Articolo metodologico

Quantificazione del callosio nei tessuti vegetali tramite analisi immunoenzimatica legata a enzimi/spettrofotometria a immunofluorescenza

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DOI:

10.3791/65833

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22 maggio 2026

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1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo quantifica il callosio nei tessuti vegetali utilizzando il metodo specifico per callosi, la spettrofotometria a immunofluorescenza/ELISA, basato sul legame del callosio nei campioni vegetali ad anticorpi specifici per il calloso, seguito dalla quantificazione del callosio legato tramite anticorpi di rilevamento marcati da enzimi, misurando l'attività enzimatica risultante.

Abstract

I metodi esistenti di quantificazione del caloso da tessuti vegetali includono microscopia a epifluorescenza, spettrofotometria a fluorescenza, microscopia a immunofluorescenza e valutazione indiretta sia delle attività della callosa sintasi che di quella β-(1,3)-glucanasi. Tuttavia, alcuni di questi metodi presentano limitazioni significative, tra cui essere dispendiosi in termini di tempo, non specifici per callosi, laboriosi, soggettivi, alta autofluorescenza, bassa sensibilità, essere più qualitativi che quantitativi e richiedere l'acquisizione di risorse software e competenze tecniche. Pertanto, è urgente esplorare metodi alternativi per la quantificazione del callosio nei tessuti vegetali. Si ipotizzò che la spettrofotometria a immunofluorescenza o il saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA) che utilizza anticorpi specifici per il calloso potessero superare alcune delle limitazioni degli attuali metodi di quantificazione del callosio. Lo stress biotico è stato somministrato inoculando piante di banana derivate da colture tissutali con Xanthomonas vasicola pv. batteri musacearum (Xvm) che indussero la produzione di callosi. Campioni di tessuto cormatico di banana sono stati raccolti a 14 giorni dall'inoculazione (dpi) per la quantificazione del calcolo utilizzando il nuovo metodo di spettrofotometria a immunofluorescenza. La produzione di callosi nei cormi dei gruppi inoculati con Xvm e di controllo variava significativamente in entrambi i genotipi delle banane (test t del campione indipendente, p < 0,05). Il metodo di spettrofotometria a immunofluorescenza descritto qui potrebbe essere applicato per la quantificazione del calcoso in diversi tessuti vegetali con alta specificità a callosi, sensibilità, affidabilità e riproducibilità. Inoltre, l'uso di una piastra a 96 pozzi rende questo metodo adatto per studi di quantificazione del callo ad alta produttività con bias di campionamento e analisi minimi.

Introduzione

Il calloso è un polisaccaride di β-1,3-glucano, un composto naturale presente nelle pareti cellulari di una varietà di piante superiori. La callosa viene sintetizzata dalle callosa sintasi (CalS) e degradata dalle β-(1,3)-glucanasi 1,2,3. È coinvolto in diversi processi biologici, tra cui la crescita, lo sviluppo e la risposta a stress abiotici e biotici 4,5,6. Durante l'infezione da patogeni, l'aumento della deposizione di callosi nelle papille aiuta a prevenire un'ulteriore colonizzazione microbica, agendo come barriera di permeabilità tra le cellule vegetalivicine 2,4,7,8,9,10,11,12 . Rallentando l'invasione del patogeno nel tessuto attaccato, la deposizione callosa permette l'induzione di ulteriori risposte didifesa 13. Una quantificazione spatiotemporale accurata del callosio nei tessuti vegetali è essenziale per comprenderne il ruolo nei vari processi fisiologici. Tuttavia, i metodi attuali di quantificazione del callosio dai tessuti vegetali, che includono la microscopia a epifluorescenza, la microscopia a immunofluorescenza e la spettrofotometria a fluorescenza, presentano limitazioni significative e sfide di quantificazione. Pertanto, è urgente esplorare metodi alternativi per la quantificazione del callosio al fine di superare questi svantaggi. Si ipotizzò che la spettrofotometria a immunofluorescenza o il saggio immunosorbente legato agli enzimi (ELISA) potessero offrire un metodo più efficiente di quantificazione del callosio nei campioni vegetali, che includa alta specificità, sensibilità, affidabilità, riproducibilità e un metodo ad alta produttività.

