Articolo metodologico

Uno strumento per creare automaticamente gap stabili e riproducibili senza cellule per migliorare l'affidabilità del saggio di guarigione delle ferite cellulari

DOI:

10.3791/65794

⸱

4 ottobre 2024

 ,  ,  , 
1Faculty of Art and Communication, Kunming University of Science and Technology, 2The School of Integrated Chinese and Western Clinical Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Industrial Design, Hubei University of Technology

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Attraverso l'incorporazione della progettazione dell'esperienza di interazione e dell'analisi dei requisiti dell'utente, introduciamo un innovativo raschietto cellulare che migliora i saggi di guarigione delle ferite cellulari in termini di riproducibilità, affidabilità, praticità, integrità cellulare ed esperienza utente.

Abstract

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L'affidabilità della misurazione della migrazione cellulare nei saggi di guarigione delle ferite è spesso minata dalla prevalente instabilità metodologica, ovvero dal metodo basato sulla punta. Introduciamo uno strumento innovativo concepito per affrontare queste limitazioni. Il nostro nuovo raschietto cellulare supera l'approccio attuale, generando un gap più consistente e stabile senza cellule. Ripetuti esperimenti biologici rivelano che lo spazio libero da cellule prodotto dal raschietto cellulare mostra bordi più dritti e dimensioni e forma uniformi rispetto alla tecnica basata sulla punta (p < 0,05). In termini di design del prodotto, il raschietto cellulare vanta una combinazione di colori raffinata adatta agli ambienti di laboratorio, migliorando il monitoraggio dei risultati sperimentali e consentendo la sterilizzazione in autoclave per il riutilizzo. In particolare, dopo il trattamento, il raschietto cellulare dimostra un effetto trascurabile sulla vitalità e sulla proliferazione cellulare (97,31% e 24,41%, rispettivamente). Al contrario, il metodo basato su punta produce una minore vitalità cellulare (91,37%) e proliferazione (18,79%). Questa ricerca presenta il raschietto cellulare come un nuovo dispositivo riutilizzabile in grado di generare lacune riproducibili senza cellule preservando la vitalità cellulare, aumentando così l'affidabilità dei saggi di guarigione delle ferite rispetto alle tecniche esistenti.

Introduzione

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I tumori sono caratterizzati da caratteristiche distinte come i vantaggi della crescita selettiva, il ricablaggio metabolico e la modulazione immunitaria, che contribuiscono in modo intrigante a migliorare la migrazione cellulare, un comportamento maligno critico delle cellule tumorali. Questa caratteristica influisce direttamente sulle metastasi a distanza del tumore primario, compromettendo la sopravvivenza a lungo termine dei pazienti 1,2,3. I vantaggi della crescita selettiva consentono alle cellule tumorali di competere con le cellule normali, mentre il ricablaggio metabolico supporta questa rapida proliferazione alterando i percorsi energetici. Allo stesso tempo, la modulazione immunitaria consente ai tumori di eludere le difese dell'organismo. Gli studi sottolineano la gravità di questo problema, dimostrando che le metastasi polmonari, spesso il risultato di una maggiore migrazione cellulare, sono un evento terminale che porta alla morte di pazienti con varitipi di cancro. Ad esempio, i tumori al seno5, il carcinoma cervicale4 e l'osteosarcoma6 rappresentano rispettivamente il 20%, il 9% e il 30% di tali casi. Pertanto, la valutazione della migrazione delle cellule tumorali è diventata parte integrante dell'attuale ricerca oncologica, evidenziando ulteriormente la natura sfaccettata della progressione tumorale.

Il saggio di guarigione delle ferite cellulari è un metodo facile da usare per misurare la migrazione cellulare in vitro , spesso impiegato negli studi oncologici7. La maggior parte degli sperimentatori utilizza i puntali delle pipette per creare manualmente le ferite cellulari8. Sebbene un tale metodo possa formare ferite cellulari in modo rapido e conveniente, presenta ancora molte limitazioni che influiscono sulla riproducibilità e sull'accuratezza per la valutazione della migrazione cellulare. In primo luogo, l'uso manuale delle punte delle pipette per creare graffi è fortemente influenzato dall'angolo di funzionamento, dalla forza e dalla velocità dell'operatore, influenzando la ripetibilità del metodo8. In secondo luogo, i difetti cellulari generati dai puntali di solito hanno bordi frastagliati piuttosto che dritti perché i puntali delle pipette sono prodotti in plastica con una certa elasticità9. Alcuni studi generano ferite posizionando inserti di coltura prefabbricati direttamente nella piastra di coltura cellulare per limitare l'intervallo di proliferazione cellulare10. Questo approccio elude i limiti del metodo basato su punte, come i bordi frastagliati e la riproducibilità. Tuttavia, anche con materiali biocompatibili, la coesistenza a lungo termine dell'incorporamento con le cellule influisce ancora sulla crescita cellulare11. Inoltre, l'inclusione può anche causare cambiamenti epigenetici cellulari nella zona marginale a causa della restrizione del contatto12. Inoltre, gli inserti a contatto prodotti con materiali biocompatibili sono costosi e difficili da riutilizzare, limitandone la fattibilità13. Pertanto, è necessario uno strumento nuovo, riproducibile e pratico per quantificare facilmente la migrazione cellulare in vitro .

