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Articolo metodologico

Uno strumento per creare automaticamente gap stabili e riproducibili senza cellule per migliorare l'affidabilità del saggio di guarigione delle ferite cellulari

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⸱

DOI:

10.3791/65794

⸱

4 ottobre 2024

 ,  ,  , 
1Faculty of Art and Communication, Kunming University of Science and Technology, 2The School of Integrated Chinese and Western Clinical Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Industrial Design, Hubei University of Technology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Attraverso l'incorporazione della progettazione dell'esperienza di interazione e dell'analisi dei requisiti dell'utente, introduciamo un innovativo raschietto cellulare che migliora i saggi di guarigione delle ferite cellulari in termini di riproducibilità, affidabilità, praticità, integrità cellulare ed esperienza utente.

Abstract

L'affidabilità della misurazione della migrazione cellulare nei saggi di guarigione delle ferite è spesso minata dalla prevalente instabilità metodologica, ovvero dal metodo basato sulla punta. Introduciamo uno strumento innovativo concepito per affrontare queste limitazioni. Il nostro nuovo raschietto cellulare supera l'approccio attuale, generando un gap più consistente e stabile senza cellule. Ripetuti esperimenti biologici rivelano che lo spazio libero da cellule prodotto dal raschietto cellulare mostra bordi più dritti e dimensioni e forma uniformi rispetto alla tecnica basata sulla punta (p < 0,05). In termini di design del prodotto, il raschietto cellulare vanta una combinazione di colori raffinata adatta agli ambienti di laboratorio, migliorando il monitoraggio dei risultati sperimentali e consentendo la sterilizzazione in autoclave per il riutilizzo. In particolare, dopo il trattamento, il raschietto cellulare dimostra un effetto trascurabile sulla vitalità e sulla proliferazione cellulare (97,31% e 24,41%, rispettivamente). Al contrario, il metodo basato su punta produce una minore vitalità cellulare (91,37%) e proliferazione (18,79%). Questa ricerca presenta il raschietto cellulare come un nuovo dispositivo riutilizzabile in grado di generare lacune riproducibili senza cellule preservando la vitalità cellulare, aumentando così l'affidabilità dei saggi di guarigione delle ferite rispetto alle tecniche esistenti.

Introduzione

I tumori sono caratterizzati da caratteristiche distinte come i vantaggi della crescita selettiva, il ricablaggio metabolico e la modulazione immunitaria, che contribuiscono in modo intrigante a migliorare la migrazione cellulare, un comportamento maligno critico delle cellule tumorali. Questa caratteristica influisce direttamente sulle metastasi a distanza del tumore primario, compromettendo la sopravvivenza a lungo termine dei pazienti 1,2,3. I vantaggi della crescita selettiva consentono alle cellule tumorali di competere con le cellule normali, mentre il ricablaggio metabolico supporta questa rapida proliferazione alterando i percorsi energetici. Allo stesso tempo, la modulazione immunitaria consente ai tumori di eludere le difese dell'organismo. Gli studi sottolineano la gravità di questo problema, dimostrando che le metastasi polmonari, spesso il risultato di una maggiore migrazione cellulare, sono un evento terminale che porta alla morte di pazienti con varitipi di cancro. Ad esempio, i tumori al seno5, il carcinoma cervicale4 e l'osteosarcoma6 rappresentano rispettivamente il 20%, il 9% e il 30% di tali casi. Pertanto, la valutazione della migrazione delle cellule tumorali è diventata parte integrante dell'attuale ricerca oncologica, evidenziando ulteriormente la natura sfaccettata della progressione tumorale.