Il metodo standard d'oro per la quantificazione del callosio prevede l'imaging di particelle callose colorate con anilina blu tramite microscopiaa epifluorescenza 14,15,16,17. Il calloso colorato di blu con l'anilina quando esposto all'eccitazione blu o UV, appare come particelle fluorescenti gialle, che possono essere contate manualmente per il numero di particelle di callosafluorescenti 14,15 oppure contate tramite software automatico di conteggio del calloso. Il conteggio manuale delle particelle callose è laborioso, richiede tempo e è soggettivo per ilricercatore 18, mentre il conteggio automatico richiede l'acquisizione di risorse software e notevoli competenze tecniche. Alcuni dei software utilizzati per il conteggio automatico dei callosi includonoImageJ 19,20,21,22, photoshop23, CalloseMeasurer24, Icy18,25 e Ilastik26. Il callosio colorato di blu con anilina può anche essere quantificato utilizzando la spettrofotometria difluorescenza 17,19,27,28,29. Tuttavia, l'elevata autofluorescenza di fondo/autofluorescenza associata alla microscopia a epifluorescenza e alla spettrofotometria a fluorescenza rende questi metodi difficili e inaffidabili a causa del basso rapporto segnale/rumore di 26. Inoltre, il blu di anilina può colorare altri β-1,3-glucani oltre alcallosio 30, rendendo sia la microscopia a epifluorescenza che i metodi di spettrofotometria a fluorescenza per il rilevamento e quantificazione del callo parzialmente non specifici e inaffidabili. Un metodo di microscopia a immunofluorescenza per la quantificazione della callosia, basato su anticorpi specifici per la callosia, è stato utilizzato in diversi studi 31,32,33. Sebbene questo metodo condivida alcuni svantaggi con la microscopia a epifluorescenza della callosa colorata con blu di anilina, ha il vantaggio di essere specifico per la callosità grazie agli anticorpi qui utilizzati. La quantificazione del callosio è stata inoltre effettuata utilizzando metodi basati sull'attività enzimatica. I metodi basati sull'attività enzimatica per la quantificazione della callosa includono la valutazione delle attività della callosa sintasi (CalS)20,33 e delle attività β-(1,3)-glucanasi 34,35. I metodi basati sull'attività enzimatica presentano diversi svantaggi rispetto alla microscopia a epifluorescenza, alla microscopia a immunofluorescenza e alla spettrofotometria a fluorescenza. Questi includono la stima indiretta della callosa, la difficoltà nell'estrazione enzimatica e negli saggi di attività enzimatica, e la mancanza di una distribuzione uniforme della callosa nei tessuti vegetali.

A causa degli svantaggi degli attuali metodi di quantificazione del callosio, che includono microscopia a epifluorescenza, microscopia a immunofluorescenza, spettrofotometria a fluorescenza, saggi CalS e β-(1,3)-glucanasi, è stato necessario sviluppare un nuovo metodo di quantificazione del callosio che offrisse numerosi vantaggi, tra cui: 1) alta specificità, sensibilità, affidabilità e riproducibilità, e 2) una quantificazione del callo più semplice con alta capacità di produttività. L'uso della spettrofotometria a immunofluorescenza per la quantificazione della callosa non è stato ancora esplorato. Qui viene riportato un nuovo metodo di quantificazione del caloso basato sulla spettrofotometria a immunofluorescenza, più specificamente l'Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Il metodo può essere ottimizzato per la quantificazione del callosio in diverse piante o nei loro tessuti con un buon grado di specificità di callosità, precisione, riproducibilità e una capacità sperimentale ad alta produttività. Questo metodo può anche essere modificato per quantificare qualsiasi analita di origine vegetale se è disponibile l'anticorpo contro quell'analito. Per garantire una distribuzione spaziotemporale accurata, efficiente e affidabile del callosio nei tessuti vegetali, si raccomanda di utilizzare simultaneamente diversi metodi di quantificazione del callosio, tra cui microscopia, spettrofotometria e metodi basati sull'attività enzimatica. Di conseguenza, ciò permetterà di comprendere in modo accurato ed efficiente il ruolo del callosio nelle varie risposte fisiologiche e allo stress.

Protocollo

1. Inoculazione delle piante sperimentali

  1. Isolare, preparare e confermare l'inoculo Xvm utilizzando le procedure standard36,37. Selezionare casualmente 10 piante di Musa balbisiana e Mbwazirume derivate da colture tissutali di 2 mesi e inoculare il lato dorsale del piccioolo fogliare completamente aperto più giovane con 200 μL (1 x 108 cellule) dell'inoculo Xvm confermato per PCR (Figura 1)38.
  2. Allo stesso modo, si selezionano casualmente 10 piante di banana Musa balbisiana e Mbwazirume e si inoculano con 200 μL di acqua distillata sterile (SDW).
  3. Mantenere le piante di banano inoculate con Xvm e controllare le piante di banana in condizioni simili nella schermata con un fotoperiodo di 12 ore di luce e 12 ore di fotoperiodo scuro a 25 °C, annaffiandole ogni 3 giorni.
    NOTA: Consulta la Tabella dei Materiali e la Tabella 1 per l'elenco di materiali e attrezzature e la ricetta dei buffer, rispettivamente.

