Applicazione della colorazione dei mitocondri vivi nella selezione cellulare per purificare gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Sommario

Gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti possono essere purificati attraverso la selezione cellulare, utilizzando una combinazione di colorazione con molecole di adesione alle cellule mitocondriali e leucocitarie attivate (ALCAM, nota anche come CD166).

Abstract

Le cellule staminali embrionali umane (ES) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) hanno potenziali applicazioni nella medicina rigenerativa basata sulle cellule per il trattamento di organi gravemente malati grazie alla loro proliferazione illimitata e alle loro proprietà pluripotenti. Tuttavia, la differenziazione delle cellule ES/iPS umane in tipi di cellule bersaglio pure al 100% è impegnativa a causa della loro elevata sensibilità all'ambiente. La tumorigenesi dopo il trapianto è causata da cellule contaminate, proliferanti e indifferenziate, rendendo la tecnologia ad alta purificazione essenziale per la realizzazione sicura della medicina rigenerativa. Per mitigare il rischio di tumorigenesi, è stata sviluppata una tecnologia ad alta purificazione per gli epatociti derivati da cellule iPS umane. Il metodo utilizza FACS (fluorescence-activated cell sorting) utilizzando una combinazione di alto contenuto mitocondriale e il marcatore di superficie cellulare ALCAM (activated leukocyte cell adhesion molecule) senza modificazioni genetiche. Il 97% ± lo 0,38% (n = 5) degli epatociti purificati utilizzando questo metodo hanno mostrato espressione proteica di albumina. Questo articolo si propone di fornire procedure dettagliate per questo metodo, come applicato al più recente metodo di differenziazione bidimensionale per cellule iPS umane in epatociti.

Introduzione

Le cellule staminali embrionali e pluripotenti indotte (ES e iPS, rispettivamente) sono considerate fonti cellulari promettenti per le terapie rigenerative. Tuttavia, l'efficienza della differenziazione di queste cellule in specifici tipi di cellule bersaglio può variare, anche quando si utilizza la stessa linea cellulare, lo stesso protocollo e lo stesso sperimentatore 1,2,3,4. Questa variabilità può essere attribuita all'elevata sensibilità delle cellule ES/iPS umane al loro ambiente. Pertanto, attualmente è difficile ottenere costantemente cellule bersaglio pure. Per ottenere una medicina rigenerativa altamente sicura, è fondamentale eliminare le cellule proliferative e le cellule staminali indifferenziate nelle cellule terapeutiche ed è essenziale una tecnologia avanzata di purificazione per le cellule bersaglio ^5,6,7.

Un selezionatore di cellule è un dispositivo che analizza istantaneamente le singole cellule e ordina le cellule vive di interesse in base all'intensità del segnale fluorescente, offrendo una soluzione promettente. Ciò può essere ottenuto attraverso la colorazione con anticorpi di marcatori di superficie specifici per il tipo di cellula o utilizzando espressioni geniche reporter specifiche per il tipo di cellula. Utilizzando questa tecnica, ci sono diversi rapporti su metodi per purificare i cardiomiociti ^8,9,10 e gli epatociti^11,12 derivati da cellule staminali pluripotenti. Hattori et al. hanno sviluppato un innovativo metodo di purificazione mitocondriale utilizzando un selezionatore di cellule¹³. Sfruttando il fatto che i cardiomiociti hanno un'elevata richiesta di energia attraverso l'attività mitocondriale, la colorazione delle cellule con il colorante mitocondriale vivo TMRM (estere metilmetilico-rodamina) può essere utilizzato per marcare e purificare altamente i cardiomiociti mediante FACS da corpi embrioidi derivati da cellule ES umane contenenti vari tipi di cellule. L'assenza di tumorigenicità è stata confermata da saggi di formazione di teratomi con i cardiomiociti purificati. Inoltre, Yamashita et al. hanno inaspettatamente scoperto un metodo per purificare gli epatociti da corpi embrioidi derivati da cellule ES umane isolando frazioni con elevata attività mitocondriale ed espressione ALCAM-positiva¹⁴. Il razionale di questo metodo è che gli epatociti hanno anche un numero relativamente alto di mitocondri a causa del loro elevato consumo di ATP per il metabolismo dei nutrienti e la disintossicazione¹⁵, e gli epatociti esprimono ALCAM, un membro della superfamiglia delle immunoglobuline, che svolge un ruolo nell'adesione e nella migrazione cellulare¹⁶.

