Method Article

Isolamento, identificazione comportamentale e valutazione della patogenicità di funghi entomopatogeni da una piralide forestale

DOI:

10.3791/65782

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Qui presentiamo un protocollo per ottenere funghi entomopatogeni da una piralide forestale e un modo sostitutivo per valutare le loro attività entomopatogene utilizzando un insetto modello di Coleotteri. Questo metodo è efficiente e conveniente per esplorare le risorse fungine entomopatogene da insetti nocivi che perforano il legno nelle foreste naturali.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I piralidi forestali causano gravi danni agli alberi e perdite economiche in tutto il mondo. Il rilascio di funghi entomopatogeni (EPF) durante il periodo di emergenza FWB è considerato un'alternativa accettabile al controllo chimico. Tuttavia, le risorse EPF sono state significativamente meno esplorate per i FWB, a differenza degli insetti nocivi agricoli. Questo articolo presenta un protocollo per esplorare le risorse EPF dai FWB utilizzando come esempio le popolazioni selvatiche di Monochamus alternatus . In questo protocollo, l'assegnazione delle trappole innescate con M. Attrattivi alternatus a diverse popolazioni hanno garantito la raccolta di campioni adeguati con sintomi naturali di infezione, durante i periodi di emergenza del coleottero. Dopo aver sezionato finemente i tegumenti e averli posizionati su un mezzo selettivo, le specie fungine sono state isolate da ogni parte dei corpi dei coleotteri e identificate in base ai tratti molecolari e morfologici.

Diverse specie fungine sono state certificate come EPF parassite attraverso la reinfezione di M. alternatus sano con sospensioni di spore. I loro fenotipi comportamentali su M. alternatus sono stati osservati utilizzando la microscopia elettronica a scansione e ulteriormente confrontati con quelli sull'insetto modello di coleotteri Tribolium castaneum. Per gli EPF che presentano fenotipi di parassitismo coerenti su entrambe le specie di coleotteri, valutazione delle loro attività su T. castaneum ha fornito preziose informazioni sulla letalità per futuri studi su M. alternatus. Questo protocollo ha aiutato la scoperta di EPF recentemente segnalati sulle popolazioni di M. alternatus in Cina, che potrebbe essere applicato come approccio efficiente per esplorare più risorse di EPF da altri FWB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La devastazione causata dagli insetti nocivi ha portato a grandi perdite ecologiche ed economiche sia negli ecosistemi forestali che in quelli agricoli. La maggior parte dei parassiti agricoli si espone a nemici naturali o agenti di controllo artificiali danneggiando le piante ospiti. Invece, i piralidi del legno forestale (FWB) completano quasi completamente i loro cicli di sviluppo all'interno dei tronchi degli alberi ospiti1, il che solleva grandi sfide per esplorare organismi di biocontrollo efficienti da FWB in campo selvatico. Quel che è peggio è che i FWB trasportano un gran numero di fitopatogeni2 o hanno una relazione intima con questi patogeni come potenziali vettori 3,4, amplificando notevolmente gli effetti negativi dei FWB sulla salute delle foreste. L'uso eccessivo di insetticidi chimici può alleviare la gravità dei FWB, ma l'emergere di resistenza insetticida 5,6 ne limita l'applicazione ambientale. In alcuni casi, insetti parassitoidi, artropodi predatori e microbi entomopatogeni sono stati rilasciati come agenti di biocontrollo nelle aree di distribuzione di FWB7 e si sono dimostrati alternative efficienti ed economicamente accettabili al controllo chimico 8,9,10.