2. Campionamento dei tessuti cormici e preparazione del campione

  1. Eseguire campionamenti distruttivi per ottenere campioni di cormo dagli impianti sperimentali (Figura 1).
  2. Rimuovere rapidamente circa 2 g di campioni di cormo usando lame chirurgiche sterili a 14 giorni dall'inoculazione (dpi) e inserirli singolarmente in tubi etichettati da 50 mL. Fai così per tutti i 10 campioni raccolti ciascuno dagli impianti inoculati con Xvm e dagli impianti di controllo.
  3. Immergi immediatamente i tubi da 50 mL contenenti i campioni nell'azoto liquido.
  4. Trasportare i campioni al laboratorio e conservarli a -80 °C fino a quando non sono pronti per procedere. Conservare i campioni a −80 °C per un massimo di 1 anno o più con cicli minimi di congelamento-disgelo.
  5. Liofilizzare i campioni per 72 ore utilizzando un liofilizzatore (Figura 1).
  6. Inserisci esattamente 30 mg di campioni liofilizzati in tubi da 2 mL contenenti 2 perline d'acciaio per biciclette e polverizzali in polvere fine, impostando la velocità a 5 per 1 minuto (Figura 1).
  7. Conservare i campioni polverizzati in un ambiente fresco e asciutto a temperatura ambiente, ben sigillati fino a quando non sono pronti a procedere. Conservare i campioni polverizzati a temperatura ambiente fino a 4 mesi o a −80 °C per un massimo di 1 anno con cicli minimi digelo-disgelo 39,40.

3. Estrazione del calcolo e preparazione di standard e blank di laminarina

  1. Per estrarre il callosio dai 30 mg del campione di cormo polverizzato, aggiungere 800 μL di 1 M di NaOH e incubare per 30 minuti a 80 °C in un bagno d'acqua, con vortici occasionali ogni 10 minuti27,41 (Figura 1, Passo 6).
  2. Lascia raffreddare i campioni a temperatura ambiente (circa 5 minuti) e poi centrifuga a 15.294 x g per 5 minuti.
  3. Trasferire il sovrantantante (estratto di callosio) in un tubo sterile da 2 mL e diluire con il tampone bloccante (Tabella 1) in un rapporto 1:2.
    NOTA: Scegli il fattore di diluizione in base a sperimentazioni preliminari e ottimizzazioni. La diluizione dell'estratto di callosio può essere o meno necessaria. Quando necessario, la diluizione dovrebbe essere eseguita nel buffer di blocco e il rapporto di diluizione dovrebbe essere ottimizzato per i diversi tipi di campione per rientrare nell'intervallo della curva standard.
  4. Conserva gli estratti di callosio a -20 °C finché non sei pronto a procedere. Conserva l'estratto di callosio fino a 6 mesi con cicli minimi di congelamento-scongelamento.
  5. Prepara una scorta concentrata di laminarina standard a 100 mg/mL in 1 M NaOH 6,42,43,44,45.
    NOTA: La laminarina è un polimero 1-3-β-glucano e può essere utilizzata come standard per equivalenti callosi nella spettrofotometria a immunofluorescenza.
  6. Incubare la sospensione risultante dello standard a 80 °C in un bagno d'acqua, scuotendo delicatamente a intervalli, finché tutta la laminarina non si dissolve completamente (circa 20-40 minuti).
  7. Raffredda il standard disciolto a temperatura ambiente (circa 10 minuti).
  8. Preparare standard di laminarina a concentrazioni di 80 mg/mL, 60 mg/mL, 40 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,1 mg/mL e 0,01 mg/mL utilizzando il tampone bloccante, partendo dal stock concentrato di 100 mg/mL.
  9. Prepara i blank mescolando 1 M NaOH e il buffer di blocco a un rapporto di 1:2. Se è necessaria la diluizione, si utilizza lo stesso rapporto di diluizione usato per preparare l'estratto di callosio.
  10. Conservare gli standard laminarini e i blank a −20 °C. Conserva standard e blank fino a 6 mesi con cicli minimi di congelamento-scongelamento.