L'obiettivo principale di questo metodo è quello di introdurre uno strumento innovativo per quantificare la migrazione cellulare in vitro negli studi oncologici, affrontando i limiti delle tecniche esistenti e migliorando la riproducibilità e l'accuratezza nella valutazione della migrazione cellulare.

Il razionale alla base dello sviluppo di questa tecnica risiede nell'importanza critica della valutazione della migrazione delle cellule tumorali in oncologia. I tumori mostrano segni distintivi distintivi, tra cui vantaggi di crescita selettiva, ricablaggio metabolico e modulazione immunitaria, che contribuiscono a migliorare la migrazione cellulare, un aspetto fondamentale della malignità del cancro. Questo metodo mira a fornire un mezzo più affidabile per studiare la migrazione cellulare, contribuendo a una comprensione più profonda del comportamento del tumore.

Questo metodo offre vantaggi sostanziali rispetto alle tecniche esistenti. I saggi manuali di scratch possono soffrire di interferenze operatore-dipendenti, mentre i foglietti illustrativi possono influire sulla crescita cellulare e sull'espressione genica. Al contrario, questo metodo offre una migliore ripetibilità, precisione e praticità, presentando una soluzione economica per misurare la migrazione cellulare in vitro nella ricerca oncologica. Risponde a un'esigenza cruciale di uno strumento affidabile e accessibile per studiare la migrazione cellulare in vari tipi di cancro, rendendolo un'aggiunta preziosa al campo.

Protocollo

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Tutti i partecipanti hanno fornito il pieno consenso informato scritto. L'approvazione etica non era applicabile poiché nel presente studio non sono stati inclusi campioni di tessuto animale o umano.

1. Indagine sulle esigenze della comunità di utenti

  1. Consegna questionari ai biologi/sperimentatori che lavorano su saggi di guarigione delle ferite cellulari. Raccogli i questionari compilati e usali per lo studio. Per questo studio, dal 12 ottobre 2021 al 3 febbraio 2022, sono stati consegnati 100 questionari a 100 biologi. La percentuale di risposta è stata del 97%.
  2. Chiedi agli intervistati di rispondere a domande come: quale degli esperimenti di graffio cellulare ti ha infastidito di più? E quale strumento è stato utilizzato per eseguire lo scratching delle celle? Segui queste domande con sotto-domande per rintracciare le cause.
  3. Indaga le percezioni degli sperimentali su strumenti come puntali per pipette e inserti per colture cellulari negli esperimenti di guarigione delle ferite cellulari. Comprendere e raccogliere le ragioni per cui hanno scelto uno strumento piuttosto che un altro, utilizzando la teoria della catena di fine dei mezzi basata sulle tecniche di laddering nelle sezioni14,15 dei questionari.
    NOTA: Il metodo ladder si divide in due tipologie: il metodo ladder soft con interviste approfondite e il metodo ladder hard con questionari o quiz carta e matita16. Il metodo della scala dura è stata la tecnica principale utilizzata in questo studio. La teoria della catena di fine dei mezzi suggerisce che la conoscenza esplicita posseduta dagli utenti target è superficiale e concreta, mentre la conoscenza tacita è profonda e astratta 17,18,19.

