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Summary

Questo protocollo delinea un metodo per l’espianto della membrana della finestra rotonda dalle ossa temporali dei porcellini d’India, fornendo una risorsa preziosa per gli studi ex vivo .

Abstract

La somministrazione efficiente e minimamente invasiva dei farmaci all’orecchio interno è una sfida significativa. La membrana a finestra rotonda (RWM), essendo uno dei pochi punti di ingresso all’orecchio interno, è diventata un punto focale di indagine. Tuttavia, a causa della complessità dell’isolamento dell’RWM, la nostra comprensione della sua farmacocinetica rimane limitata. L’RWM comprende tre strati distinti: l’epitelio esterno, lo strato intermedio di tessuto connettivo e lo strato epiteliale interno, ciascuno dei quali possiede proprietà di rilascio uniche.

Gli attuali modelli per studiare il trasporto attraverso l’RWM utilizzano modelli animali in vivo o modelli RWM ex vivo che si basano su colture cellulari o frammenti di membrana. I porcellini d’India fungono da modello preclinico validato per lo studio della farmacocinetica dei farmaci all’interno dell’orecchio interno e sono un importante modello animale per lo sviluppo traslazionale di veicoli di somministrazione alla coclea. In questo studio, descriviamo un approccio per l’espianto di un RWM di cavia con osso cocleare circostante per esperimenti di somministrazione di farmaci da banco. Questo metodo consente di preservare l’architettura RWM nativa e può fornire una rappresentazione più realistica delle barriere al trasporto rispetto agli attuali modelli da banco.

Introduction

Sono emerse nuove classi di terapie per il trattamento dell’ipoacusia neurosensoriale. La traduzione di queste terapie nelle popolazioni cliniche è limitata da vie di trasporto sicure ed efficaci nell’orecchio interno. Gli attuali metodi di somministrazione in vivo negli studi sugli animali si basano sulla fenestrazione nell’orecchio interno o sulla diffusione attraverso la membrana a finestra rotonda (RWM), una barriera non ossea che separa lo spazio dell’orecchio medio dalla coclea¹.

La fenestrazione chirurgica e la microiniezione nell’orecchio interno sono entrambe invasive e possono comportare rischi per la funzione residua dell’orecchio interno². Pertanto, l’RWM è una via importante per la somministrazione locale di farmaci e le cavie sono il principale modello animale preclinico utilizzato per studiare la farmacocinetica dei farmaci locali attraverso l’RWM e nell’orecchio interno per lo sviluppo farmaceutico ^3,4. Sebbene più sottile dell’RWM umano, il porcellino d’India RWM condivide un’identica struttura a tre strati. Ha un diametro di circa 1 mm, uno spessore di 15-25 μm ed è composto da due strati di cellule epiteliali che racchiudono uno strato di tessuto connettivo⁵. Lo strato epiteliale rivolto verso l’orecchio medio è densamente impacchettato e collegato tramite giunzioni strette, mentre lo strato rivolto verso l’orecchio interno e la scala timpanica ha un’architettura più sciolta e non ha aderenze intercellulari significative.

Gli attuali studi preclinici che indagano la permeabilità ai farmaci nella RWM cavia si basano su iniezioni in vivo nell’orecchio medio seguite dal campionamento del liquido perilinfatico all’interno dell’orecchio interno, il che non consente lo studio specifico del trasporto RWM ^6,7. Frammenti di espianti RWM sono stati utilizzati in studi preclinici, ma a causa della loro fragilità e delle loro piccole dimensioni, non sono adatti per indagini microfluidiche sistematiche sul trasporto di farmaci e veicoli che richiedono una tenuta stagna attraverso l’RWM². Altri gruppi hanno impiegato modelli in vitro con cellule epiteliali umane in coltura per approssimare l’RWM ^8,9,10. Tuttavia, la maggior parte di questi costrutti si concentra esclusivamente sullo strato epiteliale esterno e non cattura la complessità dell’architettura del tessuto nativo. Per una comprensione più dettagliata dei meccanismi di trasporto attraverso l’RWM, sono necessari studi mirati ex vivo.

In questo studio, dimostriamo l’espianto di un RWM di cavia con supporto osseo circostante per preservare l’integrità della membrana e illustriamo il loro utilizzo in un paradigma sperimentale progettato per lo studio specifico del trasporto RWM di veicoli per la somministrazione di farmaci.

Protocol

Tutte le procedure per la cura e l’uso degli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l’uso degli animali (GP18M226). Nel presente studio sono stati utilizzati porcellini d’india albini Hartley (sia maschi che femmine, del peso di 500-700 g).

