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Articolo metodologico

Generazione di itenociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte tramite sovraespressione combinata della sclerassi e tensione uniassiale 2D

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DOI:

10.3791/65837

⸱

1 marzo 2024

 ,  , 
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

In questo articolo

Sommario

Questo articolo descrive una procedura per produrre iTenociti generando cellule stromali mesenchimali derivate da iPSC con sovraespressione combinata di Scleraxis utilizzando un vettore lentivirale e stretching uniassiale tramite un bioreattore 2D.

Abstract

Le sfide odierne nella riparazione dei tendini e dei legamenti richiedono l'identificazione di un candidato adatto ed efficace per la terapia cellulare per promuovere la rigenerazione del tendine. Le cellule stromali mesenchimali (MSC) sono state esplorate come potenziale strategia di ingegneria tissutale per la riparazione dei tendini. Sebbene siano multipotenti e abbiano un potenziale rigenerativo in vivo, sono limitati nella loro capacità di auto-rinnovamento e mostrano eterogeneità fenotipica. Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) possono aggirare queste limitazioni grazie alla loro elevata capacità di auto-rinnovamento e alla plasticità di sviluppo senza pari. Nello sviluppo dei tenociti, la sclerassi (Scx) è un regolatore molecolare diretto cruciale della differenziazione tendinea. Inoltre, è stato dimostrato che la meccanoregolazione è un elemento centrale che guida lo sviluppo e la guarigione del tendine embrionale. Per questo motivo, abbiamo sviluppato un protocollo per incapsulare l'effetto sinergico della stimolazione biologica e meccanica che può essere essenziale per la generazione di tenociti. Le iPSC sono state indotte a diventare cellule stromali mesenchimali (iMSC) e sono state caratterizzate con i classici marcatori delle cellule stromali mesenchimali tramite citometria a flusso. Successivamente, utilizzando un vettore lentivirale, le iMSC sono state trasdotte per sovraesprimere stabilmente SCX (iMSCSCX+). Queste cellule iMSCSCX+ possono essere ulteriormente maturate in iTenociti tramite carico di trazione uniassiale utilizzando un bioreattore 2D. Le cellule risultanti sono state caratterizzate dall'osservazione della sovraregolazione dei marcatori tendinei precoci e tardivi, nonché della deposizione di collagene. Questo metodo di generazione di iTenociti può essere utilizzato per aiutare i ricercatori a sviluppare una fonte di cellule allogeniche potenzialmente illimitata per applicazioni di terapia cellulare tendinea.

Introduzione

Per affrontare i problemi contemporanei nella riparazione di tendini e legamenti, è necessario disporre di una cellula candidata pertinente adatta alle terapie cellulari. Una via di indagine nell'ingegneria tissutale per la riparazione dei tendini coinvolge l'esplorazione delle cellule stromali mesenchimali derivate dal midollo osseo (BM-MSC) e delle cellule stromali derivate dal tessuto adiposo (ASC) come potenziali strategie. Queste cellule hanno capacità multipotenti, grande abbondanza e potenziale rigenerativo in vivo. Inoltre, hanno mostrato una maggiore capacità di guarigione e migliori risultati funzionali nei modelli animali1. Tuttavia, queste cellule mostrano limitate capacità di auto-rinnovamento, diversità fenotipica e, in particolare, limitata capacità di formazione dei tendini. La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) offre una soluzione a questi vincoli grazie alla sua notevole capacità di auto-rinnovamento e all'adattabilità allo sviluppo senza pari. Il nostro team di ricerca e altri hanno raggiunto con successo la differenziazione delle iPSC in entità simili alle cellule stromali mesenchimali (iMSCs)2,3. In quanto tali, le iMSC hanno il potenziale per essere una fonte allogenica per applicazioni di terapia con cellule tendinee.