4. Quantificazione del callosio tramite la spettrofotometria di immunofluorescenza

  1. Aggiungere 100 μL dell'anticorpo primario (1-3-β-glucan-directed mouse IgG) preparato utilizzando il tampone di rivestimento (Tabella 1) in ciascuno dei 96 pozzi delle piastre ELISA in polistirene (Figura 2).
  2. Sigilla bene la piastra con una pellicola di paraffina e lasciala incubare tutta la notte a 4 °C in frigorifero.
  3. Il giorno dopo, posa il piatto sul banco e lascia che raggiunga la temperatura ambiente (circa 10 minuti).
  4. Lava il piatto utilizzando le procedure standard di assorbimento e lavaggio46. In breve, aggiungere 200 μL del tampone di lavaggio (Tabella 1) ai pozzi, far vortice a 500 giri/min per 30 secondi usando uno shaker digitale e macchiare sulla carta velina. Ripeti questo processo di lavaggio due volte (Figura 2). Assicurati che i pozzi non si secchino completamente e usa una punta sterile per micropipette per rimuovere eventuali bolle nei pozzi senza toccare la base e le pareti dei pozzi.
  5. Aggiungi 200 μL del buffer di blocco a ciascuno dei pozzi (Figura 2) e sigilla saldamente la piastra con pellicola di paraffina. Incubalo per 4 ore a 37 °C. Lava il piatto come menzionato sopra (Figura 2).
  6. Aggiungere 100 μL dell'estratto di callosio dai 10 impianti inoculati con Xvm e 10 pianti di controllo ai pozzi designati. Aggiungere 100 μL degli standard laminarini ad altri pozzi. Aggiungere 100 μL del blank ad altri pozzi (Figura 2).
  7. Sigilla bene la piastra con pellicola di paraffina e incuba tutta la notte a 4 °C in frigorifero. Lava nuovamente il piatto come menzionato sopra (Figura 2).
  8. Aggiungere 100 μL dell'anticorpo primario (1-3-β-IgG di topo diretto al glucano) preparato utilizzando il tampone bloccante a ciascuno dei pozzi (Figura 2).
  9. Sigilla bene la piastra con pellicola di paraffina e incuba per 4 ore a 37 °C, poi lava la piastra come indicato sopra (Figura 2).
  10. Aggiungere 100 μL di anticorpo secondario anti-IgG - fosfatasi alcalina anti-topo inciascun pozzo 46,47 (Figura 2).
  11. Sigilla bene la piastra con pellicola di paraffina e incuba tutta la notte a 4 °C in frigorifero. Poi, lava il piatto come indicato sopra (Figura 2).
  12. Aggiungere 100 μL di soluzione di para-nitrofenil fosfato (pNPP) appena preparata a una concentrazione di 1 mg/mL (Tabella 1) nei pozzi (Figura 2)
  13. Incubare il piatto sul banco a temperatura ambiente per 30 min48.
    NOTA: Il tempo di incubazione può variare a seconda dei campioni di piante e dello standard utilizzato. In questo studio, la laminarina ha avuto la migliore lettura a 30 minuti.
  14. Terminare la reazione aggiungendo 100 μL di soluzione stop appena preparata (0,5 M NaOH) a ciascuno deipozzi 48 (Figura 2).
  15. Trasferire la piastra a un lettore di microplacche (equilibrata a 37 °C), scuotere a velocità media per 1 minuto e leggere le assorbanze a 405 nm48 (Figura 1, Figura 2).

5. Analisi dei dati

  1. Eseguire una semplice regressione lineare dell'assorbanza della laminarina a 405 nm rispetto alla concentrazione di laminarina (μg/mL) per ottenere la curva standard. L'equazione della curva standard è
    Y = β1X + β0
    dove Y rappresenta l'assorbanza della laminarina a 405 nm, β1 è la pendenza della linea di regressione (coefficiente di correlazione di Pearson), X è Log10 (concentrazione di laminarina in μg/mL) e β0 è l'intercetta y.
  2. Calcola le concentrazioni di callosio nei campioni di cormo sottraendo l'assorbanza del blank dall'assorbanza dei campioni. Successivamente si utilizza la curva standard per stimare la concentrazione di callosi in μg/mL come equivalente laminarino (LE).
  3. Esaminare tutti i dati per la normalità della distribuzione utilizzando il test di Shapiro-Wilk e verificare l'omoscedasticità delle varianze usando il test di Levene (α > 0,05).
  4. Utilizzare il test t del campione indipendente per confrontare la produzione di callosi tra i gruppi inoculati con Xvm e quelli di controllo (p≤ 0,05).