2. Progettazione e modellazione tridimensionale

  1. Disegna uno schizzo dalle intuizioni raccolte dal precedente sondaggio del questionario e avvia il processo di progettazione. Utilizzare questo schizzo preliminare come progetto di base.
    1. Elabora le dimensioni e il layout di ciascun componente applicando le funzioni Dim, DimRadius e DimDiameter nel software di modellazione.
    2. Eseguire le misurazioni con il calibro a corsoio con una precisione di 0,02 mm su piastre a 6 pozzetti per accertare le dimensioni finali del raschietto per celle. Verificare che siano 42,1 mm di lunghezza, 42,1 mm di larghezza e 18,5 mm di altezza. Presta attenzione ai dettagli in fase di progettazione, in particolare l'altezza del prodotto e la forma fisica nel pozzo, per facilitare un montaggio più fluido.
  2. Costruisci un modello tridimensionale ed esegui il rendering.
    1. Inizia la progettazione 3D in un software creando un modello di base. Fai clic su pulsanti come ExtrudeCrv per allungare e Loft per modellare il disegno. Rifinite il modello, quindi fate clic su Raccorda bordo (FilletEdge) per ottenere bordi smussati.
      NOTA: Altri pulsanti funzione utilizzati includono, Linee - Per disegnare segmenti di linea retta, Polilinee - Per creare linee continue composte da più segmenti, Rettangoli - Per disegnare forme rettangolari, Cerchi - Per disegnare forme circolari, Archi - Per disegnare forme ad arco o ellittiche, Punti - Per posizionare marcatori a punto singolo, Testo - Per aggiungere etichette di testo, Dimensioni - Per aggiungere dimensioni misurate ai modelli, Array - Per creare modelli copiati di oggetti, Rotate - Per ruotare gli oggetti agli angoli desiderati, Move - Per spostare gli oggetti in nuove posizioni, Scale - Per ridimensionare gli oggetti più grandi o più piccoli, Trim/Extend - Per tagliare o estendere gli oggetti per incontrare altre geometrie, Boolean Union/Difference/Intersection - Per combinare, sottrarre o trovare l'intersezione degli oggetti, Layers - Per organizzare gli oggetti su diversi livelli, Rendering : per generare viste renderizzate con materiali e illuminazione ed Esporta : per esportare la geometria del modello in altri formati di file.
    2. Importa il modello in un software di rendering 3D. Applica materiali tra cui plastica, spugna e acciaio, quindi regola l'illuminazione per un rendering realistico.
      NOTA: Un elenco generalizzato di pulsanti funzione include: Drag & Drop - Per applicare i materiali direttamente alle parti o ai modelli trascinando un materiale dalla libreria e rilasciandolo sul componente desiderato nella vista in tempo reale, Clic con il pulsante destro del mouse - Quando si fa clic con il pulsante destro del mouse su un materiale nella libreria, in genere vengono visualizzate le opzioni per: Applica alla selezione - Applica il materiale a una parte selezionata nella vista in tempo reale. Modifica materiale - Regola le proprietà del materiale. Proprietà del materiale (dopo aver selezionato un materiale) - Per accedere e modificare proprietà specifiche del materiale, come colore, rugosità, indice di rifrazione e altri attributi. Barra di ricerca - Per trovare rapidamente un materiale nella libreria digitandone il nome o le parole chiave associate. Categorie/Cartelle - Per navigare tra diverse categorie o cartelle di materiali come metalli, plastica, vetro, ecc. Aggiungi ai preferiti - Per contrassegnare determinati materiali come preferiti per un facile accesso durante le sessioni future. Tasti di scelta rapida - È possibile accedere ad alcune operazioni tramite tasti di scelta rapida. Ad esempio, M è di solito il tasto di scelta rapida per visualizzare rapidamente le proprietà del materiale di una parte selezionata.
    3. Infine, migliora il contrasto (+56) e la saturazione dell'immagine (Vividezza +19, Saturazione +7) nei software fotografici e di progettazione e aggiungi elementi di sfondo (informazioni di testo e colore dal bianco allo sfondo sfumato grigio chiaro) per il contesto per garantire una rappresentazione realistica e di alta qualità del prodotto.
      1. Utilizzare Regolazioni > immagine, Luminosità/Contrasto per regolare il contrasto di un'immagine. Utilizzare Tonalità/Saturazione immagine > per modificare il livello di saturazione dell'immagine. Utilizzare lo strumento Testo (icona T) per aggiungere informazioni di testo all'immagine.
        NOTA: Un elenco generalizzato di pulsanti funzione include Strumento Ellisse (U) - Per disegnare punti/cerchi. Imposta lo strumento per disegnare una forma, scegli il colore di riempimento desiderato, quindi fai clic e trascina (tenendo premuto Maiusc per mantenere un cerchio perfetto) per creare un punto. Strumento Linea (U) - Per disegnare linee rette sull'immagine. Seleziona lo strumento, imposta la larghezza della linea desiderata, quindi fai clic e trascina per disegnare una linea. Strumento Pennello (B) - Un modo alternativo per disegnare punti e linee. Seleziona la dimensione e la forma del pennello, quindi fai clic (per i punti) o fai clic e trascina (per le linee).
  3. Dopo aver completato il modello tridimensionale, procedere alla produzione del raschietto cellulare tramite il metodo di macinazione e assemblaggio 20,21,22.

3. Produzione

  1. Utilizzare la teoria del colore, dei materiali e della finitura (CMF) nel presente studio per progettare i prototipi del raschietto cellulare. La teoria CMF funge da metodologia di progettazione nella ricerca scientifica. Migliora l'usabilità del prodotto, modella la percezione dell'utente e indirizza la selezione dei materiali 23,24,25.
    1. Seleziona i colori da utilizzare nel raschietto per celle dal sistema di colori standard, tra cui Nero 6 C, Grigio freddo 6 C e 11-0601TPG26,27.
    2. Per costruire il raschietto cellulare che soddisfi gli standard di laboratorio, scegliere materiali appropriati tra cui polipropilene (PP), spugna e acciaio ad alto tenore di carbonio. Per la fabbricazione di prototipi fisici, inizia utilizzando una stampante 3D per produrre la struttura strutturale. Successivamente, utilizzare connettori o agenti adesivi per completare il montaggio del raschietto.
      NOTA: Per preparare il prodotto fisico del raschietto cellulare, macinare e assemblare i materiali necessari. I protocolli di sicurezza devono essere seguiti durante l'intero processo per garantire un prodotto finale sicuro ed efficace.
    3. Passa al processo di finitura, che può comportare il taglio, la molatura, la lucidatura, lo stampaggio o altre tecniche. Inizia levigando il modello utilizzando una carta vetrata a grana media e grana 120 per rimuovere eventuali bordi ruvidi.
    4. Seguire con una carta vetrata a grana fine e grana 220 per ottenere una superficie liscia.
    5. Post-levigatura per levigare le superfici, assicurandosi che i connettori plug-in o integrati siano abbinati correttamente.
    6. Unire saldamente le guide I e II utilizzando i connettori (aste fisse) per garantire un montaggio robusto e duraturo del raschiatore per celle. Ottenere la forma fissa finale del raschietto cellulare attraverso una combinazione di fissaggio meccanico e incollaggio. Utilizzare elementi di fissaggio, in particolare una struttura a mortasa e tenone, per fissare le parti insieme attraverso la forza meccanica. Inoltre, per migliorare la resistenza dell'assemblaggio, applicare adesivo (colla) per legare ulteriormente i componenti.
    7. Autoclavare il raschiatore a 121,3 °C per 30 minuti per assicurarsi che mantenga la sua forma originale e le sue proprietà fisiche.

