La fonte di cibo per Caenorhabditis elegans in laboratorio è l'Escherichia coli vivo. Poiché i batteri sono metabolicamente attivi, presentano una variabile confondente negli studi metabolici e farmacologici in C. elegans. Un protocollo dettagliato per inattivare metabolicamente i batteri utilizzando la paraformaldeide è descritto qui.
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Articolo metodologico
Metodologia per inattivare metabolicamente i batteri per la ricerca su Caenorhabditis elegans
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Caenorhabditis elegans è un organismo modello comune per la ricerca in genetica, sviluppo, invecchiamento, metabolismo e comportamento. Poiché i C. elegans consumano una dieta a base di batteri vivi, l'attività metabolica della loro fonte di cibo può confondere gli esperimenti che cercano gli effetti diretti di vari interventi sul verme. Per evitare gli effetti confondenti del metabolismo batterico, i ricercatori di C. elegans hanno utilizzato diversi metodi per inattivare metabolicamente i batteri, tra cui l'irradiazione ultravioletta (UV), l'uccisione del calore e gli antibiotici. Il trattamento UV è relativamente a bassa produttività e non può essere utilizzato in coltura liquida perché ogni piastra deve essere esaminata per verificare il successo dell'abbattimento batterico. Un secondo metodo di trattamento, l'uccisione termica, influisce negativamente sulla consistenza e sulla qualità nutrizionale dei batteri, portando all'arresto dello sviluppo di C. elegans. Infine, il trattamento antibiotico può alterare direttamente la fisiologia di C. elegans oltre a prevenire la crescita batterica. Questo manoscritto descrive un metodo alternativo per inattivare metabolicamente i batteri utilizzando la paraformaldeide (PFA). Il trattamento con PFA lega in modo incrociato le proteine all'interno delle cellule batteriche per prevenire l'attività metabolica preservando la struttura cellulare e il contenuto nutrizionale. Questo metodo è ad alta produttività e può essere utilizzato in coltura liquida o in piastre solide, poiché l'analisi della crescita di una piastra di batteri trattati con PFA convalida l'intero lotto. L'inattivazione metabolica attraverso il trattamento con PFA può essere utilizzata per eliminare gli effetti confondenti del metabolismo batterico sugli studi sull'integrazione di farmaci o metaboliti, sulla resistenza allo stress, sulla metabolomica e sul comportamento in C. elegans.
Introduzione
Caenorhabditis elegans è stato originariamente proposto come organismo modello nel 19651 e da allora è stato ampiamente adottato negli studi di genetica, sviluppo, comportamento, invecchiamento e metabolismo2. Grazie alle grandi dimensioni della covata e alla cuticola trasparente, C. elegans è particolarmente adatto per lo screening ad alto rendimento con reporter fluorescenti3. Il loro breve ciclo di vita, la riproduzione ermafrodita e l'omologia genetica con l'uomo rendono C. elegans un prezioso sistema modello per gli studi sullo sviluppo4 e su....
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Protocollo
1. Inoculazione di batteri
- Preparare il brodo Luria (LB) sciogliendo 10 g di triptone, 5 g di estratto di lievito e 10 g di cloruro di sodio (NaCl) in 950 ml di acqua distillata.
- Regolare il pH del LB a 7,0 aggiungendo idrossido di sodio (NaOH) 5M. Questo dovrebbe richiedere solo circa 0,2 mL di NaOH.
- Sterilizzare in autoclave il terreno LB a pH regolato su un ciclo liquido per 45 minuti a 15 psi. Lasciare raffreddare la soluzione e conservarla a temperatura ambiente.
- Inoculare una singola colonia di batteri in 100 mL di LB in un pallone di Erlenmeyer da 500 mL. Coltivare i batteri per una notte in un incubatore....
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Risultati
Un flusso di lavoro dettagliato del protocollo è mostrato nella Figura 1. È stato sviluppato e ottimizzato un metodo ad alto rendimento per inattivare in modo coerente la replicazione batterica (Figura 2A) e il metabolismo (Figura 2B) per studi metabolici e farmacologici nella ricerca su C. elegans utilizzando la paraformaldeide16. L'obiettivo era quello di determinare la concentrazione più bassa di .......
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Discussione
Vantaggi dell'uccisione dei PFA rispetto ad altri metodi di uccisione batterica
Il trattamento con PFA è un metodo ad alto rendimento per prevenire il metabolismo batterico mantenendo una fonte di cibo nutriente per C. elegans. L'uccisione dei batteri tramite il trattamento PFA presenta molteplici vantaggi rispetto ad altri metodi. A differenza del trattamento UV, in cui ogni piastra deve essere testata per il successo dell'uccisione, una singola piastra di un lotto di batteri trattati con PF.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato finanziato dal NIH R21AG059117 e dai Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research presso l'Università del Michigan. SB è stato finanziato da T32AG000114. ESK è stato finanziato da NSF DGE 1841052.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Foglio di alluminio | Graffe | 2549291 | |
| bruciatore Bunsen | VWR | 470121-700 | |
| densimetro cellulare | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuga | Eppendorg | 5430 | |
| Cappa chimica | Labcono | 975050411384RG | |
| Provette conincal (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvette | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Flaconi di Erlenmyer | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 | |
| Anello di inoculazione | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Flacone per la raccolta dei rifiuti liquidi | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Solfato di magnesio (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldeide (32%) | Microscopia elettronica Scienze | 15714-S | Paraformaldeide - soluzione senza metanolo |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Piastre in plastica (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Kit di analisi del flusso extracellulare e micropiastra per colture cellulari | Agilent | 101085-004 | |
| Pipette sierologiche (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Incubatore shaker | Thermo | 11 676 083 | |
| Cloruro di sodio (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Idrossido di sodio (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Fosfato di sodio bibasico anidro (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Secchio per raccolta rifiuti solidi | M& M Industrie | Secchio tradizionale da 5,0 galloni M1 | |
Riferimenti
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O.
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Ristampe e permessi