La sclerassi (SCX) è un fattore di trascrizione essenziale per lo sviluppo del tendine ed è considerato il primo marcatore rilevabile per i tenociti differenziati. Inoltre, SCX attiva i marcatori di differenziazione tendinea a valle, tra cui il collagene a catena 1 di tipo 1a1 (COL1a1), il mohawk (MKX) e la tenomodulina (TNMD), tra gli altri 4,5,6. Altri geni espressi durante la maturazione tendinea includono il membro della famiglia 3 della proteina che promuove la polimerizzazione della tubulina (TPPP3) e il recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRa)7. Sebbene questi geni siano essenziali per lo sviluppo e la maturazione dei tendini, purtroppo non sono esclusivi del tessuto tendineo e sono espressi in altri tessuti muscoloscheletrici come l'osso o la cartilagine 5,7.

Oltre all'espressione di marcatori durante lo sviluppo tendineo, la meccanostimolazione è un elemento essenziale per lo sviluppo e la guarigione del tendine embrionale 4,5,6. I tendini sono meccanoreattivi e i loro modelli di crescita cambiano in risposta al loro ambiente. A livello molecolare, i segnali biomeccanici influenzano lo sviluppo, la maturazione, il mantenimento e le risposte di guarigione dei tenociti8. Vari sistemi di bioreattori sono stati utilizzati per modellare carichi fisiologici e segnali biomeccanici. Alcuni di questi sistemi modello includono il caricamento tissutale ex vivo, i sistemi di caricamento cellulare 2D che applicano una tensione biassiale o uniassiale e i sistemi 3D che utilizzano scaffold e idrogel 9,10. I sistemi 2D sono vantaggiosi quando si studiano gli effetti della stimolazione meccanica sui geni tendinei specifici o sulla morfologia delle cellule nel contesto del destino cellulare, mentre i sistemi 3D possono replicare in modo più accurato le interazioni cellula-ECM 9,10.

Nei sistemi di caricamento 2D, la deformazione tra le cellule e il substrato di coltura è omogenea, il che significa che il carico applicato sul citoscheletro delle cellule può essere completamente controllato. Rispetto al carico biassiale, il carico uniassiale è fisiologicamente più rilevante, poiché i tenociti sono prevalentemente soggetti a carico uniassiale da fasci di collagene in vivo9. Si è riscontrato che durante le attività quotidiane, i tendini sono soggetti a carico di trazione uniassiale fino al 6% di deformazione11. In particolare, studi precedenti hanno scoperto che il carico all'interno degli intervalli fisiologici del 4%-5% ha dimostrato di promuovere la differenziazione tenogenica preservando l'espressione di marcatori correlati ai tendini come SCX e TNMD, nonché l'aumento della produzione di collagene 9,10. Ceppi superiori al 10% possono essere traumaticamente rilevanti ma non fisiologicamente rilevanti 12,13.

Qui viene presentato un protocollo che tiene conto dell'effetto sinergico della stimolazione meccanica e biologica che può essere essenziale per la generazione dei tenociti. In primo luogo descriviamo un metodo riproducibile per indurre le iPSC nelle iMSC attraverso l'esposizione a breve termine dei corpi embrioidi ai fattori di crescita, confermato dai marcatori di superficie delle MSC utilizzando la citometria a flusso. Descriviamo quindi in dettaglio un metodo di trasduzione lentivirale per ingegnerizzare le iMSC in modo che abbiano una sovraespressione stabile di SCX (iMSCSCX+). Per un'ulteriore maturazione cellulare, gli iMSCSCX+ vengono seminati in piastre di silicone rivestite di fibronectina e sottoposti a un protocollo di tensione uniassiale ottimizzato utilizzando il bioreattore CellScale MCFX. Il potenziale tenogenico è stato confermato osservando la sovraregolazione dei marcatori tendinei precoci e tardivi, nonché la deposizione di collagene14. Questo metodo di generazione di iTenociti è un proof-of-concept che può offrire una fonte allogenica illimitata pronta all'uso per applicazioni di terapia con cellule tendinee.

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Protocollo

Questo protocollo per la produzione di iTenociti può essere condotto in tre fasi principali: da iPSC a iMSC (10 giorni), da iMSC a iMSCSCX+ (2 settimane), da iMSCSCX+ a iTenociti (minimo 4 giorni). Ogni fase principale del protocollo può essere messa in pausa e riavviata in un secondo momento, a seconda della tempistica sperimentale. Per i metodi coinvolti nella coltura delle cellule, devono essere impiegate tecniche sterili. Tutte le cellule di questo protocollo devono essere coltivate a 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità.

