Presentiamo due kit RT-qPCR one-step basati su sonde per i virus respiratori comuni. Il primo test è per SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 e H3N2) e influenza B. Il secondo è per SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Questi saggi possono essere implementati con successo in qualsiasi laboratorio specializzato.
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Articolo metodologico
Sviluppo di saggi RT-qPCR real-time multiplex per la rilevazione di SARS-CoV-2, influenza A/B e MERS-CoV
In questo articolo
Sommario
Abstract
La sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) che causa la malattia da Coronavirus 2019 (COVID-19) è una seria minaccia per la salute pubblica. Durante le stagioni influenzali, la diffusione del SARS-CoV-2 e di altri virus respiratori può causare un carico di malattie respiratorie a livello di popolazione che è difficile da gestire. Per questo, i virus respiratori SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS-CoV) dovranno essere attentamente monitorati nelle prossime stagioni autunnali e invernali, in particolare nel caso di SARS-CoV-2, Influenza A e Influenza B, che condividono fattori epidemiologici simili come popolazioni suscettibili, modalità di trasmissione e sindromi cliniche. Senza saggi specifici per il bersaglio, può essere difficile distinguere tra i casi di questi virus a causa delle loro somiglianze. Di conseguenza, un test multiplex sensibile e mirato, in grado di differenziare facilmente tra questi bersagli virali, sarà utile per gli operatori sanitari. In questo studio, abbiamo sviluppato un test basato sulla PCR con trascrittasi inversa in tempo reale utilizzando un kit RT-qPCR R3T one-step sviluppato internamente per il rilevamento simultaneo di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV. Con un minimo di 10 copie dei loro RNA sintetici, possiamo identificare con successo i bersagli di SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e MERS-CoV contemporaneamente con una specificità del 100%. Questo test è risultato accurato, affidabile, semplice, sensibile e specifico. Il metodo sviluppato può essere utilizzato come test diagnostico ottimizzato per SARS-CoV-2, Influenza A, Influenza B e SARS-CoV-2, MERS-CoV in ospedali, centri medici e laboratori diagnostici, nonché per scopi di ricerca.
Introduzione
La pandemia della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) in corso è causata dal nuovo coronavirus noto come sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2)1. A causa della forte contagiosità e della capacità di trasmissione rapida del SAR-CoV-2, la pandemia di COVID-19 è emersa nella città di Wuhan, in Cina, e si è diffusa rapidamente in tutto il mondo. Questo alla fine ha portato all'inizio di segni di distress respiratorio e persino alla morte 2,3,4. Il COVID-19 è stato dichiarato pandemia in più di 213 paesi, prevedendo un forte aument....
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Protocollo
1. Espressione e purificazione della Taq polimerasi
- Costruire un plasmide con un tag esa-istidina separabile all'estremità C dell'enzima.
- Trasformare 50 ng del vettore di espressione nel ceppo di E. coli BL21-(DE3) seguendo il protocollo standard38.
- Inoculare le cellule trasformate in quattro matracci da 6 L contenenti ciascuno 2 L di brodo di terreno 2YT a 37 °C agitando a 170 giri/min fino a raggiungere il OD 600 di 0,8 o il numero di cellule 6,4 x 108 .
- Indurre l'espressione della Taq polimerasi con 0,5 mM di isopropil-β-d-tiogalattopiranoside (IPTG) e incubare ulte....
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Risultati
Negli ultimi anni, ci sono stati progressi significativi nell'approccio diagnostico per rilevare i virus respiratori comuni utilizzando gli approcci PCR 21,22,23,24,25. Tuttavia, nonostante questi progressi, l'approccio multiplexato, che consente di rilevare più virus in un singolo test, non è stato ampiamente implementato, in particolare nella piattaforma RT-.......