4. Coltura cellulare

  1. Coltivare cellule HOS in un terreno minimo essenziale integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina. Coltivarli a 37 °C con il 5% di CO2.
  2. Cambiare il terreno di coltura ogni 2 giorni.
  3. Quando la crescita cellulare supera l'80% di confluenza, aggiungere 1 mL di tripsina con EDTA allo 0,25% e digerire per 60 s. Successivamente, centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti per la subcoltura. Rimuovere il surnatante e aggiungere il terreno di coltura per ottenere una concentrazione finale di 5 x 104 cellule per pozzetto. Utilizzare un contatore di celle automatizzato per il conteggio delle cellule.

5. Valutazione del potenziale di ferita cellulare del raschietto cellulare e del metodo basato su punte

  1. Preparare tutti i materiali per la ferita e sterilizzarli con radiazioni ultraviolette esponendoli per 30 minuti.
  2. Dopo la sterilizzazione, avvolgere le cellule HOS confluenti al 100% in piastre a 6 pozzetti a una concentrazione di 5 x 104 cellule per pozzetto utilizzando il metodo del raschietto cellulare o il metodo basato su punte.
    1. Per il metodo basato su punta, utilizzare una punta da 100 μl e trascinarla sulla cella contenente il terreno con 1 tratto in direzione orizzontale e l'altro in direzione verticale.
    2. Per il metodo del raschietto cellulare, posizionare il prototipo del raschietto in uno dei pozzetti e con l'aiuto della pinzetta premere delicatamente una volta. Le cellule sono ferite. Esegui ogni esperimento di ferita in triplice copia.
  3. Analizza tutte le ferite cellulari utilizzando un sistema di microscopio digitale e un software di imaging.

6. Misurare la vitalità cellulare e la proliferazione cellulare

  1. Eseguire tutti i saggi di vitalità cellulare seguendo il protocollo fornito nel kit CCK-8.
  2. Incubare le cellule con la soluzione di CCK-8 per 2 ore a 37 °C, quindi misurare la loro assorbanza a 450 nm utilizzando un lettore di micropiastre per quantificare la vitalità cellulare.
  3. Progettare il saggio di incorporazione della 5-etinil-20-deossiuridina (EdU) per quantificare accuratamente la duplicazione del DNA e quantificare direttamente il rapporto di proliferazione cellulare. Determinare l'influenza di diversi metodi per generare ferite cellulari sulla proliferazione cellulare utilizzando il saggio EdU, seguendo il protocollo delineato nella precedente pubblicazione28.
  4. Colora le cellule e visualizzale utilizzando un sistema di microscopio digitale. Assicurarsi che ogni esperimento venga eseguito in triplice copia.

Risultati

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Sezionare le richieste degli utenti di strumenti per generare ferite cellulari
L'attuale metodo sperimentale per generare ferite cellulari richiede un ulteriore miglioramento per affrontare molti problemi che compromettono la riproducibilità biologica, la robustezza, il consumo economico e l'esperienza dell'utente del saggio di guarigione delle ferite cellulari. Abbiamo utilizzato il metodo dell'hard laddering per analizzare le esigenze degli utenti coinvolti negli esperimenti biologici tramite questionari29 (Figura 1A). Le informazioni coinvolte nel questionario, come i nomi, sono state rese anonime per proteggere la loro privacy. I dettagli del questionario sono riportati nella Tabella 1. Durante 6 settimane di indagine per 100 individui, sono stati ricevuti 97 questionari completamente compilati, 3 questionari sospetti e non validi; Il tasso di risposta è stato del 97,00%.

I risultati dimostrano che i problemi più preoccupanti nel test di guarigione delle ferite cellulari erano il bordo seghettato (non dritto) e la larghezza o le aree instabili delle ferite, che rappresentavano rispettivamente il 55,67% e il 29,90%. Questi erano significativamente più alti di quelli con un tasso di crescita cellulare più basso, contaminazione cellulare e altre opzioni rispettivamente con 3,09%, 5,15% e 6,19% (p < 0,001, Figura 1B). Per quanto riguarda la selezione degli strumenti per creare le ferite, l'uso di puntali per pipette era molto più diffuso rispetto agli inserti per colture cellulari (Figura 1C). Ciò è stato principalmente attribuito al fatto che gli inserti per colture cellulari sono piuttosto costosi e non riutilizzabili (Figura 1D), mentre i puntali per pipette sono economici, mostrano riproducibilità sperimentale (6,59%) e vitalità cellulare (20,88%, Figura 1E). È importante sottolineare che fino al 69,23% degli utenti ha sostenuto che il prezzo degli inserti per colture cellulari era superiore al loro budget (Figura 1D). Al contrario, solo 6 soggetti hanno scelto inserti per colture cellulari, in cui solo il 16,67% pensava che il loro prezzo fosse accettabile (Figura 1F). Infine, per quanto riguarda lo strumento innovativo per generare ferite cellulari, l'86,60% di essi era ottimista, mentre solo un numero inferiore di utenti era riluttante (4,12%, Figura 1G).

Successivamente, sono state analizzate le caratteristiche del prodotto di cui gli utenti avevano urgente bisogno 30,31,32. Queste caratteristiche includevano ferite diritte, larghezza e area delle ferite stabili, alta riproducibilità e prezzo accettabile. Di conseguenza, sono state svolte le successive attività di progettazione.