1. Impostazione e preparazione della procedura

1. Sterilizzare tutti gli strumenti con ossido di etilene prima di iniziare l’esperimento.
2. Sopprimere gli animali seguendo il protocollo istituzionalmente approvato.
   NOTA: Nel presente studio, è stata impiegata una camera non precaricata per rilasciare il 100% di anidride carbonica (CO₂ ) da una bombola commerciale. Un limitatore in linea è stato utilizzato per regolare il flusso di gas, mantenendolo nell’intervallo compreso tra il 30% e il 70% del volume al minuto della camera in conformità con le linee guida AVMA 2020¹¹.
3. Posizionare l’animale nella camera ed erogare anidride carbonica per 5 minuti. Il flusso di CO₂ viene mantenuto per 1 minuto dopo l’arresto respiratorio.
4. Eseguire la decapitazione dopo l’arresto respiratorio per garantire l’eutanasia.

2. Approccio chirurgico ed espianto

1. Estrarre l’osso temporale dal cranio del porcellino d’India nel modo consueto¹². Rimuovere i tessuti molli in eccesso con un rongeur. Identificare il meato acustico esterno, la bolla temporale e il canale facciale¹³ (Figura 1).
2. Forare gli aspetti ventrali della bolla temporale con una punta diamantata da 6 mm (vedi Tabella dei materiali), esponendo circonferenzialmente lo spazio dell’orecchio medio e il condotto uditivo esterno.
3. Utilizzando i rongeur, rimuovere delicatamente il condotto uditivo esterno e l’anello timpanico, separando contemporaneamente l’articolazione incudomalleolare. Identificare l’incudine, l’articolazione incudostapediale, la coclea, il canale semicircolare orizzontale e il canale facciale¹³ (Figura 2A).
4. Separare l’articolazione incudostapediale e rimuovere l’incudine usando una pinza. Identifica la nicchia ossea della finestra rotonda.
5. Utilizzare una punta diamantata da 6 mm per perforare la lamina ossea che collega la coclea con la parete mediale della cavità timpanica verso il canale tensore del timpano. Decomprimere con cura il canale osseo del tensore del timpano e rimuovere il muscolo tensore del timpano utilizzando un ago da 28 G.
   NOTA: La parete mediale della fossa tensoriale del timpano si collega direttamente con l’osso cocleare intorno al RWM e si presta attenzione a non causare fratture che possono estendersi alla finestra rotonda.
6. Perforare la lamina ossea che collega la coclea alla parete inferiore della cavità timpanica fino a quando non rimane 1 mm di sporgenza ossea adiacente alla coclea (Figura 2B).
7. Utilizzando una punta diamantata da 2 mm (vedi Tabella dei materiali), eseguire una cocleostomia in corrispondenza del giro basale della coclea, lasciando circa 2 mm di osso alla finestra rotonda. Continuare la cocleostomia inferiormente su un piano parallelo alla membrana della finestra rotonda per separare la base dall’apice della coclea.
8. Estendere il taglio della cocleostomia attraverso la base del cranio, che è molto più densa, ottenendo una visione in sezione trasversale del giro basale della coclea.
   NOTA: Puntando il trapano verso il meato del condotto uditivo interno si ottiene una traiettoria che massimizza la rimozione dell’osso evitando di avvicinarsi troppo alla finestra rotonda.
9. Esaminare il campione dal lato della base del cranio e, se non è già stato fatto, identificare il condotto uditivo interno e perforare l’apertura cocleare. Rimuovere il nervo cocleare con un ago da 28 G.
10. Esaminare il campione dal lato intracocleare. Identificare e rimuovere la lamina spirale ossea nel giro basale e il modiolo rimanente con una pinza o un ago da 28 G.
11. Irrigare copiosamente la cavità unificata dei vestiboli scala-scala per rimuovere i detriti. La finestra rotonda deve essere chiaramente visibile dalla cochectomia senza detriti sovrastanti (Figura 2C).
12. Quindi, esamina il campione dal lato dell’orecchio medio. Forare il canale semicircolare laterale e il canale facciale fino al livello della finestra ovale. Rimuovere delicatamente le staffe usando una pinza, esponendo la nicchia ovale della finestra. Da notare che c’è un ponte osseo tra la crura delle staffe noto come crista stapedis.
13. Utilizzando un trapano diamantato da 1 mm (vedi Tabella dei materiali), aprire ulteriormente il vestibolo estendendo la finestra ovale lungo la faccia della finestra rotonda, avendo cura di mantenere 1-2 mm di osso cocleare adiacente alla nicchia rotonda della finestra (Figura 2D).
14. Completa i tagli dell’osso temporale collegando i tagli della finestra ovale con i tagli della coclectomia su ciascun lato della finestra rotonda.
    NOTA: A causa della fragilità dell’osso cocleare, preservare la fossa tensoriale del timpano nel campione ed evitare tagli attraverso di essa aiuterà a prevenire le fratture dell’osso cocleare che si estendono all’RWM e ne compromettono l’integrità.
15. Effettuare gli attacchi finali all’osso denso della base cranica adiacente al condotto uditivo interno e radere delicatamente per ottenere un campione RWM asportato (Figura 3A).

