Qui, presentiamo un protocollo che dimostra l'installazione e l'uso di una pipeline bioinformatica per analizzare i dati di sequenziamento dell'RNA chimerico utilizzati nello studio delle interazioni RNA:RNA in vivo .
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Tutorial sull'analisi computazionale per piccoli RNA non codificanti chimerici: librerie di sequenziamento dell'RNA target
In questo articolo
Sommario
Abstract
La comprensione delle interazioni regolatorie genetiche in vivo di piccoli RNA non codificanti (sncRNA), come i microRNA (miRNA), con i loro RNA bersaglio è stata avanzata negli ultimi anni da approcci biochimici che utilizzano il cross-linking seguito dalla legatura per catturare le interazioni sncRNA:RNA bersaglio attraverso la formazione di RNA chimerici e successive librerie di sequenziamento. Mentre i set di dati provenienti dal sequenziamento dell'RNA chimerico forniscono input a livello di genoma e sostanzialmente meno ambigui rispetto al software di previsione dei miRNA, la distillazione di questi dati in informazioni significative e fruibili richiede ulteriori analisi e può dissuadere i ricercatori che non hanno un background computazionale. Questo report fornisce un'esercitazione per supportare i biologi computazionali entry-level nell'installazione e nell'applicazione di un recente strumento software open source: Small Chimeric RNA Analysis Pipeline (SCRAP). Vengono forniti i requisiti della piattaforma, gli aggiornamenti e una spiegazione dei passaggi della pipeline e della manipolazione delle variabili chiave di input dell'utente. Ridurre una barriera per i biologi nell'ottenere informazioni dagli approcci di sequenziamento dell'RNA chimerico ha il potenziale per lanciare indagini basate sulla scoperta delle interazioni regolatorie sncRNA:RNA bersaglio in più contesti biologici.
Introduzione
I piccoli RNA non codificanti sono altamente studiati per il loro ruolo post-trascrizionale nel coordinare l'espressione di gruppi di geni in diversi processi come la differenziazione e lo sviluppo, l'elaborazione dei segnali e la malattia 1,2,3. La capacità di determinare con precisione i trascritti bersaglio di piccoli RNA non codificanti (sncRNA) regolatori genici, inclusi i microRNA (miRNA), è importante per gli studi di biologia dell'RNA sia a livello di base che di traduzione. Algoritmi bioinformatici che sfruttano la complementarità anticipata tra la sequenza seme di m....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
NOTA: Il protocollo inizierà con il download e l'installazione del software necessario per analizzare le librerie di sequenziamento dell'RNA chimerico utilizzando SCRAP.
1. Installazione
- Prima di installare SCRAP, installare le dipendenze Git e Miniconda sulla macchina da utilizzare per le analisi. È probabile che Git sia già installato. Sulla piattaforma Mac OSX, ad esempio, verificalo utilizzando quale git per vedere che l'utilità " git " è presente e installata in questa directory. Verificare se Miniconda è installato utilizzando quale conda. Se non viene restituito nulla, inst....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
I risultati per sncRNA:target RNA rilevato da una versione modificata di SCRAP (SCRAP release 2.0, che implementa modifiche per il filtraggio dell'rRNA) su set di dati di sequenziamento precedentemente pubblicati e preparati utilizzando CLEAR-CLIP9 sono mostrati nella Figura 2 e nella Tabella 1. Gli utenti possono apprezzare la diminuzione delle interazioni dei miRNA della frazione relativa con le regioni degli introni che si verifica in seguito all'i.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Questo protocollo sull'uso della pipeline SCRAP per l'analisi delle interazioni sncRNA:target RNA è progettato per assistere i ricercatori che stanno entrando nell'analisi computazionale. Ci si aspetta che il completamento dell'esercitazione guidi i ricercatori con esperienza computazionale entry-level o superiore attraverso i passaggi necessari per l'installazione e l'uso di questa pipeline e della sua applicazione per analizzare i dati ottenuti dalle librerie di sequenziamento dell'RNA chimerico. I passaggi critici per.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo i membri del laboratorio Meffert per le utili discussioni, tra cui BH Powell e WT Mills IV, per il feedback critico sulla descrizione dell'installazione e dell'implementazione del gasdotto. Questo lavoro è stato sostenuto da un premio della Fondazione Braude, dal programma di lancio del Maryland Stem Cell Research Fund, dal premio Blaustein Endowment for Pain Research and Education e dal NINDS RO1NS103974 e NIMH RO1MH129292 a M.K.M.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Genomes | UCSC Genome browser | N/A | https://genome.ucsc.edu/ o https://www.ncbi.nlm.nih.gov/data-hub/genome/ |
| Linux | Linux | Ubuntu 20.04 o 22.04 LTS consigliato | |
| Mac | Apple | Mac OSX (>11) | |
| Configurazione della piattaforma | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP/blob/main/PLATFORM-SETUP.md] |
| Pipeline SCRAP | GitHub | N/A | https://github.com/Meffert-Lab/SCRAP |
| Shell Unix | Sistema operativo Unix | bash >=5.0 | |
| Shell Unix | Sistema operativo Unix | zsh (5.9 consigliato) | |
| Windows | , WSL, Ubuntu 20.04 o 22.04 LTS |
Riferimenti
- Morris, K. V., Mattick, J. S. The rise of regulatory RNA. Nature Reviews Genetics. 15 (6), 423-437 (2014).
- Li, X., Jin, D. S., Eadara, S., Caterina, M. J., Meffert, M. K. Regulation by noncoding RNAs of local translation, injury resp....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