Si ritiene che i funghi entomopatogeni (EPF) abbiano il vantaggio di controllare la FWB rispetto alla maggior parte degli altri gruppi microbici. Le loro spore possono essere trasportate da insetti ospiti e fissate stabilmente sulle superfici del corpo attraverso la penetrazione nella cuticola o nel tegumento 8,11. L'EPF presenta anche un'eccellente adattabilità agli stress ambientali e alcune specie colonizzano bene il tessuto degli alberi come endofiti12,13, facilitandone la crescita, la sopravvivenza e la trasmissione. Tuttavia, rispetto a quello delle industrie agricole, la diversità delle specie di EPF utilizzate negli ecosistemi forestali naturali è notevolmente limitata 14,15,16. La Beauveria bassiana (ceppo PPRI 5339) si è dimostrata il ceppo più promettente per promuovere un programma IPM per i punteruoli di eucalipto in Sudafrica17 e la combinazione di due promettenti isolati di B. La bassiana ha fornito un'opportunità per il controllo microbico pratico del punteruolo rosso delle palme, Rhynchophorus ferrugineus, in diverse fasi di vita nei campi di palme18. Oltre a Beauveria e al ben noto Metarhizium, altri generi EPF dell'ordine Hypocreales, in particolare le specie di Lecanicillium (molte delle quali sono ora classificate nel genere Akanthomyces19,20), hanno mostrato una forte patogenicità e un alto potenziale nella gestione dei parassiti forestali, come l'afide del cipresso in Cile21.

Il coleottero segantino dei pini Monochamus alternatus è un famigerato parassita delle foreste di pini in Cina e nei paesi limitrofi, che si insinua nei rami e nei tronchi dei pini per impedire il trasporto di sostanze nutritive e acqua 22,23,24. Inoltre, M. alternatus promuove anche l'invasione del nematode del legno di pino (Bursaphelenchus xylophilus, PWN) come suo principale coleottero vettore. Un'altra specie congenere del coleottero, M. galloprovincialis, ha diffuso il PWN in diversi paesi europei negli ultimi anni25. Ricerche precedenti hanno riportato diversi generi di EPF naturali da Monochamus spp., come Beauveria, Metarhizium e Lecanicillium (Verticillium, un ex nome di Lecanicillium), in Spagna, Giappone e nelle province di Anhui/Zhejiang in Cina 26,27,28,29. Tuttavia, queste raccolte di EPF sembrano essere comunemente limitate in una certa località, rispetto all'ampia presenza di coleotteri Monochamus nei campi naturali. Poiché il coleottero M. alternatus ha un'ampia distribuzione geografica in Cina, potrebbe essere considerato un piralide rappresentativo per esplorare più potenziali EPF in diverse popolazioni.

Nel presente protocollo, introduciamo una procedura specifica per esplorare gli EPF provenienti da diverse popolazioni geografiche di M. alternatus nella Cina meridionale. Questo protocollo utilizza un modello di coleottero come sostituto per eseguire saggi di entomopatogenicità, a condizione che la specie fungina testata abbia un fenotipo comportamentale coerente su entrambe le specie di coleotteri. Questo protocollo può anche fornire informazioni sull'esplorazione dell'EPF per altri piralidi forestali, in cui la diversità delle loro specie fungine entomopatogene è sottostimata o meno studiata.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isolamento di funghi da M. alternatus (Figura 1)