1. Induzione di iPSC umane in cellule stromali mesenchimali indotte (iMSC)

  1. Preparazione dell'esperimento
    1. Preparare il terreno IMDM-EB (Modified Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies) di Iscove.
      1. Integrare 50 mL di terreno basale IMDM con 8,5 mL di siero sostitutivo knock-out, 500 μL di aminoacidi non essenziali Minimal Essential Medium (MEM), 0,385 μL (110 mM stock) di beta-mercaptoetanolo e 500 μL di soluzione antibiotico-antimicotica (AAS) (concentrazioni finali: 17%, 1%, 110 μM, 1%, rispettivamente) (vedere Tabella dei materiali).
    2. Preparare i terreni per le cellule stromali mesenchimali (MSC).
      1. Integrare 440 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) a basso contenuto di glucosio con 50 mL di siero fetale bovino (FBS), 5 mL di soluzione antibiotico-antimicotica (AAS) e 5 mL di L-glutammina (concentrazioni finali: 10%, 1%, 2 mM, rispettivamente).
    3. Preparare lastre rivestite in poli(2-idrossietilmetacrilato) (poli-HEMA).
      1. Aggiungere 10 g di poli-HEMA (vedere Tabella dei materiali) in un flacone sterile.
      2. Aggiungere un agitatore magnetico al flacone e, mescolando, aggiungere lentamente 500 ml di EtOH al 95%.
      3. Una volta aggiunto tutto l'EtOH, attivare la modalità di agitazione a 1200 giri/min con ulteriore fuoco basso per almeno 6 h. La soluzione poly-HEMA può essere conservata a temperatura ambiente per un massimo di un anno.
      4. In condizioni sterili, aggiungere 2,5 μg/cm2 in 9 mL in un matraccio T75. Regolare il volume in base alle dimensioni del recipiente di coltura.
      5. Mantenendo la sterilità, lasciare asciugare i recipienti all'aria affinché l'EtOH evapori completamente prima dell'uso. Questo di solito richiede 24-72 ore.
    4. Preparare dei flaconi ricoperti di gelatina.
      1. Lavate una bottiglia di vetro con NaOH e dedicatela alla preparazione della gelatina. Non utilizzare detersivo.
      2. Preparare una soluzione di gelatina all'1% (5 g di gelatina e 500 ml di acqua priva di endotossine). Autoclavare il flacone di vetro con la soluzione di gelatina per 30 min.
      3. Lasciare raffreddare la soluzione di gelatina e conservarla a temperatura ambiente.
      4. Rivestire un matraccio T75 con 5 mL di soluzione di gelatina per matraccio e incubare per almeno 1 ora prima di seminare le cellule. I palloni ricoperti di gelatina possono essere preparati con 1 giorno di anticipo.
    5. Preparare il tampone FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorting).
      1. Miscelare PBS con il 2% di albumina sierica bovina e lo 0,1% di sodio azide. Conservare a 4 °C.
  2. Generazione di corpi embrioidi (EB)
    NOTA: le iPSC devono essere coltivate in una piastra a 6 pozzetti e devono raggiungere il 70%-80% di confluenza prima dell'uso.
    1. Il giorno 0, portare una piastra PCR 384 a fondo trasparente nella cappa per coltura tissutale e UV per 15 minuti senza coperchio.
    2. Rimuovere il terreno di coltura dalle iPSC (vedere la tabella dei materiali) e lavare i pozzetti con PBS.
    3. Aggiungere 0,5 mL di reagente di dissociazione cellulare delicata preriscaldato (vedere la tabella dei materiali) in ciascun pozzetto e incubare per 5 minuti a 37 °C. Osservare le cellule ogni 5 minuti fino a quando le iPSC non sono diventate cellule singole o piccoli aggregati sollevati in sospensione.
    4. Risospendere la sospensione cellulare con una pipetta da 1 mL per garantire una sospensione a cellula singola.
    5. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    6. Rimuovere il surnatante, risospendere nel terreno IMDM-EB (passaggio 1.1.1) e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule.
    7. Calcolare il volume appropriato di sospensione cellulare necessario per ottenere 5.000-25.000 cellule per pozzetto della piastra da 384 pozzetti con 25 μL di sospensione cellulare per pozzetto.
      NOTA: Generalmente, 2-3 pozzetti confluenti (70%-80%) di una piastra a 6 pozzetti possono produrre EB in una piastra a 384 pozzetti. La dimensione delle cellule per EB sarà determinata empiricamente. Per un'intera piastra da 384 pozzetti, è necessario utilizzare 9,6 mL di sospensione cellulare, 25 μL per pozzetto.