Risultati

Le concentrazioni note degli standard laminarina sono state analizzate tramite spettrofotometria e i relativi valori di assorbanza sono stati registrati. Utilizzando questi dati, è stato costruito un grafico di Beer-Lambert tracciando le concentrazioni degli standard della laminarina sull'asse x e l'assorbanza sull'asse y. L'equazione della linea di regressione era y = 0,5079x − 0,04534 (Figura 3)49. Il grafico di Beer-Lambert ha fornito un alto coefficiente di correlazione (r) di 0,9988 e un coefficiente di determinazione (r2) di 0,9975, indicando una forte relazione lineare tra concentrazione e assorbanza e fino a 0,9975 della varianza nella variabile dipendente (assorbanza) è stata spiegata dalla variabile indipendente (concentrazione; Figura 3; p<0,0001). Pertanto, questo modello era un buon adattamento, accurato e affidabile per prevedere la concentrazione di laminarina e callosi. La concentrazione di callosi nei campioni di cormo di banana è stata determinata misurando l'assorbanza dei campioni di cormo tramite spettrofotometria e utilizzando i valori di assorbanza per calcolare le concentrazioni di callosi con l'equazione.

Il saggio di spettrofotometria a immunofluorescenza ha mostrato un aumento significativo della callosia indotta nelle piante inoculate con Xvm rispetto al gruppo di controllo in entrambi i genotipi della banana (test t del campione indipendente, p < 0,05; Figura 4). La produzione di callosi negli impianti di controllo a 14 dpi era di 1474,34 mg/mL e 1037,11 mg/mL rispettivamente per Mbwazirume e M. balbisiana (Figura 4). L'inoculazione delle piante con Xvm ha prodotto 4190,78 mg/mL e 1996,07 mg/mL di callosi nei cormi delle piante di Mbwazirume e M. balbisiana inoculate con Xvm a 14 dpi, rispettivamente (Figura 4). L'inoculazione con Xvm ha causato una produzione di callosi da 1,9 a 2,8 volte superiore rispetto agli impianti di controllo (test t del campione indipendente, p < 0,001; Figura 4).

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Figura 1: Illustrazione schematica dei principali passaggi coinvolti nella quantificazione della callosa tramite il nuovo metodo di spettrofotometria a immunofluorescenza. Questa figura mostra i principali passaggi coinvolti nella quantificazione del caloso dai tessuti di banana, che includono l'allevamento delle piantene derivate dalla coltura, l'inoculazione con Xvm, il campionamento distruttivo dei tessuti cormatici, la liofilizzazione dei campioni, l'estrazione del caloso e la quantificazione del calcoso tramite il nuovo metodo di spettrofotometria a immunofluorescenza. Questa cifra è stataristampata 50. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Illustrazione schematica dettagliata del metodo di spettrofotometria a immunofluorescenza per la quantificazione del callo. Questa figura offre una dimostrazione dettagliata del metodo di spettrofotometria a immunofluorescenza per la quantificazione del callosio, mostrando come la piastra ELISA sia caricata con i vari componenti e come il callosio venga infine quantificato tramite spettrofotometria. Questa cifra è stataristampata 50. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Quantificazione delle proteine. Il grafico di Beer-Lambert basato su standard di laminarina di concentrazioni note e letture di assorbanza (a 405 nm) utilizzato per il calcolo delle concentrazioni di callosi (come equivalenti di laminarina, LE) a partire dalle letture di assorbanza dei campioni di cormo. Questa cifra è stataristampata 49. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 4: Confronto della concentrazione di callosi. Confronto delle concentrazioni medie di callosi (media ± SEM, n = 9) nei cormi delle piante di banana di M. balbisiana e Mbwazirume inoculate con Xvm , come determinato dal nuovo metodo di spettrofotometria a immunofluorescenza (test t del campione indipendente, α ≤ 0,05) Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