  1. Raccogli il campione di scarabeo
    1. Raccogli i pini scarabei segantino M. alternatus utilizzando trappole commerciali (vedi Tabella dei materiali) innescati con attrattivi prima dei periodi di emergenza previsti delle popolazioni di coleotteri nelle foreste di pini naturalmente infette.
      NOTA: In questo studio, i coleotteri sono stati raccolti da cinque regioni geografiche della Cina meridionale (Huzhou/Zhejiang, Liangshan/Sichuan, Xiamen/Fujian, Shaoguan/Guangdong, Yulin/Guangxi). La regolazione della trappola dall'alto verso il basso è la seguente: un piano rotondo (50 cm di diametro), un pannello a forma di croce (35 cm di larghezza e 66 cm di lunghezza), un imbuto (35,5 cm di diametro rotondo superiore e 5,5 cm di diametro rotondo inferiore), una tazza di raccolta (10,5 cm di diametro e 26,5 cm di lunghezza). I volatili dell'ospite (ad esempio, etanolo e α-pinene) e il feromone di aggregazione (2-undecilossi-1-etanolo) sono usati come esca30.
    2. Etichettare il campione prima di trasferirlo in laboratorio. Metti ogni scarabeo in tubi sterilizzati individuali con ramoscelli freschi. Sostituisci i ramoscelli con quelli freschi ogni 2 giorni.
    3. Allevare i coleotteri vivi a 25 ± 1 °C in un'incubatrice non umidificata (cicli 16-8 L/D) e osservarli quotidianamente.
    4. Registrare campioni che mostrano una diminuzione dell'alimentazione e della mobilità. Trasferisci M morto. alternati che diventano induriti e rigidi alle camere umide per osservare la crescita di miceli fungini e conidi.
      NOTA: Una volta infettati da funghi entomopatogeni, i coleotteri hanno mostrato una diminuzione dell'alimentazione e della mobilità nella fase iniziale dell'infezione31,32. Dopo la morte, i loro corpi si indurirono e si irrigidirono, con miceli e conidi che comparvero diversi giorni dopo la conservazione in una camera umida33.
    5. Conservare i cadaveri di coleotteri con infezioni fungine a 4 °C per un uso futuro. Per seguire questo protocollo, elaborare i campioni immediatamente entro poche ore per evitare la contaminazione con funghi più saprotrofi.
  2. Preparazione del terreno di coltura
    1. Aggiungere 39 g di destrosio di patate in polvere di agar (PDA) in 1 L di acqua pura e sterilizzare in autoclave per 30 minuti a 121 °C.
    2. Raffreddare a una temperatura operativa (~50 °C), aggiungere 0,05 g di streptomicina, 0,05 g di penicillina G e 0,05 g di tetraciclina e agitare per distribuire il terreno.
    3. Impiattare il terreno in piastre di Petri sotto un banco pulito e utilizzare dopo la solidificazione.
      NOTA: Il terreno PDA con antibiotici viene utilizzato per l'isolamento dai coleotteri, che impedisce la crescita dei batteri senza influire sulla crescita dei funghi durante l'isolamento. Tuttavia, il terreno PDA senza antibiotici viene utilizzato per la coltivazione e la conservazione quotidiana.
    4. Mettere 35 g di brodo di destrosio di patate (PDB) in polvere in 1 L di ddH2O e sterilizzare in autoclave per 30 minuti a 121 °C. Raffreddarlo per l'uso.
  3. Dissezione del campione di coleottero con sintomi di infezione fungina
    1. Preparare forbici, bisturi e spille per insetti sterilizzati; Quindi, lavorare sotto un banco pulito con un bruciatore ad alcool.
      NOTA: L'uso degli strumenti di dissezione può essere regolato in base alle preferenze personali. I perni per insetti sono più affilati degli aghi da dissezione standard e diverse specifiche possono soddisfare la necessità di dissezione.
    2. Sezionare i tegumenti del corpo dello scarabeo con strumenti in piastre di Petri sterili e monouso. Fare attenzione a evitare possibili danni ai tessuti dell'intestino medio e posteriore che possono trasudare contenuto interno.
    3. Dividi i corpi degli scarafaggi nelle posizioni principali come segue: antenne, testa, torace, addome, ali (ogni paio) e zampe.
  4. Depurazione dei funghi
    1. Taglia i tegumenti di ogni posizione in piccoli pezzi con le forbici. Premere delicatamente la superficie esterna sulla superficie delle piastre PDA con antibiotici.
      NOTA: Assicurarsi che i miceli fungini sui tegumenti siano stati inoculati nella piastra.
    2. Sigillare accuratamente con parafilm e coltivare in un'incubatrice a 25 ± 1 °C fino a quando i tessuti non sono completamente coperti dal micelio.
    3. Trasferire singole colonie in base alle proprietà fenotipiche (colore, forma) su un nuovo PDA con antibiotici per coltura a 25 ± 1 °C.
    4. Ripetere il passaggio 1.4.3 due o tre volte sul PDA con antibiotici fino a quando le colonie pure non vengono isolate separatamente.
      NOTA: Se più ceppi fungini crescono nelle piastre originali, scegli il micelio con precisione per facilitare lo smistamento di più specie fungine.
  5. Conservazione degli isolati fungini
    1. Trasferimento di blocchi di agar (~5 mm di diametro) dalle colonie alle nuove piastre PDA.
    2. Coltura in incubatrice a 25 ± 1 °C per 1-2 settimane.
    3. Mettere in frigorifero a 4 °C per la conservazione quotidiana per un ulteriore utilizzo.
    4. Inoculare i ceppi fungini in 50 mL di PDB sterile in un pallone da 250 mL, agitando a 180 giri/min/min a 25 °C per 5-7 giorni.
    5. Raccogliere 1 ml di micelio fungino appena coltivato e sospenderlo in 1 ml di glicerolo sterilizzato al 20% in provette sterili per congelatore da 2 ml (la concentrazione finale di glicerolo è del 10%).
    6. Sigillare le provette con parafilm e preraffreddarle a -20 °C e -40 °C. Quindi, mantenere i tubi a -80 °C come scorte.