    8. Centrifugare nuovamente le cellule a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
    9. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in un volume appropriato di terreno IMDM-EB e 10 μM di dicloridrato Y-27632 (stock: 10 mM, 1000x, vedere la tabella dei materiali) in una provetta conica da 15 mL pre-raffreddata.
    10. Aggiungere la matrice di membrana basale solubilizzata a freddo (1 mg per piastra da 384 pozzetti di EB) al conico (vedere la tabella dei materiali).
    11. Distribuire 25 μL di sospensione cellulare su ciascun pozzetto. Mettere un coperchio sterile sulla piastra e centrifugare a 450 x g a 4 °C per 7 min. Incubare a 37 °C per 48 ore.
    12. Il giorno 2, trasferire le cellule in una piastra da 100 mm con 3 mL di terreno IMDM-EB preriscaldato.
    13. Trasferire gli EB nei palloni T75 rivestiti in poli-HEMA dedicati con 10 mL di IMDM-EB. Regolare il volume in base alle dimensioni del recipiente di coltura. Lascia crescere gli EB per 3 giorni.
    14. Il giorno 5, trasferire gli EB nei palloni T75 rivestiti di gelatina preparati con 10 mL di terreno IMDM-EB. Regolare il volume in base alle dimensioni del recipiente di coltura. Far crescere gli EB per altri 3 giorni in sospensione.
    15. Il giorno 8, assicurarsi che vengano osservati due tipi di EB: EB attaccati al pallone e EB non attaccati. Lavare via gli EB non attaccati dal pallone con PBS.
    16. Agli EB allegati, aggiungere terreni IMDM-EB integrati con TGFβ-1 (10 ng/mL) (vedi Tabella dei Materiali) e lasciarli crescere per 2 giorni.
    17. Il giorno 10, cambia il mezzo in MSC medio. Le cellule devono essere nutrite due volte a settimana. Una volta che il 70% è confluente, procedere al "Protocollo standard delle celle di sollevamento" per riplaccare le cellule. Riplaccare le cellule su piastre ricoperte di gelatina.
  3. Protocollo standard delle celle di sollevamento
    1. Una volta che le cellule aderenti hanno raggiunto il 70% di confluenza, aspirare il terreno di coltura dalle piastre e lavare con PBS.
    2. Sollevare le cellule aggiungendo 5 mL di tripsina allo 0,25% preriscaldata a ciascuna piastra da 150 mm e incubare per 5 minuti a 37 °C. Regolare il volume della tripsina in base alle dimensioni del recipiente di coltura.
    3. Al microscopio, controllare che la maggior parte delle cellule sia stata prelevata da ciascuna piastra. Se ci sono ancora cellule attaccate, picchiettare delicatamente i lati delle piastre per rimuovere le celle.
    4. Raccogli le cellule in un tubo conico aggiungendo il doppio del volume del terreno di coltura preriscaldato.
    5. Centrifugare le cellule a temperatura ambiente per 5 minuti a 300 x g. Rimuovere il surnatante e procedere con i passaggi successivi.
  4. Valutazione della citometria a flusso per l'espressione dei marcatori MSC
    NOTA: Le MSC umane, come le MSC del midollo osseo, devono essere utilizzate come controllo positivo.
    1. Eseguire il "Protocollo standard delle celle di sollevamento" (punto 1.3).
    2. Risospendere il surnatante con 3 mL di tampone FACS e trasferire l'intero volume nelle provette FACS.
    3. Centrifugare a temperatura ambiente per 5 minuti a 300 x g. Ripetere la fase di lavaggio con tampone FACS altre due volte.
    4. Alle provette colorate, aggiungere 2 μL di CD90-FITC antiumano di topo, CD44-APC antiumano di topo e CD105-PE antiumano (vedere Tabella dei materiali) e incubare per 45 minuti a 4 °C.
    5. Alle provette di controllo dell'isotipo, aggiungere 20 μL di IgG2a-FITC di topo, IgG1-PB di topo e IgG1-PE di topo (vedere Tabella dei materiali).
    6. Incubare al buio a 4 °C per 15 min. Lavare tutte le provette aggiungendo 3 mL di tampone FACS e centrifugare per 5 min a 300 x g (a temperatura ambiente). Risospendere le cellule in 250 μL di tampone FACS per ciascuna provetta.
    7. Analizzare l'espressione dei marcatori di superficie delle MSC utilizzando la citometria a flusso14. Le lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione dovrebbero essere: CD90-FITC, picco di eccitazione a 495 nm e picco di emissione a 519 nm; CD44-APC, picco di eccitazione a 640 e picco di emissione a 660 nm; CD105-PE, picco di eccitazione a 561 nm e picco di emissione a 574 nm.

