Gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti possono essere purificati attraverso la selezione cellulare, utilizzando una combinazione di colorazione con molecole di adesione alle cellule mitocondriali e leucocitarie attivate (ALCAM, nota anche come CD166).
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Articolo metodologico
Applicazione della colorazione dei mitocondri vivi nella selezione cellulare per purificare gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule staminali embrionali umane (ES) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) hanno potenziali applicazioni nella medicina rigenerativa basata sulle cellule per il trattamento di organi gravemente malati grazie alla loro proliferazione illimitata e alle loro proprietà pluripotenti. Tuttavia, la differenziazione delle cellule ES/iPS umane in tipi di cellule bersaglio pure al 100% è impegnativa a causa della loro elevata sensibilità all'ambiente. La tumorigenesi dopo il trapianto è causata da cellule contaminate, proliferanti e indifferenziate, rendendo la tecnologia ad alta purificazione essenziale per la realizzazione sicura della medicina rigenerativa. Per mitigare il rischio di tumorigenesi, è stata sviluppata una tecnologia ad alta purificazione per gli epatociti derivati da cellule iPS umane. Il metodo utilizza FACS (fluorescence-activated cell sorting) utilizzando una combinazione di alto contenuto mitocondriale e il marcatore di superficie cellulare ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule) senza modificazioni genetiche. Il 97% ± lo 0,38% (n = 5) degli epatociti purificati utilizzando questo metodo hanno mostrato espressione proteica di albumina. Questo articolo si propone di fornire procedure dettagliate per questo metodo, come applicato al più recente metodo di differenziazione bidimensionale per cellule iPS umane in epatociti.
Introduzione
Le cellule staminali embrionali e pluripotenti indotte (ES e iPS, rispettivamente) sono considerate fonti cellulari promettenti per le terapie rigenerative. Tuttavia, l'efficienza della differenziazione di queste cellule in specifici tipi di cellule bersaglio può variare, anche quando si utilizza la stessa linea cellulare, lo stesso protocollo e lo stesso sperimentatore 1,2,3,4. Questa variabilità può essere attribuita all'elevata sensibilità delle cellule ES/iPS umane al loro ambiente. Pertanto, attualmente è difficile ottenere costantemen....
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Protocollo
Questo studio ha utilizzato cellule iPS umane ottenute commercialmente (ceppo 253G1) (vedi Tabella dei materiali).
1. Mantenimento delle cellule iPS umane
- Mantenere le cellule iPS umane in condizioni prive di alimentatore in terreno AK02 su piastre di coltura rivestite con iMatrix-511 da 0,25 μg/cm2 (vedere la tabella dei materiali).
2. Differenziamento epatico di cellule iPS umane in colture 2D
NOTA: Fare riferimento alla Figura 1A per il programma giornaliero del....
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Risultati
Viene mostrata la cronologia dei processi che inducono le cellule iPS umane a differenziarsi in epatociti attraverso la coltura 2D (Figura 1A) e le caratteristiche cellulari rappresentative (Figura 1B). Approssimativamente il 12° giorno di differenziazione, le cellule hanno iniziato a mostrare forme cellulari poligonali e nuclei rotondi, caratteristici degli epatociti. Alcuni epatociti mostravano anche multinucleazione.
L'analisi FACS.......
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Discussione
A causa delle loro funzioni nel metabolismo dei nutrienti e nella disintossicazione, gli epatociti possiedono un numero relativamente elevato di mitocondri rispetto ad altri tipi di cellule15. ALCAM è un membro della superfamiglia delle immunoglobuline e svolge un ruolo nell'adesione e nella migrazione cellulare. È espresso in vari tipi di cellule, tra cui cellule epatiche, epiteliali, linfocitiche, mieloidi, fibroblasti e neuronali16. Utilizzando una combinazione del metod.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia numero di sovvenzione [23390072].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Linea cellulare iPS umana 253G1 | RIKEN BioResource Research Center | HPS0002 | |
| 4% paraformaldeide | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-20145 | |
| Activina A Solution, umana, ricombinante | NACALAI TESQUE, INC. | 18585 | |
| Anticorpo anti-nuclei, clone 235-1 | Chemicon | MAB1281 | Anticorpo contro l'antigene nucleare umano |
| B-27 Integratore (50x), senza siero | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| BD FACSAria III | BD Biosciences | Selezionatore cellulare | |
| CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182 | |
| Ciclosporina A | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 035-18961 | |
| Collagenasi | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 034-22363 | |
| Corning Matrigel Fattore di crescita ridotto (GFR) Matrice della membrana basale | Corning | 354230 | Matrice della membrana basale simile al gel |
| CultureSure Y-27632 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-24023 | Inibitore ROCK |
| Desametasone | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 047-18863 | |
| Dimetil solfossido (DMSO) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 047-29353 | |
| Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-capra d'asino (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
| Anticorpo secondario anti-topo d'asino (H+L) altamente adsorbito, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | |
| Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio d'asino (H+L), Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Falcon 5 mL Provetta in polistirene a fondo tondo, con filtro cellulare Tappo a scatto | Corning | 352235 | |
| Siero | fetale bovinoBiowest | 51820-500 | |
| GlutaMAX Integratore | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Dipeptide L-Alanil-L-Glutammina |
| Anticorpo umano/topo/ratto/canino ALCAM/CD166 | R& D Systems | AF1172 | |
| Idrocortisone 21-emiuccinato sale sodico | Sigma-Aldrich | H2270 | |
| iMatrix-511 seta | Nippi | 892021 | |
| ImmunoBlock | KAC | CTKN001 | Soluzione bloccante |
| ITS-G Supplement(& volte; 100) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 090-06741 | |
| Leibovitz's L-15 Medium | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 128-06075 | |
| N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa) | Toronto Research Chemicals | H293745 | |
| Rabbit Polyclonal Albumin Anti-Human | Dako | A0001 | |
| Poliossietilene Sorbitano Monolaurato (Tween 20) | NACALAI TESQUE, INC. | 28353-85 | |
| RPMI-1640 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 189-02025 | |
| L-ascorbato di sodio | NACALAI TESQUE, INC. | 03422-32 | |
| StemFit AK02N | REPROCELL | RCAK02N | |
| TBS (10x) | NACALAI TESQUE, INC. | 12748-31 | |
| Tetrametilrodamina, estere metilico (TMRM) | Thermo Fisher Scientific | T668 | |
| Triton X-100 | NACALAI TESQUE, INC. | 28229-25 | |
| Soluzione di Tripano Blu | NACALAI TESQUE, INC. | 20577-34 | |
| TRYPSIN 250 | Difco | 215240 | |
| Soluzione di brodo di triptosio fosfato | Sigma-Aldrich | T8159 |
Riferimenti
- Yamamoto, T., et al. Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7. Scientific Reports. 8 (1), 241(2018).
- Laco, F., et al.
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Ristampe e permessi