2. Identificazione molecolare e morfologica di isolati fungini

  1. Estrazione di DNA genomico fungino
    1. Coltura di funghi in PDB come descritto al punto 1.5.4.
    2. Raccogli il micelio e filtralo per separarlo dal PDB. Omogeneizzare in azoto liquido utilizzando un mortaio e un pestello preraffreddati.
    3. Estrarre il DNA genomico utilizzando il kit di isolamento del DNA genomico per funghi secondo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
  2. Amplificazione PCR e sequenziamento del DNA
    1. Preparare la miscela di reazione PCR come segue: 25 μl di Taq DNA polimerasi, 1 μl di stampo, 2 μl di primer diretti e inversi e ddH2O per un volume totale di 50 μl.
    2. Amplificare la regione rDNA-ITS del campione di DNA utilizzando le coppie di primer ITS1 e ITS434 (cfr. tabella 1) con la seguente procedura: denaturazione iniziale a 95 °C per 4 min, seguita da 35 cicli di denaturazione a 94 °C per 60 s, ricottura a 58 °C per 60 s, allungamento a 72 °C per 2 min, e un allungamento finale a 72 °C per 10 min.
    3. Elettroforesi di prodotti amplificati utilizzando gel di agarosio all'1,5% a 100 V, 100 mA.
    4. Sequenziare la PCR.
    5. Allinea la sequenza utilizzando Clustal X2.0 e MEGA 6.0.
      NOTA: Durante l'allineamento della sequenza, i siti con allineamento ambiguo vengono esclusi e gli spazi vuoti vengono trattati come dati mancanti.
    6. Confrontare la sequenza ottenuta con quelle presenti nel database di sequenze ITS in GenBank utilizzando BLAST sul sito web del National Center for Biotechnology Information (NCBI). Identificare preliminarmente le informazioni sulle specie del ceppo fungino.
  3. Identificazione morfologica
    1. Usa una fotocamera per catturare la morfologia della colonia fungina pura matura sia sul lato anteriore che su quello posteriore delle piastre PDA.
    2. Prelevare i conidi dalle colonie fungine di coltura pura con un ago da inoculazione e trasferirli su un vetrino con una goccia di acqua sterile.
    3. Tenere il vetrino coprioggetti e appoggiarlo lentamente con un angolo di ~45°, in modo che il vetrino coprioggetti possa coprire il campione senza bolle.
    4. Tagliare un blocco di agar da 5 mm2 con un bisturi dalle colonie ai margini della colonia fungina e trasferirlo su un vetrino pulito con una goccia di acqua sterile. Separa con cura i funghi con un ago sottile per vedere strutture specifiche.
    5. Ripetere il passaggio 2.3.3.
    6. Osserva la forma asessuata dei funghi al microscopio ottico (OM), compresa la forma, la trasparenza e la postura delle ife, dei conidiofori, dei fialidi e dei conidi. Registra e misura la forma e le dimensioni delle caratteristiche asessuate per distinguere i diversi isolati fungini l'uno dall'altro.
      NOTA: Per massimizzare la capacità di osservare le strutture fungine, utilizzare coloranti e mezzo di montaggio35.