Il saggio di guarigione delle ferite cellulari è un metodo facile da usare per misurare la migrazione cellulare in vitro , spesso impiegato negli studi oncologici7. La maggior parte degli sperimentatori utilizza i puntali delle pipette per creare manualmente le ferite cellulari8. Sebbene un tale metodo possa formare ferite cellulari in modo rapido e conveniente, presenta ancora molte limitazioni che influiscono sulla riproducibilità e sull'accuratezza per la valutazione della migrazione cellulare. In primo luogo, l'uso manuale delle punte delle pipette per creare graffi è fortemente influenzato dall'angolo di funzionamento, dalla forza e dalla velocità dell'operatore, influenzando la ripetibilità del metodo8. In secondo luogo, i difetti cellulari generati dai puntali di solito hanno bordi frastagliati piuttosto che dritti perché i puntali delle pipette sono prodotti in plastica con una certa elasticità9. Alcuni studi generano ferite posizionando inserti di coltura prefabbricati direttamente nella piastra di coltura cellulare per limitare l'intervallo di proliferazione cellulare10. Questo approccio elude i limiti del metodo basato su punte, come i bordi frastagliati e la riproducibilità. Tuttavia, anche con materiali biocompatibili, la coesistenza a lungo termine dell'incorporamento con le cellule influisce ancora sulla crescita cellulare11. Inoltre, l'inclusione può anche causare cambiamenti epigenetici cellulari nella zona marginale a causa della restrizione del contatto12. Inoltre, gli inserti a contatto prodotti con materiali biocompatibili sono costosi e difficili da riutilizzare, limitandone la fattibilità13. Pertanto, è necessario uno strumento nuovo, riproducibile e pratico per quantificare facilmente la migrazione cellulare in vitro .

L'obiettivo principale di questo metodo è quello di introdurre uno strumento innovativo per quantificare la migrazione cellulare in vitro negli studi oncologici, affrontando i limiti delle tecniche esistenti e migliorando la riproducibilità e l'accuratezza nella valutazione della migrazione cellulare.

Il razionale alla base dello sviluppo di questa tecnica risiede nell'importanza critica della valutazione della migrazione delle cellule tumorali in oncologia. I tumori mostrano segni distintivi distintivi, tra cui vantaggi di crescita selettiva, ricablaggio metabolico e modulazione immunitaria, che contribuiscono a migliorare la migrazione cellulare, un aspetto fondamentale della malignità del cancro. Questo metodo mira a fornire un mezzo più affidabile per studiare la migrazione cellulare, contribuendo a una comprensione più profonda del comportamento del tumore.

Questo metodo offre vantaggi sostanziali rispetto alle tecniche esistenti. I saggi manuali di scratch possono soffrire di interferenze operatore-dipendenti, mentre i foglietti illustrativi possono influire sulla crescita cellulare e sull'espressione genica. Al contrario, questo metodo offre una migliore ripetibilità, precisione e praticità, presentando una soluzione economica per misurare la migrazione cellulare in vitro nella ricerca oncologica. Risponde a un'esigenza cruciale di uno strumento affidabile e accessibile per studiare la migrazione cellulare in vari tipi di cancro, rendendolo un'aggiunta preziosa al campo.

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Protocollo

Tutti i partecipanti hanno fornito il pieno consenso informato scritto. L'approvazione etica non era applicabile poiché nel presente studio non sono stati inclusi campioni di tessuto animale o umano.

1. Indagine sulle esigenze della comunità di utenti

  1. Consegna questionari ai biologi/sperimentatori che lavorano su saggi di guarigione delle ferite cellulari. Raccogli i questionari compilati e usali per lo studio. Per questo studio, dal 12 ottobre 2021 al 3 febbraio 2022, sono stati consegnati 100 questionari a 100 biologi. La percentuale di risposta è stata del 97%.
  2. Chiedi agli intervistati di rispondere a domande come: quale degli esperimenti di graffio cellulare ti ha infastidito di più? E quale strumento è stato utilizzato per eseguire lo scratching delle celle? Segui queste domande con sotto-domande per rintracciare le cause.
  3. Indaga le percezioni degli sperimentali su strumenti come puntali per pipette e inserti per colture cellulari negli esperimenti di guarigione delle ferite cellulari. Comprendere e raccogliere le ragioni per cui hanno scelto uno strumento piuttosto che un altro, utilizzando la teoria della catena di fine dei mezzi basata sulle tecniche di laddering nelle sezioni14,15 dei questionari.
    NOTA: Il metodo ladder si divide in due tipologie: il metodo ladder soft con interviste approfondite e il metodo ladder hard con questionari o quiz carta e matita16. Il metodo della scala dura è stata la tecnica principale utilizzata in questo studio. La teoria della catena di fine dei mezzi suggerisce che la conoscenza esplicita posseduta dagli utenti target è superficiale e concreta, mentre la conoscenza tacita è profonda e astratta 17,18,19.