2. Passaggio ed espansione di iMSC

  1. Preparazione dei reagenti
    1. Preparare il terreno di congelamento MSC.
      1. Combinare 30 mL di DMEM a basso contenuto di glucosio, 5 mL di DMSO e 15 mL di FBS (concentrazioni finali: 60%, 10%, 30%, rispettivamente).
      2. Filtrare la soluzione utilizzando un filtro sterile da 0,45 μm. Conservare a 4 °C.
  2. Passare
    NOTA: Dopo l'induzione, le iMSC devono essere coltivate su piastre ricoperte di gelatina per altri 2 passaggi prima di essere svezzate per crescere su piastre di coltura di tessuti di plastica. Inoltre, le cellule devono essere fatte passare con un rapporto di divisione 1:3 quando sono confluenti al 70%.
    1. Eseguire il "Protocollo standard delle celle di sollevamento" (punto 1.3).
    2. Risospendere le cellule nei terreni MSC e distribuirle equamente in tre nuove piastre da 150 mm di matracci T175 con 20 mL di terreno per pallone. Riportare le celle a 37 °C.
    3. Nutrire le cellule due volte a settimana sostituendo il terreno di coltura con terreni MSC preriscaldati.
  3. Congelamento
    1. Eseguire il "Protocollo standard delle celle di sollevamento".
    2. Risospendere le cellule in 1 mL di terreno di congelamento MSC. Aggiungere 1 mL di sospensione cellulare a un crioviale e conservare in un contenitore di congelamento per 24 ore a -80 °C prima di trasferire in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
  4. Scongelamento
    1. Preparare 10 mL di terreno MSC preriscaldato in una provetta conica da 15 mL.
    2. Recuperate il crioviale, immergetelo in un bagnomaria a 37 °C e agitate fino a quando non rimane una palla di ghiaccio delle dimensioni di un pisello (circa 1-2 minuti).
    3. Nella cappa per colture cellulari, aggiungere lentamente 1 mL del terreno preriscaldato al crioviale e pipettare su e giù per mescolare.
    4. Trasferire la sospensione cellulare dalla provetta conica crioviale alla provetta conica da 15 mL preparata con terreno preriscaldato e centrifugare per 5 minuti a 300 x g (a temperatura ambiente).
    5. Rimuovere il surnatante e risospendere con terreno fresco. Aggiungere la sospensione cellulare a una piastra da 150 mm con un volume totale di 20 mL. Regolare il volume in base alle dimensioni del pallone di coltura.
    6. Incubare le cellule a 37 °C fino al momento di dividerle.

3. Ingegneria genetica delle iMSCs per sovraesprimere SCX mediante trasduzione lentivirale

NOTA: Questa sezione del protocollo richiede due settimane per essere completata.