Decisione di progettare gli elementi e i materiali utilizzati nello sviluppo del raschietto cellulare
I dati di cui sopra mostrano che le forniture di laboratorio implementate nella ricerca biologica di routine devono essere rigorosamente sterili per evitare la contaminazione cellulare33. Pertanto, il raschietto cellulare proposto dovrebbe essere sterile. Sebbene gli strumenti monouso possano essere sterilizzati con ossido di etilene, il costo sperimentale aumenterà inevitabilmente 34,35,36. Pertanto, invece di materiali monouso, proponiamo di progettare il raschiatore cellulare con un materiale riutilizzabile con grande tolleranza alla sterilizzazione a vapore ad alta pressione (121,3 °C), per ridurre i costi e aumentare la flessibilità quando applicato in casi diversi37. Per soddisfare questi requisiti, il materiale utilizzato per costruire il raschietto per celle deve avere determinate caratteristiche fisiche e chimiche, tra cui la resistenza al calore, all'alta pressione e alla corrosione del vapore acqueo.

Per l'uso previsto del raschietto cellulare, oltre a soddisfare le funzioni di base come la realizzazione delle ferite dritte, dovrebbe anche avere un design e un colore accattivanti. In termini di modellazione, considerando i campi di applicazione e di destinazione, lo stile generale dovrebbe essere congeniale ai laboratori. L'aspetto non deve essere troppo ostentato da impedire al personale di osservare la progressione sperimentale. Inoltre, le sue dimensioni dovrebbero essere adatte per piastre a sei pozzetti e la superficie dovrebbe avere una sporgenza che consenta alle pinzette di raccoglierla in modo stabile.

Il CMF nel design è un aspetto critico della progettazione del prodotto che influenza l'estetica e l'esperienza dell'utente. La scelta del colore influisce sulla risposta emotiva, la selezione dei materiali influisce sulla funzionalità e sulla sostenibilità e la finitura determina la sensazione tattile e l'attrattiva visiva. I designer CMF armonizzano questi elementi, considerando le tendenze del mercato e l'identità del marchio, per creare prodotti che risuonino con gli utenti.

Secondo la teoria CMF, tre fattori critici, tra cui il colore, il materiale e il processo di finitura, sono stati considerati per determinare il loro impatto sulla funzione e sull'effetto visivo24. La selezione del colore è stata condotta per prima. In questo contesto, il colore si riferisce al colore intrinseco, che è il colore intrinseco di un oggetto o di una sostanza in condizioni di illuminazione standard, privo dell'influenza di fonti di luce esterne o riflessi. Dato che la piastra a sei pozzetti è realizzata in PP con una superficie trasparente, è stato scelto il grigio scuro come colore intrinseco. Questa scelta è stata fatta per facilitare l'identificazione e il funzionamento, poiché il grigio scuro offre un contrasto e una visibilità ottimali se sovrapposto ad altri colori. Inoltre, è meno probabile che il grigio scuro causi distorsioni del colore se combinato con altri colori, il che è anche fondamentale per l'osservazione. I componenti funzionali essenziali sono stati ulteriormente distinti dal nero (Figura 2A).

Il sistema commerciale di corrispondenza dei colori è stato scelto come standard per la selezione dei colori grazie alla sua ampia accettazione e utilizzo in vari settori. Basandosi sulla capacità dell'azienda di riprodurre colori coerenti su diversi mezzi, è stata scelta per lo studio in quanto ciò è fondamentale per garantire una rappresentazione accurata e coerente dei colori.

La selezione del materiale è stata eseguita sulla base dei suddetti risultati dei questionari. Il guscio e i componenti del raschietto sono stati realizzati in plastica resistente al calore, il polipropilene (PP), per soddisfare i requisiti della sterilizzazione in autoclave, come mostrato nella Figura 2B. L'acciaio ad alto tenore di carbonio è adatto per le molle, perché è stabile in ambienti di laboratorio resistenti alle alte e basse temperature e alla corrosione. Per il tamponamento sono state utilizzate spugne ad alta densità posizionate all'estremità del vetrino.

Infine, è stato sviluppato il processo di finitura. Poiché il raschietto cellulare è utilizzato frequentemente e facilmente contaminato e la qualità della superficie influisce sulla sterilizzazione, è preferibile una superficie liscia e lucida per il raschietto cellulare in quanto aiuta l'utente a identificare rapidamente la fonte di contaminazione e a gestirla, dando un senso di pulizia. Le punte sono parzialmente levigate per evitare danni al fondo della piastra di coltura, che possono influire sull'ambiente di coltura e provocare una restrizione della proliferazione cellulare38.

Progettazione e prototipo del raschiatore cellulare
Tre prototipi di raschietto cellulare sono stati progettati sulla base dei risultati sopra menzionati (Figura 3A). Gli studi dimostrano che le ferite cellulari più comunemente usate all'interno delle piastre di coltura cellulare erano a forma di croce39, che è molto diverso dal prototipo I che utilizzava ferite rettangolari; quindi il prototipo I era stato esonerato (Figura 3A). Sebbene il prototipo II e III potessero entrambi creare aree prive di cellule a forma di croce, la guida di scorrimento del prototipo II era difficile da fissare nei dischi di coltura cellulare e la sua infrastruttura era piuttosto complicata (Figura 3A). Dopo prudenti discussioni, il prototipo III si distinse come modello finale per la produzione di raschiatori cellulari.