BufferComposizioneStoccaggio
Buffer di blocco10 g di albumina sierica bovina (BSA; 1% w/v), sciolta in 1 L di PBS.-20 °C per un massimo di 6 mesi
Tampone di rivestimento1,59 g di carbonato di sodio (Na2CO3), 2,93 g di bicarbonato di sodio (NaHCO3), 0,2 g di azide di sodio (NaN 3), sciogliti in 1 L di H2Odeionizzato, pH 9,6.-20 °C per un massimo di 12 mesi
Buffer coniugato2 g di PVP (2% w/v), sciolti in 1 L di buffer bloccante.-20 °C per un massimo di 6 mesi
Soluzione di para-nitrofenil fosfato (pNPP)Dissolvere il para-nitrofenil fosfato (pNPP) in un tampone del substrato fino a una concentrazione operativa di 1 mg/mL-20 °C per un massimo di 12 mesi
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)8,0 g di cloruro di sodio (NaCl), 0,2 g di fosfato di potassio monobasico (KH2PO4), 1,15 g di fosfato di sodio dibasico (Na2HPO 4), 0,2 g di cloruro di potassio (KCl), 0,2 g di azide di sodio (NaN 3), disciolti in 1 L di H2Odeionizzato, pH 7,4.-20 °C per un massimo di 12 mesi
Anticorpo primario nel tampone bloccanteRicostituire l'anticorpo primario liofilizzato secondo le istruzioni del produttore per ottenere il materiale concentrato. Diluire il stock primario di anticorpi ricostituito ottenuto in un tampone bloccante a una concentrazione operativa di 2 μg/mL.-20 °C per un massimo di 6 mesi
Anticorpo primario nel tampone di rivestimentoRicostituire l'anticorpo primario liofilizzato secondo le istruzioni del produttore per ottenere il materiale concentrato. Diluire lo stock primario di anticorpi ricostituito ottenuto nel tampone di rivestimento a una concentrazione operativa di 2 μg/mL.-20 °C per un massimo di 6 mesi
Anticorpo secondario1:1000 di concentrato secondario di anticorpi: tampone coniugato-20 °C per un massimo di 6 mesi
Buffer del substrato97 mL di dietanolamina, 0,2 g di azide di sodio (NaN 3), si dissolveno in 1 L di H2O deionizzato, pH 9,8-20 °C per un massimo di 12 mesi
Buffer di lavaggio0,5 mL di Tween 20 (0,05% v/v), disciolto in 1 L di PBS, pH 7,5-20 °C per un massimo di 12 mesi

Tabella 1: Ricetta per i buffer.

Discussione

Il metodo della spettrofotometria a immunofluorescenza è stato applicato per la prima volta nella quantificazione del callosio nei cormi delle banane. Si basa sull'immunosaggio enzimatico (EIA), utilizzato per quantificare il callosio nell'estratto grezzo 1 M NaOH della banana utilizzando anticorpi specifici percallosio 47,51,52. In breve, questo nuovo saggio di quantificazione specifico per callosi basato su spettrofotometria e immunofluorescenza prevedeva il rivestimento della micropiastra con un anticorpo specifico per callosio che poi si legava al caloso nell'estratto vegetale, seguito da un anticorpo secondario anch'esso specifico per la callosa. La rilevazione di un anticorpo collegato a un enzima (fosfatasi alcalina) viene quindi aggiunta e forma un complesso con l'anticorpo secondario. Viene quindi aggiunto un substrato, il para-nitrofenil fosfato (pNPP). La quantificazione del callosio nel campione si basa sulla capacità della fosfatasi alcalina di scindere i gruppi fosfato dalle molecole di pNPP, portando alla formazione di un composto di colore giallo (p-nitrofenolo). La rilevazione dell'intensità del colore giallo è stata effettuata utilizzando uno spettrofotometro a 405 nm e l'assorbanza è stata poi correlata all'attività della fosfatasi alcalina, che era direttamente proporzionale alla concentrazione di callosi presente nel campione. La reazione è stata fermata aumentando il pH tramite l'aggiunta di 0,5 M di NaOH, che ha impedito un'ulteriore attività fosfatasi alcalina.

Al contrario, il metodo standard dell'oro per la localizzazione e quantificazione del callo è il metodo di microscopia a epifluorescenza, un metodo ben consolidato basato sulla colorazione del callosio con il blu dell'anilinafluorocromo 53. In breve, questo metodo si basa sul legame specifico del colorante blu di anilina ai beta-1,3-glucani (callosi) formando un complesso. Il blu dell'anilina in questo complesso viene quindi eccitato usando la luce ultravioletta (lunghezza d'onda di 365-375 nm). Quando il colorante blu di anilina viene eccitato, emette una fluorescenza blu che viene catturata per consentire una visualizzazione specifica del callosio nei tessutivegetali 53. La quantificazione del callosio colorato di blu con anilina segue una serie di tecniche di imaging che quantificano la quantità di fluorescenza proveniente dai tessuti vegetali. La fluorescenza è proporzionale alla quantità di calco disponibile nei tessuti vegetali. La microscopia a epifluorescenza è stata utilizzata nella visualizzazione e quantificazione del callosio nello stressbiotico 54.

