune per la ricerca in genetica, sviluppo, invecchiamento, metabolismo e comportamento. Poiché i C. elegans consumano una dieta a base di batteri vivi, l'attività metabolica della loro fonte di cibo può confondere gli esperimenti che cercano gli effetti diretti di vari interventi sul verme. Per evitare gli effetti confondenti del metabolismo batterico, i ricercatori di C. elegans hanno utilizzato diversi metodi per inattivare metabolicamente i batteri, tra cui l'irradiazione ultravioletta (UV), l'uccisione del calore e gli antibiotici. Il trattamento UV è relativamente a bassa produttività e non può essere utilizzato in coltura liquida perché ogni piastra deve essere esaminata per verificare il successo dell'abbattimento batterico. Un secondo metodo di trattamento, l'uccisione termica, influisce negativamente sulla consistenza e sulla qualità nutrizionale dei batteri, portando all'arresto dello sviluppo di C. elegans. Infine, il trattamento antibiotico può alterare direttamente la fisiologia di C. elegans oltre a prevenire la crescita batterica. Questo manoscritto descrive un metodo alternativo per inattivare metabolicamente i batteri utilizzando la paraformaldeide (PFA). Il trattamento con PFA lega in modo incrociato le proteine all'interno delle cellule batteriche per prevenire l'attività metabolica preservando la struttura cellulare e il contenuto nutrizionale. Questo metodo è ad alta produttività e può essere utilizzato in coltura liquida o in piastre solide, poiché l'analisi della crescita di una piastra di batteri trattati con PFA convalida l'intero lotto. L'inattivazione metabolica attraverso il trattamento con PFA può essere utilizzata per eliminare gli effetti confondenti del metabolismo batterico sugli studi sull'integrazione di farmaci o metaboliti, sulla resistenza allo stress, sulla metabolomica e sul comportamento in C. elegans.

Introduzione

Caenorhabditis elegans è stato originariamente proposto come organismo modello nel 19651 e da allora è stato ampiamente adottato negli studi di genetica, sviluppo, comportamento, invecchiamento e metabolismo2. Grazie alle grandi dimensioni della covata e alla cuticola trasparente, C. elegans è particolarmente adatto per lo screening ad alto rendimento con reporter fluorescenti3. Il loro breve ciclo di vita, la riproduzione ermafrodita e l'omologia genetica con l'uomo rendono C. elegans un prezioso sistema modello per gli studi sullo sviluppo4 e sulla biologia dell'invecchiamento5. Inoltre, i C. elegans sono relativamente facili da mantenere. I vermi possono essere coltivati in coltura liquida o su piastre di agar solide e consumano una dieta a base di batteri vivi Escherichia coli OP504.

Tuttavia, la fonte di cibo vivo di C. elegans può confondere gli studi sul metabolismo, l'integrazione di farmaci e il comportamento. Poiché i batteri vivi hanno un proprio metabolismo, le condizioni sperimentali che influenzano i batteri alterano anche i nutrienti e i metaboliti disponibili per i vermi. Ad esempio, le differenze nelle concentrazioni di ferro batterico, amminoacidi e folati hanno effetti diversi sullo sviluppo, sulla fisiologia e sulla durata della vitadi C. elegans 6. Molte pratiche di laboratorio comuni possono provocare tali cambiamenti nella composizione dei nutrienti e nei metaboliti prodotti da OP50. In particolare, l'esposizione alla 5-fluoro-2'-deossiuridina (FUdR), un composto comunemente usato per prevenire la riproduzione in C. elegans, provoca ampi cambiamenti nell'espressione genica OP50, comprese le vie di biosintesi degli amminoacidi7. I batteri vivi possono anche confondere gli studi in cui C. elegans sono integrati con piccole molecole perché i batteri possono metabolizzare parzialmente o completamente i composti attivi. Inoltre, gli effetti di queste piccole molecole sui batteri possono, a loro volta, alterare la fisiologia di C. elegans, come è stato riportato con il farmaco che prolunga la durata della vita metformina8. Infine, i batteri vivi possono modificare l'ambiente del verme in modi che ne alterano il comportamento, come la secrezione di odoranti attraenti9, la produzione di neuromodulatori esogeni10 e la creazione di gradienti di ossigeno in un prato denso di batteri11.