2. Progettazione e modellazione tridimensionale

  1. Disegna uno schizzo dalle intuizioni raccolte dal precedente sondaggio del questionario e avvia il processo di progettazione. Utilizzare questo schizzo preliminare come progetto di base.
    1. Elabora le dimensioni e il layout di ciascun componente applicando le funzioni Dim, DimRadius e DimDiameter nel software di modellazione.
    2. Eseguire le misurazioni con il calibro a corsoio con una precisione di 0,02 mm su piastre a 6 pozzetti per accertare le dimensioni finali del raschietto per celle. Verificare che siano 42,1 mm di lunghezza, 42,1 mm di larghezza e 18,5 mm di altezza. Presta attenzione ai dettagli in fase di progettazione, in particolare l'altezza del prodotto e la forma fisica nel pozzo, per facilitare un montaggio più fluido.
  2. Costruisci un modello tridimensionale ed esegui il rendering.
    1. Inizia la progettazione 3D in un software creando un modello di base. Fai clic su pulsanti come ExtrudeCrv per allungare e Loft per modellare il disegno. Rifinite il modello, quindi fate clic su Raccorda bordo (FilletEdge) per ottenere bordi smussati.
      NOTA: Altri pulsanti funzione utilizzati includono, Linee - Per disegnare segmenti di linea retta, Polilinee - Per creare linee continue composte da più segmenti, Rettangoli - Per disegnare forme rettangolari, Cerchi - Per disegnare forme circolari, Archi - Per disegnare forme ad arco o ellittiche, Punti - Per posizionare marcatori a punto singolo, Testo - Per aggiungere etichette di testo, Dimensioni - Per aggiungere dimensioni misurate ai modelli, Array - Per creare modelli copiati di oggetti, Rotate - Per ruotare gli oggetti agli angoli desiderati, Move - Per spostare gli oggetti in nuove posizioni, Scale - Per ridimensionare gli oggetti più grandi o più piccoli, Trim/Extend - Per tagliare o estendere gli oggetti per incontrare altre geometrie, Boolean Union/Difference/Intersection - Per combinare, sottrarre o trovare l'intersezione degli oggetti, Layers - Per organizzare gli oggetti su diversi livelli, Rendering : per generare viste renderizzate con materiali e illuminazione ed Esporta : per esportare la geometria del modello in altri formati di file.
    2. Importa il modello in un software di rendering 3D. Applica materiali tra cui plastica, spugna e acciaio, quindi regola l'illuminazione per un rendering realistico.
      NOTA: Un elenco generalizzato di pulsanti funzione include: Drag & Drop - Per applicare i materiali direttamente alle parti o ai modelli trascinando un materiale dalla libreria e rilasciandolo sul componente desiderato nella vista in tempo reale, Clic con il pulsante destro del mouse - Quando si fa clic con il pulsante destro del mouse su un materiale nella libreria, in genere vengono visualizzate le opzioni per: Applica alla selezione - Applica il materiale a una parte selezionata nella vista in tempo reale. Modifica materiale - Regola le proprietà del materiale. Proprietà del materiale (dopo aver selezionato un materiale) - Per accedere e modificare proprietà specifiche del materiale, come colore, rugosità, indice di rifrazione e altri attributi. Barra di ricerca - Per trovare rapidamente un materiale nella libreria digitandone il nome o le parole chiave associate. Categorie/Cartelle - Per navigare tra diverse categorie o cartelle di materiali come metalli, plastica, vetro, ecc. Aggiungi ai preferiti - Per contrassegnare determinati materiali come preferiti per un facile accesso durante le sessioni future. Tasti di scelta rapida - È possibile accedere ad alcune operazioni tramite tasti di scelta rapida. Ad esempio, M è di solito il tasto di scelta rapida per visualizzare rapidamente le proprietà del materiale di una parte selezionata.
    3. Infine, migliora il contrasto (+56) e la saturazione dell'immagine (Vividezza +19, Saturazione +7) nei software fotografici e di progettazione e aggiungi elementi di sfondo (informazioni di testo e colore dal bianco allo sfondo sfumato grigio chiaro) per il contesto per garantire una rappresentazione realistica e di alta qualità del prodotto.
      1. Utilizzare Regolazioni > immagine, Luminosità/Contrasto per regolare il contrasto di un'immagine. Utilizzare Tonalità/Saturazione immagine > per modificare il livello di saturazione dell'immagine. Utilizzare lo strumento Testo (icona T) per aggiungere informazioni di testo all'immagine.
        NOTA: Un elenco generalizzato di pulsanti funzione include Strumento Ellisse (U) - Per disegnare punti/cerchi. Imposta lo strumento per disegnare una forma, scegli il colore di riempimento desiderato, quindi fai clic e trascina (tenendo premuto Maiusc per mantenere un cerchio perfetto) per creare un punto. Strumento Linea (U) - Per disegnare linee rette sull'immagine. Seleziona lo strumento, imposta la larghezza della linea desiderata, quindi fai clic e trascina per disegnare una linea. Strumento Pennello (B) - Un modo alternativo per disegnare punti e linee. Seleziona la dimensione e la forma del pennello, quindi fai clic (per i punti) o fai clic e trascina (per le linee).
  3. Dopo aver completato il modello tridimensionale, procedere alla produzione del raschietto cellulare tramite il metodo di macinazione e assemblaggio 20,21,22.