I precedenti metodi altamente purificanti per gli epatociti derivati da cellule staminali pluripotenti richiedevano modificazioni genetiche e i metodi di purificazione non genetici avevano una bassa efficienza¹⁷. Il metodo non genetico mitocondriale ha il merito di raggiungere un'elevata purezza. Quando sono necessarie cellule progenitrici epatiche, è possibile scegliere i metodi CD133 e CD13 o Dlk1 ^18,19. Sebbene l'accuratezza della tecnologia di editing del genoma sia avanzata, il potenziale rischio di cambiamenti genomici imprevisti (ad esempio, la cancerogenesi) non può essere completamente eliminato. I metodi basati sull'attività mitocondriale, senza comportare modificazioni genetiche, possono essere esenti da tali rischi.

Come risultato dell'esame di vari indicatori mitocondriali nei cardiomiociti neonatali di ratto, è stato osservato che il TMRM scompare completamente entro 24 ore, mentre altri coloranti sono rimasti per almeno 5 giorni¹³. Inoltre, è importante notare che TMRM e JC-1 non hanno influenzato la vitalità cellulare quando valutati con il test 3-(4,5-dimetil-tiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT), mentre altri coloranti hanno dimostrato effetti variabili sulla vitalità cellulare¹³. TMRM dimostra una maggiore sicurezza.

Ad oggi, sono stati sviluppati diversi metodi di differenziazione bidimensionale (2D) come approcci più efficienti per indurre la differenziazione rispetto alla formazione di corpi embrioidi tridimensionali (3D). Questo perché i composti o le citochine che inducono la differenziazione graduale possono essere somministrati uniformemente alle cellule su un piano 2D, piuttosto che in uno spazio 3D. In questo studio, il metodo²⁰ precedentemente riportato è stato modificato per indurre la differenziazione in epatociti derivati da cellule iPS umane. Qui vengono descritti i dettagli delle procedure per la differenziazione e la purificazione 2D aggiornate di epatociti derivati da cellule iPS umane.

Protocollo

Questo studio ha utilizzato cellule iPS umane ottenute commercialmente (ceppo 253G1) (vedi Tabella dei materiali).

1. Mantenimento delle cellule iPS umane

1. Mantenere le cellule iPS umane in condizioni prive di alimentatore in terreno AK02 su piastre di coltura rivestite con iMatrix-511 da 0,25 μg/cm² (vedere la tabella dei materiali).

2. Differenziamento epatico di cellule iPS umane in colture 2D

NOTA: Fare riferimento alla Figura 1A per il programma giornaliero della differenziazione epatica. Durante tutto il processo, utilizzare piastre di coltura a 6 pozzetti e aggiungere 2 ml del terreno di lavaggio o coltura designato a ciascun pozzetto. Mantenere le condizioni di coltura cellulare al 100% di umidità, 5% di CO₂ e 20% di O₂ a 37 °C.

1. Rivestire ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di matrice a membrana basale (diluita 1/25 in PBS (-)) e incubare a 37 °C per 1 ora.
2. Passaggio di cellule iPS umane sulla piastra rivestita a una densità di 20.000-30.000 cellule/cm² utilizzando un terreno AK02N integrato con un inibitore ROCK da 10 μM (Y-27632) (vedi Tabella dei materiali). Sostituire il terreno senza Y-27632 il giorno successivo e la coltura per altri 2 giorni.
3. Lavare le celle una volta con il terreno RPMI-1640. Avviare la differenziazione dell'endoderma sostituendo il terreno con RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% Insulina B27 + 1% Dipeptide L-Alanil-L-Glutammina) integrato con 3-6 μM di CHIR-99021 e 100 ng/mL di Activina A per 24 ore (vedi Tabella dei Materiali).
4. Sostituire il terreno con RPMI-B27-Glu integrato con 50 ng/mL di Activina A per 24 ore.
5. Per indurre la differenziazione dei progenitori epatici, sostituire il terreno con RPMI-B27-Glu integrato con dimetilsolfossido all'1% (DMSO) per 5 giorni.
6. Per promuovere la maturazione degli epatociti, passare al terreno di maturazione degli epatociti: terreno L-15 di Leibovitz contenente 10 μM di idrocortisone 21-emiuccinato, 8,3% di brodo di triptosio fosfato, 100 nM di desametasone (DEX), 50 μg/mL di sodio-L-ascorbato, 0,58% di insulina-transferrina-selenio (ITS), 8,3% di siero fetale bovino (FBS), 2 mM di Dipeptide L-Alanil-L-Glutammina e 100 nM di N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-ammino esanoide (Dihexa) (vedi Tabella dei materiali).
7. Cambia il mezzo ogni 2 giorni per 20 giorni. Ordinare le cellule circa 27 giorni dopo l'inizio della differenziazione.