3. Induzione dei sintomi dell'infezione fungina su M. alternatus per osservarne i fenotipi comportamentali

  1. Preparazione della sospensione conidiale
    1. Preparare 0,01% Tween-80 con acqua pura e sterilizzare in autoclave per 25 minuti a 121 °C. Utilizzare dopo il raffreddamento.
    2. Aggiungere una quantità appropriata di piccole perle di vetro sterili e una soluzione di Tween-80 allo 0,01% in una provetta da centrifuga da 2 mL.
    3. Raschiare le colonie fungine nel tubo e agitarlo a sufficienza con uno scuotitore a vortice fino a quando la colonia non si è disgregata. Filtrare attraverso due strati di garza per rimuovere il micelio.
      NOTA: L'agitazione viene eseguita per garantire la sospensione della conidiospora in una soluzione di Tween-80 allo 0,01%.
    4. Contare il numero di spore sotto l'OM con un emocitometro, regolare a 1 × 108 conidiale/mL con Tween-80 sterile allo 0,01% e mantenere a 4 °C per l'uso.
  2. Preparazione dei coleotteri
    1. Sterilizzare in autoclave i rametti di pino (all'incirca della stessa dimensione) e asciugarli in forno (~ 60 °C).
    2. Conserva i M. raccolti sul campo. alternatus adulti con ramoscelli di pino in incubatrice a 25 ± 1 °C.
    3. Far morire di fame i coleotteri per 24 ore e sterilizzare la superficie dei coleotteri con candeggina, etanolo e acqua distillata [10:10:80 (v:v)] prima dell'uso.
  3. Induzione dell'infezione fungina
    1. Lavorare sotto un banco pulito, immergere i ramoscelli di pino in sospensione coniidale per 10 s e asciugarli all'aria.
    2. Immergere i coleotteri in sospensione coniidale per 10 s, quindi trasferirli in provette sterili da 50 mL (uno scarabeo e un ramoscello per provetta). Sostituisci i ramoscelli con quelli nuovi ogni 2 giorni.
    3. Per il controllo negativo, sostituire la sospensione conidiale in una soluzione sterile di Tween-80 allo 0,01%. Fai cinque repliche per ogni ceppo fungino e gruppo di controllo.
    4. Valuta l'attività dei coleotteri in base alla quantità di escrementi prodotti sui ramoscelli di pino. Quando l'alimentazione cessa, considerali morti.
    5. Trasferire i coleotteri morti in nuove provette sterili da 50 ml e posizionare un pezzo di cotone umido sterile. Incubare a 25 ± 1 °C.
      NOTA: Il cotone bagnato viene utilizzato per mantenere l'umidità, poiché la crescita dei funghi richiede un'umidità adeguata, ma non troppa.
    6. Osserva e fotografa il cambiamento della superficie del coleottero alla stessa ora ogni giorno.
  4. Ri-isolamento e conferma delle specie fungine
    1. Fino a quando non compaiono fenotipi chiari di infezione fungina sulla superficie dei coleotteri, prelevare il micelio da diversi tessuti individualmente in nuove piastre PDA.
    2. Coltivare a 25 ± 1 °C e osservare per assicurarsi che la morfologia sia coerente con quella dei funghi inoculati.
  5. Trattamento del coleottero modello
    1. Ripetere i passaggi 3.2.1-3.3.6 sul modello di coleottero Tribolium castaneum, utilizzando la crusca di frumento come alimento, e sterilizzare la crusca di frumento con luce UV.
    2. Tocca leggermente i coleotteri con una pinzetta sterile. Supponi che siano morti se non c'è risposta.