In particolare, dato che la forma delle punte potrebbe influenzare direttamente l'area libera da celle in termini di bordi e dimensioni, sono stati progettati tre schizzi per la selezione. Lo schizzo avevo una parte superiore affilata, che poteva fornire bordi molto dritti; tuttavia, l'interfaccia di coltura che consente la proliferazione cellulare potrebbe essere compromessa se le punte sono troppo affilate (Figura 3B). Sketch II offriva una parte superiore quadrata, che avrebbe potuto evitare la compromissione delle piastre di coltura cellulare. Tuttavia, poiché la superficie di contatto tra la punta e la parte inferiore della piastra di coltura è quadrata, è instabile quando la si utilizza (Figura 3B). Lo schizzo III ha fornito una punta arrotondata smussata, evitando efficacemente i problemi di cui sopra (Figura 3C). Pertanto, è stato selezionato come progetto finale.

Il design è stato ottimizzato sotto tre aspetti: il metodo di fissaggio del fissatore, la spugna del cuscino incorporata e la facilità di presa, rispettivamente. In primo luogo, i metodi di fissaggio del prodotto previsti includevano l'instabilità40, la mortasa e il tenone41 e la rotazione42. Considerando il costo di produzione effettivo e l'operatività, è stato progettato un artiglio sotto il fissatore a forma di croce per facilitare il bloccaggio del bordo del pozzo. Inoltre, nel test di guarigione da graffio cellulare, abbiamo osservato che le punte rimbalzavano dopo aver toccato il muro vicino all'estremità a causa della lunghezza e della durezza fisse dei vetrini, che influenzavano lo stato del graffio. Pertanto, abbiamo aggiunto una spugna ammortizzante all'estremità dello scivolo per stabilizzare il movimento delle punte. (Figura 3A,C). Infine, è stata aggiunta una depressione superficiale alla sporgenza per facilitare la presa delle pinzette.

Un modello tridimensionale è stato ulteriormente costruito utilizzando il software di progettazione 3D. Il suo rendering è mostrato nella Figura 4A. Il grafico esplosivo elabora le strutture interne dettagliate del raschietto cellulare, che mostra le sue caratteristiche necessarie discusse sopra (Figura 4B). Inoltre, per raggiungere l'obiettivo di uno scorrimento regolare delle punte e dei bordi dritti, viene adottata la struttura interna di trasmissione meccanica della potenza. L'intera unità funzionale del raschiatore cellulare è composta dalla parte di controllo. Nel lavoro effettivo, la leva di collegamento all'interno del raschietto per celle è collegata al pulsante superiore e l'estremità si sposta verso il basso dopo aver applicato pressione per far sì che l'estremità si pieghi. La molla all'interno della slitta viene rilasciata per spingere le punte a muoversi. Infine, si ferma alla spugna con una fessura stretta per terminare la raschiatura e poi si azzera per resettare quando viene riutilizzata (Figura 5A). Inoltre, la facilità di apprendimento e la comodità d'uso sono i criteri per un biologo per misurare la qualità del prodotto. Pertanto, per il design dell'aspetto del prodotto, il layout della superficie ha seguito il principio di simmetria e pulizia43,44, distinguendo ed evidenziando diversi componenti attraverso diverse tonalità di colori nero, bianco e grigio (Figura 5A).

Il raschietto cellulare è superiore al metodo di graffiatura delle punte nell'uso pratico
Il prodotto fisico del raschietto cellulare è stato preparato utilizzando il metodo di macinazione e assemblaggio (Figura 5B). Come previsto, il raschiatore per celle si è integrato in modo eccellente con la piastra a sei pozzetti, con il supporto superiore a forma di croce che si adatta perfettamente al bordo della piastra, fornendo un forte fissaggio (Figura 5C). Inoltre, i puntali si sono adattati con precisione al fondo della piastra a sei pozzetti, facilitando la generazione regolare di aree prive di cellule. Infine, il raschietto cellulare è stato sterilizzato in autoclave per verificare se potesse essere riutilizzabile. Come mostrato nella Figura 5D, l'attuale raschiatore per celle ha mantenuto la forma e le prestazioni fisiche originali anche dopo la sterilizzazione in autoclave sotto i 121,3 °C per 30 minuti.

Il raschietto cellulare ha superato il metodo di creazione della ferita cellulare esistente nel test di benchmark. Dopo ripetuti test, il graffiatore cellulare ha mostrato un'elevata stabilità e riproducibilità nella preparazione della ferita, ha presentato una bassa fluttuazione nell'area di ciascuna ferita e bordi quasi dritti, con una deviazione standard dell'area priva di cellule di 483,73 e una deviazione dal bordo dritto di 5041,33 ± 2420,00. Al contrario, l'area di ciascuna ferita preparata dai puntali delle pipette ha mostrato una fluttuazione più elevata, con una deviazione standard dell'area libera da cellule di 3905,80 e una deviazione dal bordo dritto di 19562,33 ± 1068,39 (Figura 6A-C).

Infine, è stato valutato l'effetto sulla vitalità cellulare dopo ferite cellulari (Figura 6D). I risultati hanno dimostrato che 12 ore dopo il completamento della ferita cellulare, la vitalità cellulare era leggermente ma significativamente più alta nel gruppo raschiatore cellulare rispetto al gruppo delle punte. Il test EdU è stato condotto per confermare ulteriormente questi risultati e chiarire l'impatto dei diversi metodi di preparazione delle ferite cellulari sulla proliferazione cellulare, ovvero sulla replicazione del DNA. I risultati del test EdU hanno mostrato che la percentuale di cellule proliferanti nel gruppo raschiatore cellulare (24,41% ± 0,48) era significativamente superiore a quella del metodo delle punte (18,79% ± 1,46) dopo 12 ore (Figura 6E, F).