3. Preparazione cellulare per la purificazione di epatociti derivati da cellule iPS umane

1. Lavare le cellule differenziate epatiche con 2 mL di PBS (-) per pozzetto.
2. Aggiungere 1 mL di soluzione enzimatica per pozzetto, che include 0,1% di collagenasi, 0,083% di tripsina, 10 μM di inibitore ROCK (Y-27632), 20 nM di ciclosporina A e 50 μg/mL di sodio-L-ascorbato nel tampone Ads (116 mM di NaCl, 12,5 mM di NaH₂PO₄, 20 mM di HEPES, 5,4 mM di KCl, 5,6 mM di glucosio e 0,8 mM di MgSO4; pH 7,35) (vedere la Tabella dei materiali). Staccare le celle dalle piastre ruotandole orizzontalmente a 37 °C per circa 2 ore.
3. Dopo aver verificato che le cellule sono staccate e arrotondate al microscopio, disperderle in singole cellule mediante pipettaggio delicato e raccoglierle in una provetta da 50 ml.
4. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 minuti a 18 °C per pellettizzarle. Rimuovere il surnatante utilizzando un aspiratore.
5. Colorare i mitocondri delle cellule disperdendole in 5 mL di terreno di maturazione degli epatociti contenente 100 nM di TMRM (tetrametilrodamina, estere di methl) (vedi Tabella dei materiali). Incubare per 30 minuti a 37 °C proteggendo dalla luce avvolgendo in un foglio di alluminio.
6. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 minuti a 18 °C per pellettizzarle. Rimuovere il surnatante.
7. Risospendere le cellule con 1-5 mL di tampone Ads freddo contenente il 2% di FBS.
8. Contare il numero di cellule utilizzando una soluzione di blu di tripano allo 0,4% e una piastra per il conteggio delle cellule.
9. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 minuti a 4 °C per pellettizzarle. Rimuovere il surnatante.
10. Diluire un anticorpo anti-ALCAM (anticorpo primario, vedere la Tabella dei materiali) in un rapporto 1:50 nel tampone Ads e aggiungere 100 μl di anticorpo diluito per 10⁶ cellule. Colorare le celle per 50 minuti con ghiaccio. Preparare le cellule che non sono colorate con l'anticorpo primario come controllo negativo.
11. Lavare due volte le celle con tampone Ads freddo contenente il 2% di FBS.
12. Diluire un Alexa Fluor 488 donkey anti-goat IgG (anticorpo secondario, vedere la Tabella dei materiali) in un rapporto 1:100 nel buffer Ads e aggiungere 100 μl di anticorpo diluito per 10⁶ cellule. Colorare le celle per 30 minuti con ghiaccio. Colorare le cellule che non sono state colorate con l'anticorpo primario utilizzando l'anticorpo secondario.
13. Lavare due volte le celle con tampone Ads freddo contenente il 2% di FBS.
14. Risospendere le celle nel buffer Ads e filtrarle attraverso un filtro a scatto (maglia da 35 μm) appena prima di ordinarle in base al FACS per rimuovere grandi grumi di celle e detriti.

4. Analisi FACS e smistamento di epatociti derivati da cellule iPS umane

1. Impostare la macchina FACS per lo smistamento delle celle seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
   NOTA: Utilizzare un ugello da 85 μm o 100 μm e un filtro ND da 2,0 per gli epatociti. Utilizza il canale FITC per rilevare Alexa Flour 488 per ALCAM e il canale PE per rilevare la fluorescenza TMRM per i mitocondri.
2. Regolare le tensioni FSC (forward scatter) e SSC (side scatter) per visualizzare correttamente la popolazione cellulare.
3. Regolare le tensioni dei canali fluorescenti FITC e PE. Inizia con le celle non etichettate e centra la popolazione cellulare nella parte inferiore di ogni grafico del canale. Assicurati che le celle etichettate siano posizionate in modo appropriato all'interno del grafico.
4. Usa una strategia di gating comune per eliminare i doppietti: Gate il principale FSC-A vs. Popolazione SSC-A (Figura 2A), seguita da FSC-H vs. -W, e poi SSC-H vs. -W (Figura 2B,C).
5. Gate la popolazione TMRM^hi e ALCAM⁺ (P2 in Figura 2E) per selezionare gli epatociti. Gate della popolazione TMRM^hi e ALCAM^- (P1 in Figura 2E) per selezionare i non epatociti. Raccogliere gli epatociti e i non epatociti selezionati in provette da 15 mL contenenti terreno di maturazione degli epatociti.
6. Centrifugare la provetta di raccolta contenente le cellule selezionate a 200 x g per 5 minuti a 18 °C.
7. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule nel terreno di maturazione degli epatociti.
8. Seminare le cellule su fibroblasti embrionali di topo (MEF) trattati con mitomicina C o su una matrice di membrana basale gelatinosa con terreno di maturazione degli epatociti integrato con 10 μM di Y-27632 e 20 nM di ciclosporina A. Coltivare le cellule in un incubatore a 37 °C di CO₂ per 5 giorni.