4. Confermare i fenotipi di infezione dei funghi su M. alternatus e coleottero modello

  1. Preparazione del campione per l'osservazione
    1. Sezionare il M infetto. cadaveri alternatus con cura come al punto 1.3.
    2. Scegli T. corpi castani con evidenti sintomi di infezione fungina.
    3. Tagliare i tappi del disco da 5 mm di quattro colonie fungine mature che crescono su PDA.
  2. Pretrattamento del campione
    1. Immergere i tappi, i tessuti di coleottero infetti e i corpi in glutaraldeide preraffreddata al 2,5% a 4 °C per 2 giorni.
    2. Lavare i campioni tre volte in tampone fosfato allo 0,1% (pH 7,2-7,4) per 5 minuti e disidratarli in etanolo al 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% per 10 minuti.
    3. Asciugare i campioni in un liofilizzatore sottovuoto.
      NOTA: L'intero processo di pretrattamento deve essere accurato, compreso il taglio, l'ammollo, la disidratazione, il lavaggio e l'asciugatura, per evitare danni al campione.
  3. Osservazione al microscopio elettronico a scansione (SEM)
    1. Rivestire i campioni pretrattati con platino utilizzando un rivestimento sputter e osservare al microscopio elettronico a scansione36.
    2. Registrare le caratteristiche morfologiche delle ife e dei conidi che crescono su PDA, M. alternatus e corpi modello di coleottero.
    3. Confrontare se i risultati sono coerenti con quelli dell'OM nel passaggio 2.3.