  1. Preparazione di terreni e reagenti
    1. Preparare HEK293T/17 terreni cellulari.
      1. Integrare 445 mL di Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) con 50 mL di FBS e 5 mL di AAS (concentrazioni finali: 10%, 1%, rispettivamente).
    2. Preparare i terreni di lenti-packing MSC.
      1. Preparare il siero termoinattivato riscaldando 50 mL di FBS a temperatura ambiente a bagnomaria a 60 °C per 30 min.
      2. Combinare 445 mL di DMEM a basso contenuto di glucosio con l'FBS inattivato al calore e 5 mL di L-glutammina (concentrazioni finali: 10%, 2 mM, rispettivamente).
    3. Preparare il complesso di trasfezione.
      1. Consentire lo scongelamento di componenti complessi di trasfezione (vedi Tabella dei materiali) sul ghiaccio: plasmidi di impacchettamento VSV-G e Delta, plasmide SCX e BioT15,16.
      2. Vortica delicatamente e fai ruotare i plasmidi. Misurare le concentrazioni di DNA.
      3. In base alle concentrazioni di DNA e al numero di palloni destinati alla trasfezione, calcolare il volume di ciascun componente necessario: per un pallone T75, il complesso di trasfezione sarà costituito da 750 μL di terreno privo di siero (come DMEM o PBS privo di siero), plasmide SCX da 7,5 μg, plasmide VSV-G da 0,75 μg, plasmide Delta da 6,75 μg e BioT da 22,5 μL. Considerare un extra per l'errore di pipettaggio.
      4. Mescolare pipettando delicatamente su e giù. Centrifugare brevemente. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti e consumare immediatamente.
  2. Trasfezione e produzione lentivirale
    ATTENZIONE: A partire dal giorno 3, il protocollo prevede il lavoro con lentivirus e, pertanto, il lavoro deve essere eseguito utilizzando procedure operative di contenimento di livello 2+. I lavoratori devono indossare dispositivi di protezione individuale, tra cui due strati di guanti, copripolsi, occhiali di sicurezza, mascherina, pantaloni lunghi e scarpe chiuse. Tutti i rifiuti e i materiali, compresi i puntali delle pipette, i flaconi e il terreno liquido, devono essere decontaminati con candeggina (ipoclorito di sodio finale all'1%) per almeno 20 minuti. Non utilizzare l'aspirapolvere.
    1. Seme HEK293T/17 celle.
      1. Circa 18-24 ore prima della trasfezione (giorno 0), sollevare e placcare le cellule 293T in matracci T75. I volumi seguenti presuppongono T75 come recipiente di coltura. Regolare il volume in base al recipiente di coltura cellulare utilizzato.
      2. Rimuovere il terreno di coltura dai palloni e lavare con 5 mL di PBS.
        NOTA: Le celle si sollevano molto facilmente dalla superficie del pallone. Aggiungere PBS sul lato del pallone ed evitare l'aggiunta diretta di soluzione alle cellule.
      3. Aggiungere 3 mL di tripsina allo 0,25% preriscaldata in ciascun matraccio e incubare a 37 °C per 5 min. Raccogliere le cellule in una provetta conica e centrifugare a temperatura ambiente per 5 minuti a 300 x g.
      4. Rimuovere il surnatante, risospendere il terreno 293T e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule.
      5. Impiattare le cellule a 5,3 x 104 cellule/cm2 e incubare a 37 °C per una notte.
      6. Il giorno successivo (giorno 1), preparare il complesso di trasfezione. Sostituire il terreno di coltura delle cellule con 5 mL di terreno di coltura preriscaldato per il confezionamento di lenti MSC (passaggio 3.1.2).
      7. Aggiungere il complesso di trasfezione goccia a goccia alle cellule. Inclinare delicatamente la capsula per garantire un'esposizione uniforme del complesso di trasfezione alle cellule. Rimettere le cellule nell'incubatrice per 48 ore.
        NOTA: La tossicità deve essere osservata dopo 24 ore (giorno 2).
      8. Dopo 48 ore (giorno 3), raccogliere con cura il terreno contenente il virus in una provetta conica separata utilizzando una pipetta e centrifugare per 5 minuti a 300 x g (a temperatura ambiente).
      9. Aggiungere 5 mL di terreno di coltura MSC preriscaldato al matraccio T75 di cellule 293T e rimetterlo nell'incubatore per una notte.