5. Immunocitochimica per la rilevazione di epatociti derivati da cellule iPS umane

1. Lavare le cellule coltivate per 5 giorni dopo la cernita con PBS (-).
2. Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 5 minuti a temperatura ambiente.
3. Lavare due volte le cellule con tampone TBS-T (1x TBS con 1% Tween 20) per rimuovere la paraformaldeide.
4. Incubare le cellule con tampone TBS-T diluito Triton X-100 allo 0,1% per 5 minuti a temperatura ambiente.
5. Lavare due volte le celle con il tampone TBS-T per rimuovere Triton X-100.
6. Aggiungere la soluzione bloccante disponibile in commercio (vedere la Tabella dei materiali) alle celle per 30 minuti a temperatura ambiente.
7. Aggiungere anticorpi primari contro l'albumina (marcatore degli epatociti) e l'antigene nucleare umano (hNA, vedere la Tabella dei materiali), diluiti 1:50 in soluzione bloccante.
8. Incubare le cellule a 4 °C per una notte. Lavare due volte le celle con il tampone TBS-T.
9. Aggiungere anticorpi secondari: Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG e Alexa Fluor 546 donkey anti-mouse IgG, diluiti 1:100 in soluzione bloccante (vedi Tabella dei materiali).
10. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti. Lavare due volte le celle con il tampone TBS-T.
11. Valutare la purezza degli epatociti contando le cellule albumina-positive e hNA-positive al microscopio a fluorescenza. Calcolare la percentuale di cellule positive all'albumina per cellula hNA-positiva per entrambe le popolazioni P1 e P2.

Risultati

Viene mostrata la cronologia dei processi che inducono le cellule iPS umane a differenziarsi in epatociti attraverso la coltura 2D (Figura 1A) e le caratteristiche cellulari rappresentative (Figura 1B). Approssimativamente il 12° giorno di differenziazione, le cellule hanno iniziato a mostrare forme cellulari poligonali e nuclei rotondi, caratteristici degli epatociti. Alcuni epatociti mostravano anche multinucleazione.

L'analisi FACS...

Discussione

A causa delle loro funzioni nel metabolismo dei nutrienti e nella disintossicazione, gli epatociti possiedono un numero relativamente elevato di mitocondri rispetto ad altri tipi di cellule¹⁵. ALCAM è un membro della superfamiglia delle immunoglobuline e svolge un ruolo nell'adesione e nella migrazione cellulare. È espresso in vari tipi di cellule, tra cui cellule epatiche, epiteliali, linfocitiche, mieloidi, fibroblasti e neuronali¹⁶. Utilizzando una combinazione del metod...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Linea cellulare iPS umana 253G1	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% paraformaldeide	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activina A Solution, umana, ricombinante	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anticorpo anti-nuclei, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	Anticorpo contro l'antigene nucleare umano
B-27 Integratore (50x), senza siero	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Selezionatore cellulare
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporina A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Collagenasi	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Fattore di crescita ridotto (GFR) Matrice della membrana basale	Corning	354230	Matrice della membrana basale simile al gel
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	Inibitore ROCK
Desametasone	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimetil solfossido (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Anticorpo secondario adsorbito incrociato anti-capra d'asino (H+L), Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Anticorpo secondario anti-topo d'asino (H+L) altamente adsorbito, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio d'asino (H+L), Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Provetta in polistirene a fondo tondo, con filtro cellulare Tappo a scatto	Corning	352235
Siero	fetale bovinoBiowest	51820-500
GlutaMAX Integratore	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptide L-Alanil-L-Glutammina
Anticorpo umano/topo/ratto/canino ALCAM/CD166	R& D Systems	AF1172
Idrocortisone 21-emiuccinato sale sodico	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 seta	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Soluzione bloccante
ITS-G Supplement(& volte; 100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Rabbit Polyclonal Albumin Anti-Human	Dako	A0001
Poliossietilene Sorbitano Monolaurato (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
L-ascorbato di sodio	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetrametilrodamina, estere metilico (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Soluzione di Tripano Blu	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
Soluzione di brodo di triptosio fosfato	Sigma-Aldrich	T8159