Per mitigare gli effetti confondenti del metabolismo batterico sulla ricerca su C. elegans , sono stati sviluppati diversi metodi per uccidere i batteri (Tabella 1). Tre strategie comuni per uccidere l'OP50 sono l'irradiazione UV, l'uccisione del calore e il trattamento antibiotico. Sebbene semplici e relativamente a basso costo, ognuno di questi metodi può avere effetti indesiderati sia sui batteri che su C. elegans. L'eliminazione dei raggi UV tramite un reticolante UV12 è a bassa produttività e la velocità è limitata dal numero di piastre che possono essere inserite nel reticolante UV. Inoltre, l'efficacia dell'uccisione UV può variare da piastra a piastra all'interno di un lotto e i test per la crescita su tutte le piastre possono diventare difficili in esperimenti di grandi dimensioni. L'eliminazione del calore dell'OP50 esponendo la coltura a temperature di >60 °C comporta una serie di sfide separate. Il calore elevato può danneggiare i nutrienti essenziali per il verme e distruggere la struttura cellulare dei batteri, creando una consistenza più morbida che riduce la quantità di tempo che i vermi trascorrono sul cibo13. Inoltre, questo metodo non può essere utilizzato durante tutto il ciclo di vita di C. elegans perché i vermi alimentati con batteri uccisi dal calore possono arrestarsi all'inizio dello sviluppo13. Il trattamento antibiotico è un terzo metodo comune per sopprimere il metabolismo batterico14, ma gli antibiotici possono anche alterare la crescita e il metabolismo dei vermi15.

Una soluzione per eliminare gli effetti metabolici dei batteri vivi preservando la struttura batterica e i nutrienti essenziali è uccidere l'OP50 con la paraformaldeide (PFA)16. Il PFA è un polimero di formaldeide in grado di reticolare le proteine all'interno delle cellule17 per prevenire la replicazione batterica senza distruggere le strutture cellulari interne come la membrana plasmatica interna18. A causa di questa conservazione della struttura cellulare interna, i batteri trattati con PFA non mostrano crescita o attività metabolica, ma rimangono una fonte di cibo commestibile e ricca di sostanze nutritive per C. elegans16. Qui viene fornito un protocollo dettagliato che mostra come inattivare metabolicamente i batteri utilizzando la paraformaldeide.

MetodoMateriali richiestiScalabile?Nutritivo?Effetti su Worm?
UVreticolante UVLimitato da:SìEffetti variabili sulla durata della vita su NGM12, 23, 24
Numero di piastre che si adattano al reticolante UVEffetti variabili sulla durata della vita su FUdR24, 26, 27
Tempo di irradiazione per piastraDiminuzione delle preferenze alimentari16
Capacità di controllare la crescita di ogni piastra8
Caloreincubatore >60 °CSìNo: distrugge la parete cellulare, diminuisce il valore nutrizionaleArresto dello sviluppo 13
Diminuzione delle preferenze alimentari13
Prolunga la durata di NGM31
AntibioticiAntibiotici (kanamicina, carbenicillina, ecc.)SìSìRitarda la crescita e lo sviluppo15
Prolunga la durata in mezzi liquidi19
Prolunga la durata di vita di NGM15
PFA0,5% ParaformaldeideSìSìDiminuzione delle dimensioni della covata piccola16
Piccolo aumento dei tempi di sviluppo16
Diminuzione delle preferenze alimentari16

Tabella 1. Confronti di metodi per uccidere OP50. L'uccisione dei raggi UV, l'uccisione del calore, il trattamento antibiotico e il trattamento PFA hanno vari effetti sullo stato nutrizionale dei batteri e sulla salute dei vermi nutriti con batteri trattati. Questi metodi per l'inattivazione replicativa di E. coli differiscono anche per i materiali richiesti e la scalabilità.

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Protocollo

1. Inoculazione di batteri

  1. Preparare il brodo Luria (LB) sciogliendo 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di cloruro di sodio (NaCl) in 950 ml di acqua distillata.
  2. Regolare il pH del LB a 7,0 aggiungendo idrossido di sodio (NaOH) 5M. Questo dovrebbe richiedere solo circa 0,2 mL di NaOH.
  3. Sterilizzare in autoclave il terreno LB a pH regolato su un ciclo liquido per 45 minuti a 15 psi. Lasciare raffreddare la soluzione e conservarla a temperatura ambiente.
  4. Inoculare una singola colonia di batteri in 100 mL di LB in un pallone di Erlenmeyer da 500 mL. Coltivare i batteri per una notte in un incubatore shaker a 37 °C.
  5. A seconda dello stato di salute della colonia batterica, delle dimensioni del pallone e della velocità impostata sull'agitatore, il tempo necessario alla crescita dei batteri può variare. Dopo ~14 ore, controllare la densità ottica (OD) dei batteri a 600 nm (OD600).
  6. Rimuovere i batteri dall'agitatore quando l'OD600 è 3.0 (1 x 109 unità formanti colonie (CFU)/mL). Se il diametro esterno600 è inferiore a 3,0, rimettere il pallone nell'incubatore agitatore fino a raggiungere il diametro esterno desiderato.
  7. Aliquotare i batteri in provette coniche da 50 mL e conservare a 4 °C o procedere alla fase successiva.