Questi dati attestano fortemente che l'attuale generatore di ferite cellulari ha superato l'attuale metodo per creare ferite cellulari in termini di stabilità e riproducibilità biologica. Ha avuto un basso impatto sulla vitalità e sulla proliferazione cellulare. Tutti questi notevoli vantaggi del generatore di ferite cellulari hanno confermato il suo potenziale per migliorare gli attuali saggi di ferita cellulare, garantendo l'affidabilità e la ripetibilità dei dati risultanti.

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Figura 1: Analisi delle richieste degli utenti. (A) Il grafico di Sankey presenta il flusso di lavoro dell'indagine basata su questionari per gli sperimentatori. (B) a (G) esporre i risultati dei questionari, comprese le domande da 1 a 6. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Design del prodotto con colori e materiali utilizzati. (A) Selezione dei colori. (B) Autoclave utilizzata in esperimenti biologici. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Progettazione del prodotto di strutture dettagliate. (A) Tre prototipi candidati di raschietto cellulare. (B) Tre schizzi di design della punta. (C) Disegno in tre viste del prototipo III selezionato che ne presenti il progetto generale e i parametri fisici e spaziali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Rendering del modello tridimensionale e visualizzazione delle strutture interne. (A) Rendering del modello tridimensionale. (B) Trama esplosiva che dimostri le strutture interne del raschietto cellulare proposto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Meccanismi di funzionamento del raschietto cellulare. (A) Gli schizzi mostrano come funziona il raschietto cellulare. (B) Prodotto fisico del raschietto cellulare. (C) Il raschietto per celle si inserisce in una piastra a 6 pozzetti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 6: Validazione sperimentale del raschietto cellulare. (A) Le ferite cellulari generate con diversi metodi e i loro risultati di confronto raggruppati sono stati mostrati in (B) e (C), la barra della scala è di 100 μm. (D) Risultati di vitalità cellulare. (E) e (F) Risultati del test Edu, la barra della scala è di 50 μm. Per la valutazione statistica, è stato condotto il test t per il confronto raggruppato e il valore p originale è stato aggiustato dal test di Holm-Bonferroni per evitare risultati falsi positivi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I) Quale dei seguenti è il problema più preoccupante per te nell'esperimento del graffio cellulare?
A) Assenza di bordi dritti
B) Larghezza instabile
C) Proliferazione lenta
D) Contaminazione cellulare
E) Altro
II) Quali strumenti usi per generare ferite cellulari
A) Puntali per pipette (passare alla domanda III)
B) Inserti per colture cellulari (passare alla domanda IV-V)
III) Perché non scegliere gli inserti per colture cellulari?
A) Vitalità cellulare
B) Non riutilizzabile
c) Costo
D) Altro
IV) Perché avete scelto gli inserti per colture cellulari?
A) Costo
B) Ripetibilità
C) Altro
V) Quali pensi siano i problemi più gravi con gli inserti per colture cellulari?
A) Stato della cella
B) Non riutilizzabile
C) Costoso
D) Altro
E) Soddisfatto
VI) Se esistesse uno strumento di graffiatura economico, riutilizzabile (autoclavabile) e altamente riproducibile, quanto sareste disposti ad acquistarlo e utilizzarlo?
A) Molto disponibile
B) Disponibilità
C) Non sono sicuro
D) Riluttanza

Tabella 1: Il questionario utilizzato in questo studio comprende sei domande volte a comprendere le situazioni che i biologi incontrano durante i saggi di guarigione delle ferite cellulari.

Discussione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente studio mirava a sviluppare uno strumento meccanizzato automatico per il saggio di guarigione delle ferite cellulari. Per quanto ne sappiamo, rappresenta il primo tentativo di applicare una struttura meccanizzata per creare automaticamente ferite cellulari con un solo clic. In questo modo, miriamo ad affrontare le carenze del metodo tradizionale basato sulle punte, come la bassa riproducibilità e lo stato di graffio instabile. Beneficiando dei risultati positivi e del feedback incoraggiante della comunità degli utenti, si prevede che il raschietto cellulare fornisca agli sperimentatori un'alternativa efficiente e stabile per la creazione di ferite cellulari, migliorando così significativamente il livello di fiducia dei risultati dell'analisi sperimentale.

Per l'utilizzo dell'attuale raschietto cellulare, l'utente deve 1) preparare le cellule in attesa di creare uno spazio libero da cellule simile ai metodi tradizionali come il metodo basato su punta, cioè la semina di cellule su una piastra a sei pozzetti a una data densità; 2) attendere che il tasso di convergenza cellulare raggiunga > 90%; 3) mettere il raschietto cellulare sterile in un pozzetto di piastra, fare clic sul pulsante come illustrato nella Figura 5 e lo spazio libero da cellule verrà creato automaticamente entro 1-2 s.