3. Produzione

  1. Utilizzare la teoria del colore, dei materiali e della finitura (CMF) nel presente studio per progettare i prototipi del raschietto cellulare. La teoria CMF funge da metodologia di progettazione nella ricerca scientifica. Migliora l'usabilità del prodotto, modella la percezione dell'utente e indirizza la selezione dei materiali 23,24,25.
    1. Seleziona i colori da utilizzare nel raschietto per celle dal sistema di colori standard, tra cui Nero 6 C, Grigio freddo 6 C e 11-0601TPG26,27.
    2. Per costruire il raschietto cellulare che soddisfi gli standard di laboratorio, scegliere materiali appropriati tra cui polipropilene (PP), spugna e acciaio ad alto tenore di carbonio. Per la fabbricazione di prototipi fisici, inizia utilizzando una stampante 3D per produrre la struttura strutturale. Successivamente, utilizzare connettori o agenti adesivi per completare il montaggio del raschietto.
      NOTA: Per preparare il prodotto fisico del raschietto cellulare, macinare e assemblare i materiali necessari. I protocolli di sicurezza devono essere seguiti durante l'intero processo per garantire un prodotto finale sicuro ed efficace.
    3. Passa al processo di finitura, che può comportare il taglio, la molatura, la lucidatura, lo stampaggio o altre tecniche. Inizia levigando il modello utilizzando una carta vetrata a grana media e grana 120 per rimuovere eventuali bordi ruvidi.
    4. Seguire con una carta vetrata a grana fine e grana 220 per ottenere una superficie liscia.
    5. Post-levigatura per levigare le superfici, assicurandosi che i connettori plug-in o integrati siano abbinati correttamente.
    6. Unire saldamente le guide I e II utilizzando i connettori (aste fisse) per garantire un montaggio robusto e duraturo del raschiatore per celle. Ottenere la forma fissa finale del raschietto cellulare attraverso una combinazione di fissaggio meccanico e incollaggio. Utilizzare elementi di fissaggio, in particolare una struttura a mortasa e tenone, per fissare le parti insieme attraverso la forza meccanica. Inoltre, per migliorare la resistenza dell'assemblaggio, applicare adesivo (colla) per legare ulteriormente i componenti.
    7. Autoclavare il raschiatore a 121,3 °C per 30 minuti per assicurarsi che mantenga la sua forma originale e le sue proprietà fisiche.

4. Coltura cellulare

  1. Coltivare cellule HOS in un terreno minimo essenziale integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina. Coltivarli a 37 °C con il 5% di CO2.
  2. Cambiare il terreno di coltura ogni 2 giorni.
  3. Quando la crescita cellulare supera l'80% di confluenza, aggiungere 1 mL di tripsina con EDTA allo 0,25% e digerire per 60 s. Successivamente, centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti per la subcoltura. Rimuovere il surnatante e aggiungere il terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale di 5 x 104 cellule per pozzetto. Utilizzare un contatore di celle automatizzato per il conteggio delle cellule.