Representative Results

Discussion

Nella somministrazione locale di farmaci all’orecchio, l’RWM è la principale via di passaggio per le terapie per raggiungere l’orecchio interno. È necessario un modello da banco accurato e affidabile per comprendere meglio i meccanismi di trasporto e la permeabilità attraverso i nuovi veicoli di somministrazione e per lo sviluppo di farmaci. In questo studio, dimostriamo che l’espianto di RWM da cavia è una procedura fattibile e affidabile per consentire indagini sistematiche sulle interazioni farmaco-membrana. Lundman et al. e Kelso et al. hanno precedentemente descritto l’utilizzo di un modello di permeabilità RWM simile ^2,16; tuttavia, le fasi specifiche dell’estrazione chirurgica non sono state dettagliate fino ad ora e la fragilità dell’osso cocleare e l’anatomia complessa hanno rappresentato una sfida per il prelievo coerente e in blocco di RWM intatti.

Il porcellino d’India RWM si trova all’estremità della scala timpana della coclea ed è circondato da un sottile strato di osso cocleare. La frattura di questa struttura ossea durante il processo di espianto può risultare in un campione inutilizzabile, poiché l’RWM tende a strapparsi se l’osso cocleare circostante non rimane intatto. Il nostro gruppo ha notato che le fratture si sono verificate più spesso durante la perforazione vicino alla giunzione tra l’osso della base cranica altamente denso e la coclea fragile, poiché la transizione nella densità ossea ha aumentato la probabilità di propagazione della frattura attraverso la finestra rotonda. Per questo motivo, si suggerisce che mantenere l’osso più denso della fossa tensoriale del timpano, che è attaccato alla coclea in prossimità del RW, aumenterà la resa del raccolto di esemplari, in particolare negli animali più anziani. La rottura dell’osso può verificarsi anche durante la rimozione del contenuto cocleare; È necessario prestare attenzione a rimuovere delicatamente la lamina spirale ossea con una manipolazione minima dell’osso cocleare circostante.

Un dettaglio importante da considerare con questo modello è la vitalità dell’RWM dopo l’espianto. Gruppi precedenti hanno suggerito che l’RWM dei mammiferi rimane vitale per 24-48 ore dopo l’estrazione¹⁷. Il presente studio ha rispecchiato questi risultati; studi di trasporto coerenti e analisi istologiche che dimostrano strutture cellulari intatte (Figura 2A) hanno entrambi supportato la vitalità del RWM cavia al momento degli esperimenti. Per mantenere la salute generale del campione estratto, l’RWM viene estratto e incorporato entro 3 ore dall’eutanasia.

Nello studio della farmacocinetica dei farmaci attraverso l’RWM in vivo, rimane una notevole difficoltà tecnica nell’effettuare misurazioni della distribuzione perilinfatica e della concentrazione¹. I cambiamenti nei metodi di somministrazione intratimpanica e nella quantità applicata hanno portato a risultati terapeutici diversi. Queste difficoltà sono aggravate dalla complessa fluidodinamica all’interno del labirinto, nonché dall’uscita irregolare del materiale iniettato attraverso la tromba di Eustachio. Il metodo di espianto descritto consente lo studio isolato dell’RWM e dei fattori che influenzano la sua permeabilità come modello ex vivo . Inoltre, l’espianto consente anche l’interrogazione diretta e la visualizzazione di vari metodi attualmente impiegati per aumentare la permeabilità RWM, come le microbolle ad ultrasuoni¹⁸ e la modulazione giunzionale indotta chimicamente¹⁹. Anche gli studi futuri su specifici meccanismi di endocitosi implicati nella somministrazione di farmaci trarrebbero beneficio da questo modello da banco.

Materials

1 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	1SD-G1
2 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	2SD-G1
6 mm Diamond Ball Drill Bit	Anspach	6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus System	Anspach	EMAX2PLUS	Any bone cutting drilling system will work
BD Eclipse Needle 27 G x 1/2 in. with detachable 1 mL BD Luer-Lok Syringe	Becton, Dickinson, and Co. 	382903057894	Any 27-28 G needle
Gorilla Epoxy	Gorilla	4200101
Kwik-CAST	World Precision Instruments	KWIK-CAST