Il saggio di guarigione delle ferite cellulari è stato ampiamente utilizzato per misurare la capacità di migrazione cellulare. In genere, gli sperimentatori usano le punte delle pipette per creare ferite cellulari. Ad esempio, Tariq et al. hanno utilizzato una punta di pipetta per creare ferite cellulari per valutare la capacità di migrazione cellulare45; non a caso, Rahimi et al. hanno utilizzato una punta di pipetta in un saggio per osservare la capacità migratoria delle cellule PC346; nel saggio di migrazione delle cellule mesenchimali di topo, Cormier et al. hanno utilizzato anche una pistola pipetta,47; per dimostrare l'effetto dell'arsenico sulla migrazione delle cellule della pelle, Pinto et al. hanno usato, tra l'altro, una punta di pipetta per la raschiatura verticale48.

Tuttavia, come accennato in precedenza, l'utilizzo di una punta per creare ferite cellulari presenta diversi problemi, come l'area priva di cellule variabile, i bordi frastagliati e la dipendenza dalla forza dell'operatore e dall'angolo di graffio, con conseguente bassa riproducibilità49. I risultati attuali dei questionari hanno anche dimostrato che il metodo basato su puntali presenta vantaggi più evidenti rispetto agli inserti per colture cellulari, in particolare in termini di prezzo, tasso di sopravvivenza cellulare e riutilizzabilità dello strumento. In alternativa, gli inserti delle celle sono troppo costosi e difficili da riutilizzare, mentre entrambi gli strumenti presentano difetti. Pertanto, la comunità degli utenti è generalmente ottimista e disposta a provare strumenti innovativi. Questo studio ha progettato e sviluppato un nuovo strumento di preparazione dell'area priva di cellule per facilitare e stabilizzare la creazione di ferite cellulari.

Il contributo più importante del presente studio risiede nello sviluppo e nella validazione sperimentale del raschietto cellulare. Rispetto agli studi precedenti, i miglioramenti dell'attuale raschietto cellulare includono i seguenti tre punti principali. 1) fabbricazione stabile e conveniente di ferite cellulari. Questo studio ha dimostrato che, rispetto al metodo tradizionale basato su punte, le ferite cellulari prodotte dall'attuale raschietto cellulare avevano bordi dritti e potevano creare ferite simili in esperimenti ripetuti, il che ha notevolmente migliorato la riproducibilità e l'affidabilità degli esperimenti di guarigione delle ferite cellulari. 2) L'attuale raschietto cellulare ha avuto meno effetto sullo stato della cellula. Non ha influenzato la vitalità e la proliferazione cellulare (amplificazione del DNA), che era significativamente migliore rispetto al metodo basato su punta. Pertanto, si prevede che questo raschietto cellulare riduca ulteriormente l'influenza di fattori esterni sul saggio di guarigione della ferita cellulare negli esperimenti di routine. 3) Questo raschietto per celle è in buon accordo con le richieste della comunità degli utenti. I risultati del precedente sondaggio con questionario hanno mostrato che i requisiti degli utenti per il nuovo strumento per le ferite cellulari includono principalmente un'ampiezza uniforme della corsa, un'elevata riproducibilità, una procedura operativa semplice e un prezzo moderato, che sono stati raggiunti nell'attuale raschietto cellulare. Inoltre, il raschietto cellulare è progettato in colori neutri per trasmettere il concetto di design semplice e pratico di questo prodotto. Allo stesso tempo, il forte contrasto in bianco e nero evidenzia efficacemente le sue aree funzionali. Lo stile generale è una forma a croce formata dall'articolazione arrotondata della superficie curva, che fa riferimento alla forma convenzionale della ferita e suggerisce il ruolo del prodotto. La difficoltà dell'operazione viene ridotta semplificando il funzionamento e la funzione di ripristino manuale. In sintesi, i risultati indicano uno strumento alternativo promettente per gli sperimentatori per preparare i graffi cellulari in modo automatizzato e robusto con un solo clic, migliorando così la riproducibilità dei risultati scientifici.

I limiti di questo studio devono essere riconosciuti. La dimensione del campione degli intervistati nel questionario limita la generalizzabilità di questo studio; Pertanto, amplieremo ulteriormente la dimensione del campione in uno studio di follow-up per migliorare il raschietto cellulare. In secondo luogo, il grattatore cellulare deve essere incluso in uno studio ben pianificato con una popolazione più ampia di utenti, in modo che le prestazioni di questo raschiatore cellulare possano essere valutate in modo più completo.

Dichiarazioni

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.

Ringraziamenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio è supportato dalla sovvenzione della National Social Science Foundation (22FYSB023), della Hubei Industrial Design Center Research Foundation (08hqt201412046) e della Humanities and Social Science Foundation del Dipartimento provinciale dell'istruzione di Hubei (15Y054).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Kit CCK-8Beyotime Company, CinaC0037
fetale bovinoOlympus
Procell Scienze della Vita & Technology Co., LtdCL-0360
Image-Pro PlusMedia Cyberneticsversione 6.0
KeyShotLuxionversione 11.0Software di rendering 3D
lettore di micropiastreBioTek, tedescoELX808
Minimum Essential MediumGibco, USA11095080
Sistema di corrispondenza Pantonecorrispondenza dei colori commerciale
penicillina-streptomicinaBeyotime Company, CinaST488
PhotoshopAdobefoto e software di progettazione
Rhinoceros 3DRobert McNeel & Associatesversione 7.0Software di progettazione 3D
TC20 Contatore di cellule automatizzatoBio-RadTC20
TripsinaCytiva  HyClone, Stati UnitiSH30042.01
Sistema di microscopio digitale Siero IX81 Gibco, USA 16000044 HOS 

Riferimenti

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