Isolamento, identificazione comportamentale e valutazione della patogenicità di funghi entomopatogeni da una piralide forestale

Summary

Qui presentiamo un protocollo per ottenere funghi entomopatogeni da una piralide forestale e un modo sostitutivo per valutare le loro attività entomopatogene utilizzando un insetto modello di Coleotteri. Questo metodo è efficiente e conveniente per esplorare le risorse fungine entomopatogene da insetti nocivi che perforano il legno nelle foreste naturali.

Abstract

I piralidi forestali causano gravi danni agli alberi e perdite economiche in tutto il mondo. Il rilascio di funghi entomopatogeni (EPF) durante il periodo di emergenza FWB è considerato un'alternativa accettabile al controllo chimico. Tuttavia, le risorse EPF sono state significativamente meno esplorate per i FWB, a differenza degli insetti nocivi agricoli. Questo articolo presenta un protocollo per esplorare le risorse EPF dai FWB utilizzando come esempio le popolazioni selvatiche di Monochamus alternatus . In questo protocollo, l'assegnazione delle trappole innescate con M. Attrattivi alternatus a diverse popolazioni hanno garantito la raccolta di campioni adeguati con sintomi naturali di infezione, durante i periodi di emergenza del coleottero. Dopo aver sezionato finemente i tegumenti e averli posizionati su un mezzo selettivo, le specie fungine sono state isolate da ogni parte dei corpi dei coleotteri e identificate in base ai tratti molecolari e morfologici.

Diverse specie fungine sono state certificate come EPF parassite attraverso la reinfezione di M. alternatus sano con sospensioni di spore. I loro fenotipi comportamentali su M. alternatus sono stati osservati utilizzando la microscopia elettronica a scansione e ulteriormente confrontati con quelli sull'insetto modello di coleotteri Tribolium castaneum. Per gli EPF che presentano fenotipi di parassitismo coerenti su entrambe le specie di coleotteri, valutazione delle loro attività su T. castaneum ha fornito preziose informazioni sulla letalità per futuri studi su M. alternatus. Questo protocollo ha aiutato la scoperta di EPF recentemente segnalati sulle popolazioni di M. alternatus in Cina, che potrebbe essere applicato come approccio efficiente per esplorare più risorse di EPF da altri FWB.

Introduction

La devastazione causata dagli insetti nocivi ha portato a grandi perdite ecologiche ed economiche sia negli ecosistemi forestali che in quelli agricoli. La maggior parte dei parassiti agricoli si espone a nemici naturali o agenti di controllo artificiali danneggiando le piante ospiti. Invece, i piralidi del legno forestale (FWB) completano quasi completamente i loro cicli di sviluppo all'interno dei tronchi degli alberi ospiti¹, il che solleva grandi sfide per esplorare organismi di biocontrollo efficienti da FWB in campo selvatico. Quel che è peggio è che i FWB trasportano un gran numero di fitopatogeni

Protocol

1. Isolamento di funghi da M. alternatus (Figura 1)

1. Raccogli il campione di scarabeo
   1. Raccogli i pini scarabei segantino M. alternatus utilizzando trappole commerciali (vedi Tabella dei materiali) innescati con attrattivi prima dei periodi di emergenza previsti delle popolazioni di coleotteri nelle foreste di pini naturalmente infette.
      NOTA: In questo studio, i coleotteri sono stati raccolti da cinque regioni geografiche della Cina meridionale (Huzhou/Zhejiang, Liangshan/Sichuan, Xiamen/Fujian, Shaoguan/Guang....

Results

Isolamento e identificazione di isolati fungini da M. alternatus
Con l'aiuto di trappole attrattive, un gran numero (circa 500 coleotteri in totale) di M. Gli alternati sono stati raccolti da cinque regioni geografiche. Sono stati raccolti cadaveri di coleotteri con sintomi tipici di infezione da funghi entomopatogeni; Quindi, i tegumenti corporei di ogni coleottero sono stati sezionati in diverse posizioni come descritto nella fase 1.3 del protocollo. Di conseguen.......

Discussion

Diverse popolazioni geografiche di FWB possono sviluppare varie interazioni con i funghi entomopatogeni naturali, a causa dell'adattamento ambientale a lungo termine delle specie di EPF ai fattori climatici locali e alla specifica popolazione genotipica dell'insetto ospite^44,45. L'espansione dei siti di campionamento a più regioni di presenza di insetti aiuta ad aumentare la possibilità di acquisire diversi ceppi o specie di EPF .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provette da centrifuga da 1,5 mL, 2 mL	Biosharp	BS-15-M
10 µ L puntali per pipette	Sangon Biotech	F601216
10 µ L, 20 & micro; L, 100 & micro; L, 200 & micro; L, 1.000 µ L. pipette	Rainin
1.000 µ L puntali per pipette	Sangon Biotech	F630102
fiale criogeniche da 2 mL	Corning	430659
20x tampone PBS	Sangon Biotech	B548117-0500
200 &; L puntali per pipette	Sangon Biotech	F601227
2.000 bp	TaKaRar	SD0531
Provette da 50 mL	Nest	602052
soluzione di glutaraldeide al 50%	Sangon Biotech	G916054
50x tampone TAE	Sangon Biotech	B548101
6x tampone di carico	TaKaRar	SD0503
Agarosio	Sangon Biotech	A610013
Etanolo anidro	Jkchemical	LB10V37
Biochimica Armadio di coltivazione	Shanghaiyiheng	LRH-250F
Cloroformio	Juhua	61553
Trappole per coleotteri commerciali	FEIMENGDI	BF-8	www.yinyouji.com
Gel imager	Bio-Rad	GelDoc XR+
Glycerol	Sangon Biotech	A600232
Centrifuga refrigerata ad alta velocità	Sigma	D-37520
Pentola di sterilizzazione a vapore ad alta pressione	Mettler Toledo	JA5003
Alcool isopropilico	G75885B		reagente generale
Colorante per acidi nucleici	Sangon Biotech	A616696
Microscopio ottico, OM	Leica	DM2000
	Parafilm	Parafilm PM996
Misuratore PCR	Forza di guarigione	Trident960
Penicillina G	Marklin	GB15743
Agar di destrosio di patata, PDA	Oxoid	CM0139
Brodo di destrosio di patate, PDB	Solarbio	P9240
Primer	Sangon Biotech	/
Primers Taq	TaKaRar	RR902A
Kit di isolamento rapido del DNA genomico per funghi	Sangon Biotech	B518229
Microscopio elettronico a scansione, SEM	Hitachi	S-3400N
Streptomicina	Marklin	S6153
Tetraciclina	Marklin	T829835
Tween-80	Märklin	T6336
Liofilizzatore sottovuoto	Yamato	DC801
Agitatore a vortice	HLD	WH-861
β-Mercaptoetanolo		M6230