5. Valutazione del potenziale di ferita cellulare del raschietto cellulare e del metodo basato su punte

  1. Preparare tutti i materiali per la ferita e sterilizzarli con radiazioni ultraviolette esponendoli per 30 minuti.
  2. Dopo la sterilizzazione, avvolgere le cellule HOS confluenti al 100% in piastre a 6 pozzetti a una concentrazione di 5 x 104 cellule per pozzetto utilizzando il metodo del raschietto cellulare o il metodo basato su punte.
    1. Per il metodo basato su punta, utilizzare una punta da 100 μl e trascinarla sulla cella contenente il terreno con 1 tratto in direzione orizzontale e l'altro in direzione verticale.
    2. Per il metodo del raschietto cellulare, posizionare il prototipo del raschietto in uno dei pozzetti e con l'aiuto della pinzetta premere delicatamente una volta. Le cellule sono ferite. Esegui ogni esperimento di ferita in triplice copia.
  3. Analizza tutte le ferite cellulari utilizzando un sistema di microscopio digitale e un software di imaging.

6. Misurare la vitalità cellulare e la proliferazione cellulare

  1. Eseguire tutti i saggi di vitalità cellulare seguendo il protocollo fornito nel kit CCK-8.
  2. Incubare le cellule con la soluzione di CCK-8 per 2 ore a 37 °C, quindi misurare la loro assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre per quantificare la vitalità cellulare.
  3. Progettare il saggio di incorporazione della 5-etinil-20-deossiuridina (EdU) per quantificare accuratamente la duplicazione del DNA e quantificare direttamente il rapporto di proliferazione cellulare. Determinare l'influenza di diversi metodi per generare ferite cellulari sulla proliferazione cellulare utilizzando il saggio EdU, seguendo il protocollo delineato nella precedente pubblicazione28.
  4. Colora le cellule e visualizzale utilizzando un sistema di microscopio digitale. Assicurarsi che ogni esperimento venga eseguito in triplice copia.

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Risultati

Sezionare le richieste degli utenti di strumenti per generare ferite cellulari
L'attuale metodo sperimentale per generare ferite cellulari richiede un ulteriore miglioramento per affrontare molti problemi che compromettono la riproducibilità biologica, la robustezza, il consumo economico e l'esperienza dell'utente del saggio di guarigione delle ferite cellulari. Abbiamo utilizzato il metodo dell'hard laddering per analizzare le esigenze degli utenti coinvolti negli esperimenti biologici tramite questi...

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Discussione

Il presente studio mirava a sviluppare uno strumento meccanizzato automatico per il saggio di guarigione delle ferite cellulari. Per quanto ne sappiamo, rappresenta il primo tentativo di applicare una struttura meccanizzata per creare automaticamente ferite cellulari con un solo clic. In questo modo, miriamo ad affrontare le carenze del metodo tradizionale basato sulle punte, come la bassa riproducibilità e lo stato di graffio instabile. Beneficiando dei risultati positivi e del feedback...

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questo studio è supportato dalla sovvenzione della National Social Science Foundation (22FYSB023), della Hubei Industrial Design Center Research Foundation (08hqt201412046) e della Humanities and Social Science Foundation del Dipartimento provinciale dell'istruzione di Hubei (15Y054).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit CCK-8Beyotime Company, CinaC0037
fetale bovinoOlympus
Procell Scienze della Vita & Technology Co., LtdCL-0360
Image-Pro PlusMedia Cyberneticsversione 6.0
KeyShotLuxionversione 11.0Software di rendering 3D
lettore di micropiastreBioTek, tedescoELX808
Minimum Essential MediumGibco, USA11095080
Sistema di corrispondenza Pantonecorrispondenza dei colori commerciale
penicillina-streptomicinaBeyotime Company, CinaST488
PhotoshopAdobefoto e software di progettazione
Rhinoceros 3DRobert McNeel & Associatesversione 7.0Software di progettazione 3D
TC20 Contatore di cellule automatizzatoBio-RadTC20
TripsinaCytiva  HyClone, Stati UnitiSH30042.01
Sistema di microscopio digitale Siero IX81 Gibco, USA 16000044 HOS 

Riferimenti

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