In uno studio separato, la deposizione callosa è stata determinata utilizzando sia la microscopia a epifluorescenza sia la spettrofotometria a immunofluorescenza49. Sebbene siano state osservate alcune differenze nei dati, l'analisi statistica ha mostrato in gran parte la congruenza tra microscopia a epifluorescenza e dati di spettrofotometria a immunofluorescenza, indicando la coerenza tra i due metodi di rilevamento del callo49. Sebbene i risultati dei due metodi siano stati in gran parte congruenti, è consigliabile che sia la microscopia a epifluorescenza che la spettrofotometria a immunofluorescenza si completino per una valutazione più affidabile. Anche se il metodo basato su ELISA è specifico per callosi, sensibile e affidabile, inizialmente richiede tempo durante l'ottimizzazione del protocollo e l'ottenimento di una curva standard migliore che si adatti a tutte le concentrazioni e assorbanze.

Alcuni metodi per la quantificazione del callosio sonolaboriosi 17,32,55, richiedono tempo 26,56, non specifici per il calloso poiché il blu anilina può colorare altri β-1,3-glucani oltre alcallosio 30, richiedono software costosi e sofisticati per il conteggiodel callosio 23,24,26 , richiedono una quantità considerevole di competenze tecniche e l'elevata sfondo/autofluorescenza associata alla spettrofotometria a fluorescenza rende la quantificazione callose difficile einaffidabile 26. I metodi di quantificazione Callose basati su workflow automatizzato di analisi delle immagini come il software ImageJ richiedono un addestramento appropriato del plug-in per l'analisi delle immagini come il Trainable Weka Segmentation (TWS) per ImageJ, e questo è moltomacchinoso 57.

I saggi basati su spettrofotometria a immunofluorescenza sono altamente preferiti per la loro specificità, sensibilità, facilità d'uso e riproducibilità. Tuttavia, è importante notare che il sistema di rilevamento e la sua sensibilità possono variare a seconda del protocollo specifico e dell'attrezzatura utilizzata.

Qui viene descritto un nuovo metodo di quantificazione della callosa basato sulla spettrofotometria dell'immunofluorescenza. Il metodo descritto qui potrebbe essere applicato per la quantificazione del callosio in diversi tessuti e specie vegetali con un livello soddisfacente di specificità a callosi, alta precisione e riproducibilità. Questo metodo è un'aggiunta ai vari metodi di quantificazione del calcolo e può essere utilizzato per monitorare i cambiamenti nei livelli di calcolo durante la crescita e lo sviluppo nelle piante e in risposta a vari stimoli o trattamenti. Inoltre, l'uso di piastre a 96 pozzi riduce il campionamento soggettivo e l'analisi, rendendo il metodo adatto per la quantificazione del callosio ad alta produttività. È importante notare che, sebbene il caloso possa essere facilmente estratto da tessuti vegetali appenaraccolti 17,27,55, la fase di preparazione del campione che prevede la liofilizzazione, inclusa secondo questo nuovo protocollo, offre un vantaggio per conservare i campioni per un periodo molto lungo (fino a 1 anno) e consente lo stoccaggio e la spedizione di campioni biologici deperibili tra laboratori distanti a temperature ambientali. Questo permette di ripetere estrazioni calclose senza dover preparare ripetutamente l'intero esperimento per la raccolta di nuovi campioni.

La spettrofotometria a immunofluorescenza è raccomandata per esperimenti di quantificazione con callosi ad alta capacità di produttività, mentre la microscopia a epifluorescenza e la microscopia a immunofluorescenza possono essere utilizzate sia per la quantificazione del calcoso sia per l'istolocalizzazione del callosio nei tessuti vegetali. Per garantire una distribuzione spaziotemporale accurata, efficiente e affidabile del callosio nei tessuti vegetali, si raccomanda di utilizzare simultaneamente diversi metodi di quantificazione del callosio, tra cui microscopia, spettrofotometria e metodi basati sull'attività enzimatica. Di conseguenza, ciò permetterà di comprendere in modo accurato ed efficiente il ruolo del callosio nelle varie risposte fisiologiche e allo stress. Ricerche future potrebbero valutare in modo completo e simultaneo diversi metodi per la quantificazione del callosio, tra cui la microscopia a epifluorescenza, la microscopia a immunofluorescenza, la spettrofotometria a fluorescenza, la spettrofotometria a immunofluorescenza e i metodi basati sull'attività enzimatica.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitto di interessi.