5. Valutazione dell'attività entomopatogena

  1. Preparazione della sospensione conidiale
    1. La preparazione della sospensione conidiale è la stessa dei passaggi 3.1.1-3.1.4.
  2. Pretrattamento del modello di coleottero
    1. Coltiva, nutri, sterilizza e affama T. castaneo come nel passaggio 3.5.1.
    2. Sterilizzare la crusca di frumento mediante UV e posizionare lo stesso peso su piastre di Petri sterili.
  3. Test di attività entomopatogena
    1. Trattare la crusca di frumento con la sospensione conidiale e asciugarla all'aria sotto un banco pulito a temperatura ambiente.
    2. Immergere T. coleotteri castaneum in sospensione coniidale per 10 s e trasferirli in una piastra di Petri (n = 20 in ciascuna piastra di Petri). Sostituire la crusca di frumento nuova con lo stesso trattamento conidiali ogni 4 giorni.
    3. Per il controllo negativo, applicare solo una soluzione sterile di Tween-80 allo 0,01%.
      NOTA: Mettere da parte almeno tre repliche per ogni gruppo di trattamento e per il controllo.
    4. Conta i coleotteri morti ogni giorno.
      NOTA: Toccare leggermente i coleotteri con una pinzetta sterile. Supponi che siano morti se c'è una mancanza di risposta.
  4. Analisi filogenetica multigenica
    1. Estrarre il DNA genomico fungino entomopatogeno come descritto al punto 2.1.
      NOTA: L'identificazione multigenica viene condotta per gli EPF parassiti che mostrano fenotipi di infezione significativi e forti attività entomopatogene contro il coleottero modello.
    2. Amplificare i seguenti geni, tra cui una regione che abbraccia il gene nucleare ribosomiale SSU34, un segmento del gene della subunità grande rRNA (LSU37,38), parte del gene del fattore di allungamento 1-alfa (tef-1α39), la seconda più grande sequenza di subunità della RNA polimerasi ІІ (rpb240) e parte della β-tubulina41 utilizzando le coppie di primer NS1/NS4, LR7/LROR, EF-983F/EF-2218R, RPB2-5'F/RPB2-5'R e TUB1/TUB22 (vedi Tabella 1), rispettivamente.
      1. Preparare la miscela di reazione PCR come al punto 2.2.1.
      2. Effettuare l'amplificazione come segue: denaturazione iniziale a 95 °C per 4 min, seguita da 35 cicli (tef-1α, rpb2, SSU), 38 cicli (LSU) o 39 cicli (β-tubulina) di denaturazione a 94 °C per 60 s, ricottura a 47 °C per 60 s (LSU), 55 °C per 60 s (tef-1α), 54 °C per 40 s (β-tubulina) e 50 °C per 30 s (rpb2, SSU), allungamento a 72 °C per 1 min e allungamento finale a 72 °C per 10 min.
    3. Sequenziare e allineare seguendo gli stessi passaggi mostrati nei passaggi 2.2.4-2.2.5.
    4. Eseguire l'analisi filogenetica mediante MEGA 6.0 sulla base del metodo di massima verosimiglianza (ML)42.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolamento e identificazione di isolati fungini da M. alternatus
Con l'aiuto di trappole attrattive, un gran numero (circa 500 coleotteri in totale) di M. Gli alternati sono stati raccolti da cinque regioni geografiche. Sono stati raccolti cadaveri di coleotteri con sintomi tipici di infezione da funghi entomopatogeni; Quindi, i tegumenti corporei di ogni coleottero sono stati sezionati in diverse posizioni come descritto nella fase 1.3 del protocollo. Di conseguen...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diverse popolazioni geografiche di FWB possono sviluppare varie interazioni con i funghi entomopatogeni naturali, a causa dell'adattamento ambientale a lungo termine delle specie di EPF ai fattori climatici locali e alla specifica popolazione genotipica dell'insetto ospite44,45. L'espansione dei siti di campionamento a più regioni di presenza di insetti aiuta ad aumentare la possibilità di acquisire diversi ceppi o specie di EPF ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questa ricerca è stata supportata dal National Key Research and Development Program of China (2021YFC2600100) e dalla Natural Science Foundation della provincia di Zhejiang (LY21C040001).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Provette da centrifuga da 1,5 mL, 2 mLBiosharpBS-15-M
10 µ L puntali per pipetteSangon BiotechF601216
10 µ L, 20 & micro; L, 100 & micro; L, 200 & micro; L, 1.000 µ L. pipetteRainin
1.000 µ L puntali per pipetteSangon BiotechF630102
fiale criogeniche da 2 mLCorning430659
20x tampone PBSSangon BiotechB548117-0500
200 &; L puntali per pipetteSangon BiotechF601227
2.000 bpTaKaRarSD0531
Provette da 50 mLNest602052
soluzione di glutaraldeide al 50%Sangon BiotechG916054
50x tampone TAESangon BiotechB548101
6x tampone di caricoTaKaRarSD0503
AgarosioSangon BiotechA610013
Etanolo anidroJkchemicalLB10V37
Biochimica Armadio di coltivazioneShanghaiyihengLRH-250F
CloroformioJuhua61553
Trappole per coleotteri commercialiFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
Gel imagerBio-RadGelDoc XR+
GlycerolSangon BiotechA600232
Centrifuga refrigerata ad alta velocitàSigmaD-37520
Pentola di sterilizzazione a vapore ad alta pressioneMettler ToledoJA5003
Alcool isopropilicoG75885Breagente generale
Colorante per acidi nucleiciSangon BiotechA616696
Microscopio ottico, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilm PM996
Misuratore PCRForza di guarigioneTrident960
Penicillina GMarklinGB15743
Agar di destrosio di patata, PDAOxoidCM0139
Brodo di destrosio di patate, PDBSolarbioP9240
PrimerSangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
Kit di isolamento rapido del DNA genomico per funghiSangon BiotechB518229
Microscopio elettronico a scansione, SEMHitachiS-3400N
StreptomicinaMarklinS6153
TetraciclinaMarklinT829835
Tween-80MärklinT6336
Liofilizzatore sottovuotoYamatoDC801
Agitatore a vorticeHLDWH-861
β-MercaptoetanoloM6230

References

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