2. Lavorare con la paraformaldeide

NOTA: La concentrazione di paraformaldeide (PFA) utilizzata e la durata dell'esposizione possono variare leggermente a seconda del clima, della posizione e del tipo di batteri trattati. Un buon punto di partenza per OP50 è l'esposizione allo 0,5% di PFA per 1 ora, mentre lo 0,25% di PFA per 1 ora può essere sufficiente per HT115.

  1. Preparare una scorta di PFA al 32% o utilizzare una soluzione di PFA al 32% acquistata in commercio. Utilizzare dispositivi di protezione individuale (DPI) adeguati quando si lavora con PFA. Indossare guanti e proteggere gli occhi.
  2. Aggiungere PFA all'interno di una cappa chimica con un'adeguata ventilazione. Smaltire i lavaggi e le punte contenenti PFA in appositi contenitori per rischi chimici nella cappa aspirante.

3. Trattamento batterico con paraformaldeide

  1. Una volta che i batteri raggiungono un OD600 di 3,0, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire 50 mL in un nuovo matraccio Erlenmeyer da 250 mL. Conservare il resto per un controllo in tempo reale, un controllo con trattamento simulato (vedere il passaggio 4) o per trattare anche con PFA, se necessario.
  2. Evitare di versare da un pallone all'altro e fare attenzione a non spruzzare i lati del nuovo pallone con i batteri. Le colonie sul lato del pallone possono ricevere una dose inferiore di PFA.
  3. Nella cappa chimica, aggiungere 781 μL di PFA al 32% a 50 mL di batteri per portare la concentrazione finale allo 0,5%. Smaltire la punta utilizzata in un contenitore per rifiuti solidi a rischio chimico.
  4. Coprire il pallone con un foglio di alluminio e rimetterlo nell'incubatore agitatore a 37 °C per 1 ora. Dopo 1 ora, rimuovere il pallone dall'incubatrice e procedere al punto 5.

4. Controllo con trattamento simulato

  1. Una volta che i batteri raggiungono un OD600 di 3,0, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire 50 mL di batteri in una provetta conica da 50 mL.
  2. Procedere al passaggio 5.3 per completare le fasi di lavaggio in modo simile al gruppo trattato con PFA.

5. Lavaggio dei batteri per rimuovere i residui di PFA

  1. Nella cappa chimica, utilizzare una pipetta sierologica per trasferire i batteri trattati dal matraccio di Erlenmeyer a una provetta conica da 50 ml. L'uso di una pipetta sierologica invece di versare i batteri impedirà la contaminazione da eventuali colonie batteriche sul bordo del pallone che potrebbero aver evitato il trattamento diretto con PFA.
  2. Centrifugare i batteri trattati a circa 3000 x g per 20 min. Rimuovere il surnatante gettandolo in un contenitore per rifiuti liquidi pericolosi nella cappa chimica.
  3. Aggiungere 25 mL di LB e vortice per risospendere il pellet batterico (il riempimento completo del tubo rende più difficile la risospensione del pellet). Ripetere la centrifugazione e la risospensione del pellet 4 volte.
  4. Risospendere il pellet in volumi ottimali per diversi saggi. Per i saggi sulla durata della vita, seminare piastre da 60 mm con 200 μL di batteri risospesi in 10 mL di LB. La risospensione dei batteri in 10 mL di LB si traduce in una concentrazione 5x rispetto alla coltura originale da 50 mL.
  5. Conservare i batteri a 4 °C.

6. Controllo di qualità della crescita batterica

  1. Dopo il lavaggio finale e la risospensione, strisciare una piastra LB (utilizzando un puntale sterile per pipetta) con i batteri preparati. È buona norma striare anche il LB utilizzato per il lavaggio e la risospensione su una piastra separata per assicurarsi che il LB utilizzato non sia contaminato.
  2. Mettere le piastre in un'incubatrice a 37 °C per una notte. Verificare la presenza di eventuali crescite. I batteri sono considerati replicativamente morti quando le colonie non crescono sulla piastra LB.