Ringraziamenti

Questa ricerca è stata finanziata dalla Bill & Melinda Gates Foundation, con numero di finanziamento INV 009894/OPP1134098. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, analisi o interpretazione dei dati; nella stesura del manoscritto; o nella decisione di pubblicare i risultati.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Carta di alluminio  Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenya
Bilancio analitico  Mettler-Toledo AG, Greifensee, SvizzeraML204/01
Beadbeater 96BioSpec Products Inc., Bartlesville, OK, USA1001EUR
Carta assorbente Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenya
Albumina Sirica Bovina (BSA) Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USAB14
Centrifuga, 5425REppendorf, Amburgo, Germania5406000240
Frigorifero-congelatore combinato (4 °C; C e & meno; 20 & deg; C) Haier Medical and Laboratory Co. Ltd., Qingda, CinaHYCD-282
Dietanolamina & nbsp;PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcellona, Spagna191287
Digital Shaker, MixMateEppendorf, Amburgo, Germania5353000529
Fosfato idrogeno di-sodio (Na2HPO4)PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcellona, Spagna141679
Piastre ELISA, 96 pozzi, base piatta, trasparenti, polistire, alto legameSarstedt AG & Contia KG, Nü mbrecht, Germania82.1581.200
Filtro per il lettore microplate iMark, iMark 680, 405 nmLasec International Pty. Ltd., Città del Capo, SudafricaBRD1681011
Liofilizzatore, VirTis— BenchTop " K” serie; Modello: 4KBTXLLabWrench, Canada, USA448053
Acido cloridrico (HCl) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcellona, Spagna141020
Incubatore a Convezione Forzata Isotermia, IFA-54-8Gruppo Esco Lifesciences, Singapore2100002
Laminarin Alfa Aesar, Massachusetts, USAJ66193
Tubi microcentrifughe 1,5 mL Eppendorf, Amburgo, Germania022363204
Tubi microcentrifuga 2 mL Genesee Scientific Corp., California, USA24– 283
Micropipetta (30– 300 & mu; L), 12 canali, serie 2100 & nbsp;Eppendorf, Amburgo, GermaniaEP-12-300R
Punte della micropipetta epT.I.P.S.  SingoliEppendorf, Amburgo, Germania022363204
Micropipette (0,5– 1000 & mu; L), Ricerca  In piùEppendorf, Amburgo, Germania3123000900
Lettore di assorbimento a microplacche, iMarkBio-Rad Laboratories, Inc., California, USA1681135EDU
Microplate Manager 6 Versione 6 software & nbsp;Bio-Rad Laboratories, Inc., California, USA1689520
ParafilmPaul Marienfeld GmbH & Con la Società KG, Lauda-Kö Nigshofen, Germania740751
Para-nitrofenil fosfato (pNPP)Merck KGaA, Darmstadt, Germania20-106
Misuratore di pH, HI9126Hanna Instruments, Woonsocket, RI, USA02310048991
Polivinilpirridone (PVP) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcellona, SpagnaA2260
Cloruro di potassio (KCl)PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcellona, SpagnaA2939
Potassio di-idrogeno fosfato (KH2PO4) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcellona, Spagna141509
Bagno d'acqua di precisione, GP10Thermo Fisher Scientific Inc., Newinton, CT, USATSGP10
Anticorpi primari (1-3-β-glucan-directed mouse IgG) & nbsp;Bio supplies Australia Pty Ltd., Melbourne, Australia400-2
Serbatoi di reagenti  Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, USA15075
Anticorpo secondario coniugato con fosfatasi alcalina (anti-IgG-fosfatasi alcalina del topo) & nbsp;Sigma Life Sciences, New Jersey, USAA5153
Azid di sodio (NaN3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcellona, SpagnaA1430
Carbonato di sodio (Na2CO3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcellona, Spagna141648
Cloruro di sodio (NaCl) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcellona, SpagnaA2942
Carbonato di idrogeno di sodio (NaHCO3) PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcellona, Spagna141638
Idrossido di sodio (NaOH)PanReac AppliChem ITW Reagents, Quí mica SLU, Barcellona, Spagna141687.1210
Preadolescente-20Biomatik Corporation, Ontario, CanadaA4031
Acqua distillata ultrapuraThermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA10-977-015

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