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Articolo metodologico

A Planta Espressione genica e editing genico nelle foglie di bambù Moso

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DOI:

10.3791/65799

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18 agosto 2023

In questo articolo

Sommario

In questo studio, nel bambù è stato sviluppato un nuovo metodo di espressione genica e di editing genetico mediato da Agrobacterium . Questo metodo ha notevolmente migliorato l'efficienza della convalida della funzione genica nel bambù, il che ha implicazioni significative per l'accelerazione del processo di selezione del bambù.

Abstract

Per il bambù è stato sviluppato un nuovo metodo di trasformazione genica delle piante, che evita la necessità di processi di induzione e rigenerazione del callo che richiedono tempo e lavoro. Questo metodo prevede l'espressione genica mediata da Agrobacterium tramite ferimento e vuoto per le piantine di bambù. Ha dimostrato con successo l'espressione di geni esogeni, come il reporter RUBY e il gene Cas9, nelle foglie di bambù. La più alta efficienza di trasformazione per l'accumulo di betalaina nelle piantine RUBY è stata raggiunta utilizzando il ceppo GV3101, con una percentuale dell'85,2% dopo l'infezione. Sebbene il DNA estraneo non si sia integrato nel genoma del bambù, il metodo è stato efficiente nell'esprimere i geni esogeni. Inoltre, è stato sviluppato anche un sistema di editing genetico con un reporter nativo che utilizza questo metodo, da cui è stato generato un mutante in situ generato dal gene modificato della violaxantina de-epossidasi di bambù (PeVDE) in foglie di bambù, con un tasso di mutazione del 17,33%. La mutazione di PeVDE ha portato a una diminuzione dei valori di tempra non fotochimica (NPQ) in condizioni di luce elevata, che possono essere rilevati con precisione da un fluorimetro. Questo rende il PeVDE modificato un potenziale reporter nativo sia per i geni esogeni che per quelli endogeni nel bambù. Con il reporter di PeVDE, un gene della cinnamoil-CoA reduttasi è stato modificato con successo con un tasso di mutazione dell'8,3%. Questa operazione evita il processo di coltura tissutale o induzione del callo, che è rapido ed efficiente per l'espressione di geni esogeni e l'editing genetico endogeno nel bambù. Questo metodo può migliorare l'efficienza della verifica della funzione genica e aiuterà a rivelare i meccanismi molecolari delle principali vie metaboliche nel bambù.

Introduzione

Lo studio della funzione genica nel bambù è molto promettente per la comprensione avanzata del bambù e per sbloccare il suo potenziale di modificazione genetica. Un modo efficace per raggiungere questo obiettivo può essere raggiunto attraverso il processo di infezione mediata da Agrobacterium nelle foglie di bambù, in cui il frammento di T-DNA contenente geni esogeni viene introdotto nelle cellule, portando successivamente all'espressione dei geni all'interno delle cellule fogliari.

Il bambù è una risorsa preziosa e rinnovabile con una vasta gamma di applicazioni nella produzione, nell'arte e nella ricerca. Il bambù possiede eccell....

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Protocollo

1. Preparazione delle piantine di bambù

  1. Prepara piantine di bambù moso (Phyllostachys edulis) utilizzando semi raccolti a Guilin, Guangxi, Cina. Inizia immergendo i semi in acqua per 2-3 giorni, assicurandoti di cambiare l'acqua ogni giorno. Successivamente, crea un substrato mescolando terreno e vermiculite in un rapporto di 3:1.
  2. Semina i semi imbevuti nel substrato per la germinazione. Mantenere le piantine in condizioni di laboratorio, mantenendo la temperatura tra i 18-25 °C. Garantire un fotoperiodo di 16 ore di luce/8 ore di buio con un'intensità luminosa di 250-350 μmol/m2/s durante la fase di luce.
  3. ....

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Risultati

Agrobatterio-mediato nell'espressione genica delle piante nelle foglie di bambù
È stato dimostrato che il gene reporter RUBY è efficace nella visualizzazione dell'espressione genica transitoria grazie alla sua capacità di produrre betalaina rossa vivida dalla tirosina10. In questo studio, la trasformazione mediata da Agrobacterium è stata utilizzata per esprimere transitoriamente il gene esogeno RUBY nelle foglie di bambù (

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Discussione

Questo metodo riduce significativamente il tempo necessario rispetto ai metodi di trasformazione genetica tradizionali, che in genere richiedono 1-2 anni, e raggiunge l'espressione transitoria dei geni esogeni e l'editing genetico dei geni endogeni entro 5 giorni. Tuttavia, questo metodo ha dei limiti in quanto può trasformare solo una piccola percentuale di cellule e le foglie geneticamente modificate sono chimeriche e non hanno la capacità di rigenerarsi in piante complete. Ciononostante, questa tecnologia di espressio.......

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Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare il National Key Research and Development Program of China (Grant No. 2021YFD2200502), la National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31971736) per il sostegno finanziario.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
35S::RUBYAddgene, Stati Uniti160908Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404 e AGL1Biomed, ChinaBC304-01, BC303-01, BC301-01 e BC302-01For Agrobacterium
infection CTABSigma-Aldrich, United States57-09-0Estrazione del DNA
Imaging-PAM fluorimetroWalz, Effeltrich, GermaniaRileva la fluorescenza della clorofilla delle foglie di bambù
ImagingWinWalz, Effeltrich, GermaniaSoftware per l'imaging-PAM fluorimetro
Paq CI o Aar INEB, Stati UnitiR0745SIncorporare la sequenza target sul vettore CRISPR/Cas9.
PrimeSTAR Max DNA polimerasiTakara, GiapponeR045QPer il clonaggio genico
T4 DNA ligasiNEB, Stati UnitiM0202VIncorporare la sequenza target sul vettore CRISPR/Cas9.

Riferimenti

  1. Jiang, Z. H. World Bamboo and Rattan (in Chinese). , Liaoning Science and Technology Publishing House. Shenyang, China. (2002).
  2. Ye, S., et al. An efficient plant regeneration and transformation system of ma bamboo (Dendrocalamus latiflorus M....

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Ristampe e permessi

Tag

Trasformazione in plantaediting genomico del bambùinfezione da AgrobacteriumCRISPR Cas9reporter RUBYmutazione PeVDEinfiltrazione sottovuotofluorescenza della clorofilla