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Discussione
Il sistema sanitario di tutto il mondo è gravoso dal pesante onere economico derivante dagli elevati tassi di infezione e mortalità dovuti alla diffusione di virus respiratori comuni come le varianti SARS-CoV-2, Influenza A/B e MERS-CoV 12,19,20. Motivati dal senso di responsabilità verso l'alleggerimento di questo onere, ci siamo resi conto della necessità di un test diagnostico rapido, preciso e accessibile come la RT-qPCR per.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla King Abdullah University of Science and Technology attraverso il finanziamento di base e il National Term Grand Challenge (NTGC) a SMH.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ m tazze filtranti | Thermo Scientific | 291-4545 | |
| 10X Tris-Glycine SDS tampone di funzionamento | Novex | LC2675 | |
| per la coltura dei tessuti a 6 pozzetti | Corning | 353046 | |
| Solfato di ammonio | Fisher Scientific | A701-3 | |
| Ampicillina | Corning | 61-238-RH | |
| Scambio cationico (HiTrap SP HP) 5 mL | Cytiva | 17-1152-01 | |
| D-(+)-Biotina, 98+% | Thermo Scientific | A14207.60 | |
| DH10Bac cellule competenti | Fisher Scientific | 10361012 | |
| Sacca per dialisi (Snakeskin 10.000 MWC) | Thermo Scientific | 68100 | |
| Ditiotreitolo (DTT) | Thermo Scientific | R0862 | |
| Acqua distillata senza Dnase/RNASI | Ambion | AM9930 | |
| dNTP | Thermo Scientific | R0192 | |
| E. coli BL21(DE3) cellule competenti | Invitrogen | C600003 | |
| EDTA Fisher | Scientific | BP120-1 | |
| Tampone di eluizione | Qiagen | 19086 | |
| ESF 921 terreno di coltura cellulare per insetti (terreni di cellule di insetto) | Sistemi di espressione | 96-001-01 | |
| Soluzione FBS | Gibco | A38400-01 | |
| Fugene (reagente di trasfezione) | Promega | E2311 | |
| Gentamicina | Fisher Scientific | 15750060 | |
| Glicerolo | Sigma Aldrich | G5516-500 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma Aldrich | I8896-100ml | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 56750-1Kg | |
| Influenza A (H1N1) RNA sintetico | Twist Bioscience | 103001 | |
| Influenza A (H3N2) RNA sintetico | Twist Bioscience | 103002 | |
| Influenza B RNA sintetico | Twist Bioscience | 103003 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | I3481C100 | |
| Kanamicina | Gibco | 11815-032 | |
| LB Agar | Fisher Scientific | BP1425-500 | |
| LB Terreni per brodo | Fisher Scientific | BP1426-500 | |
| Lisozima | Sigma Aldrich | L6876-10G | |
| Cloruro di magnesio | Sigma Aldrich | 13152-1Kg | |
| MERS-CoV RNA sintetico | Twist | Bioscience 103015 | |
| Piastre di reazione ottiche a 96 pozzetti MicroAmp Fast con codice a barre (0,1 mL) | Applied Biosystems | 10310855 | |
| Gel prefabbricato Mini-PROTEAN TGX | Bio-Rad | 456-1093 | |
| Kit Miniprep | Qiagen | 27106 | |
| Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mL | Cytiva | 17-3712-06 | |
| Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mL | Cytiva | 17-5248-02 | |
| Coperture ottiche per adesivi, (compatibili con PCR, inibitori di DNA/RNASI/PCR Biosistemi applicati senza | 4311971 | ||
| cloruro di potassio | Fisher Bioreagenti | BP366-1 | |
| Primer e sonde | DNA Technologies, Inc. | ||
| Inibitore della proteasi Mini compresse Senza EDTA | Thermo Scientific | A32955 | |
| Marcatore proteico | Fermentas | 26616 | |
| Macchina RT-qPCR (QuantStudio 7 Flex) | Applied Biosystems | ||
| S.O.C medium | Fisher Scientific | 15544034 | |
| SARS-CoV-+A2:C442 RNA sintetico | Twist | Bioscience 102024 | |
| Cellule di insetto Sf9 | Gibco | A35243 | |
| Cloruro di sodio | Sigma Aldrich | S3014-1Kg | |
| StrepTrap XT 5 mL | Cytiva | 29401323 | |
| Tetraciclina | IBI Scientific | IB02200 | |
| Tris Base Molecular Biology Grade | Promega | H5135 | |
| Tris-HCl | Affymetrix | 22676 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1379-100ml | |
| X-Gal | Invitrogen | B1690 |
Riferimenti
- Hu, B., Guo, H., Zhou, P., Shi, Z. L. Characteristics of SARS-CoV-2 and COVID-19. Nat Rev Microbiol. 19 (3), 141-154 (2021).
- Zhu, N., et al. A novel Coronavirus from patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med. 382 (8), 727-733 (2019).
- Huang, C., <....
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Ristampe e permessi