7. Controllo di qualità del metabolismo batterico con respirometro

  1. Dopo il lavaggio finale e la risospensione dal punto 5.4, verificare che i batteri siano metabolicamente morti utilizzando gli strumenti disponibili come i respirometri19,20 e misurando il tasso di consumo basale di ossigeno (OCR).
  2. Preparare la soluzione M9: sciogliere 3 g di fosfato di potassio monobasico (KH 2 PO4 ), 6 g di fosfato di sodio bibasico (Na2HPO4 ) e 5 g di cloruro di sodio (NaCl) in 950 ml di acqua distillata. Autoclavare con un ciclo liquido per 45 minuti a 15 psi, quindi lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente. Aggiungere 1 mL di solfato di magnesio 1 M (MgSO4 ) e conservare a temperatura ambiente.
  3. Idratare la cartuccia del respirometro: aggiungere 200 μL di calibrante a tutti i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Inserire la cartuccia nella piastra a 96 pozzetti e incubare per una notte in un'incubatrice a 37 °C.
  4. Calibrazione del saggio: Il giorno seguente, posizionare la cartuccia idratata nella macchina e iniziare la calibrazione.
  5. Configurazione della piastra di test del saggio: utilizzando una nuova piastra a 96 pozzetti, aggiungere 160 μL di M9 e 40 μL dei batteri preparati (1 x 109 CFU/mL) ai pozzetti di test. Aggiungere 200 μL di M9 ai 4 pozzetti angolari da utilizzare come pozzetti vuoti. Aggiungere 160 μL di M9 e 40 μL di LB utilizzati per il lavaggio e la risospensione da utilizzare come controlli negativi. Aggiungere 200 μL di M9 al resto dei pozzetti che non verranno utilizzati.
  6. Eseguire il test: una volta completata la calibrazione della cartuccia, inserire la piastra del saggio dal punto 7.5 nella macchina per l'analisi. Le impostazioni includono passaggi per mixare, aspettare, misurare e ripetere. I risultati verranno visualizzati come tasso di consumo di ossigeno (OCR). I batteri sono metabolicamente morti e pronti all'uso quando l'OCR è zero.

figure-protocol-1
Figura 1. Flusso di lavoro per il trattamento con paraformaldeide. Una singola colonia di batteri E. coli OP50 viene coltivata durante la notte. Il PFA viene aggiunto a una concentrazione finale dello 0,5% e la coltura trattata con PFA viene agitata per 1 ora a 37 °C. Infine, il PFA viene rimosso lavando la coltura con LB 5x fresco. Per confermare che i batteri trattati sono replicativamente inattivi, strisci una piastra LB dei batteri trattati e cresci durante la notte. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Risultati

Un flusso di lavoro dettagliato del protocollo è mostrato nella Figura 1. È stato sviluppato e ottimizzato un metodo ad alto rendimento per inattivare in modo coerente la replicazione batterica (Figura 2A) e il metabolismo (Figura 2B) per studi metabolici e farmacologici nella ricerca su C. elegans utilizzando la paraformaldeide16. L'obiettivo era quello di determinare la concentrazione più bassa di ...

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Discussione

Vantaggi dell'uccisione dei PFA rispetto ad altri metodi di uccisione batterica
Il trattamento con PFA è un metodo ad alto rendimento per prevenire il metabolismo batterico mantenendo una fonte di cibo nutriente per C. elegans. L'uccisione dei batteri tramite il trattamento PFA presenta molteplici vantaggi rispetto ad altri metodi. A differenza del trattamento UV, in cui ogni piastra deve essere testata per il successo dell'uccisione, una singola piastra di un lotto di batteri trattati con PF...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dal NIH R21AG059117 e dai Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research presso l'Università del Michigan. SB è stato finanziato da T32AG000114. ESK è stato finanziato da NSF DGE 1841052.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Foglio di alluminioGraffe2549291
bruciatore BunsenVWR470121-700 
densimetro cellulareDenville80-3000-45 
CentrifugaEppendorg5430
Cappa chimicaLabcono975050411384RG
Provette conincal (50 mL)Fisher339652
Cuvette Fisher14-955-127
E. coli OP50CGCOP50
Flaconi di ErlenmyerFisher250 mL: FB501250
500 mL: FB501500
1000 mL: FB5011000
Anello di inoculazioneFisher22-363-605
LB AgarFisherBP1425500
Flacone per la raccolta dei rifiuti liquidiThomas Scientific1230G50
Solfato di magnesio (MgSO4)SigmaM7506
Paraformaldeide (32%)Microscopia elettronica Scienze15714-SParaformaldeide - soluzione senza metanolo
PipettorEppendorfEppendorf Easypet 3
Piastre in plastica (100 mm)FisherFB0875712
Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4)FisherP2853
Seahorse XF CalibrantAgilent100840-000
Seahorse XFe96 Kit di analisi del flusso extracellulare e micropiastra per colture cellulariAgilent101085-004
Pipette sierologiche (50 mL)Genesee Scientific12-107
Incubatore shakerThermo11 676 083
Cloruro di sodio (NaCl)FisherS640-3
Idrossido di sodio (NaOH)FisherS318500
Fosfato di sodio bibasico anidro (Na2HPO4)SigmaS374-500
Secchio per raccolta rifiuti solidiM& M Industrie  Secchio tradizionale da 5,0 galloni M1
Triptone Genesee Scientific 20-251 Vortex Thermo 11676331 Bilancia per pesare C Goldenwall HZ10K6B Estratto di lievito Genesee Scientific 20-255

Riferimenti

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