      10. Dopo la centrifugazione, filtrare il surnatante con un filtro sterile da 0,45 μm pipettando direttamente il surnatante attraverso il filtro. Conservare il terreno contenente virus a 4 °C per una notte.
      11. Dopo altre 24 ore (giorno 4), raccogliere nuovamente con cura il terreno contenente il virus in una provetta conica separata utilizzando una pipetta e centrifugare per 5 minuti a 300 x g (a temperatura ambiente).
      12. Combinare il virus con il virus del giorno di raccolta precedente e miscelare per garantire una soluzione omogenea. A questo punto, il protocollo può essere messo in pausa e riavviato in un secondo momento, a seconda della tempistica sperimentale. Il lentivirus può essere aliquotato e congelato a -80 °C, oppure il lentivirus può essere conservato su ghiaccio mentre si procede con la "Trasduzione delle iMSCs con SCX" (fase 3.3).
        NOTA: Una volta che le aliquote di lentivirus sono state congelate e scongelate, non ricongelare.
  3. Trasduzione di iMSC con SCX
    1. Eseguire la trasduzione della piastra di titolo.
      1. Il giorno 0, eseguire il "Protocollo standard delle celle di sollevamento".
      2. Risospendere le cellule nei terreni MSC e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule.
      3. In una piastra a 6 pozzetti, aggiungere 4 x 103 cellule/cm2. Riplaccare il restante in una piastra aggiuntiva da 150 mm con 20 mL di terreno MSC (questa sarà la piastra di controllo). Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C.
      4. Il giorno successivo (giorno 1), le cellule dovrebbero essere confluenti ~40%. Preriscaldare il terreno di coltura lenti-impacchettamento e scongelare il polibrone e circa 3 mL di lentivirus su ghiaccio (o se fatto lo stesso giorno della raccolta del virus, conservare su ghiaccio fino all'uso).
      5. Aggiungere il terreno di coltura e il lentivirus ai pozzetti in base ai titoli desiderati (ad esempio, 12,5%, 25%, 50%, 75%, 100%). Aggiungere 0,5 μL di polybrene per ottenere una concentrazione finale di 5 μg/mL (concentrazione madre: 10 mg/mL, vedere la tabella dei materiali).
      6. Far roteare la piastra per garantire un'esposizione uniforme a tutte le cellule. Rimettere la piastra nell'incubatrice a 37 °C per 48 ore.
    2. Valutare l'efficienza del titolo del lentivirus SCX con la citometria a flusso.
      1. Dopo 48 ore, eseguire il "Protocollo standard delle celle di sollevamento".
      2. Risospendere le cellule in PBS e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule. Centrifugare le cellule a temperatura ambiente per 5 minuti a 300 x g.
      3. Rimuovere il surnatante e risospenderlo in 3 mL di tampone FACS per il lavaggio. Trasferire la sospensione cellulare in provette per citometria a flusso e centrifugare per 5 minuti a 300 x g.
      4. Ripetere il lavaggio del tampone FACS altre due volte e risospendere i pellet cellulari finali in 300 μL di tampone FACS. Valutare l'espressione di GFP per ciascun titolo utilizzando una macchina per citometria a flusso.
      5. Sulla base dei titoli e dei conteggi di vitalità cellulare, determinare il titolo di lentivirus appropriato per procedere con la trasduzione. A questo punto, il protocollo può essere messo in pausa e riavviato in un secondo momento, a seconda della tempistica sperimentale.
    3. Eseguire la trasduzione SCX su larga scala.
      NOTA: I volumi elencati si riferiscono a 1 piastra da 150 mm o 1 pallone T175. Questo può essere regolato di conseguenza a seconda delle dimensioni del vaso desiderato e della scala di trasduzione.
      1. Il giorno 0, eseguire il "Protocollo standard delle celle di sollevamento".
      2. Risospendere le cellule nei terreni MSC e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule. Seminare le celle a 4 x 103 celle/cm2. Incubare le cellule per 24 ore a 37 °C.
      3. Il giorno successivo (giorno 1), le cellule dovrebbero essere confluenti ~40%. Preriscaldare il terreno di coltura per l'imballaggio delle lentici e scongelare il porlorne e la quantità precalcolata di lentivirus sul ghiaccio.
      4. In base al titolo deciso, aggiungere ai pozzetti la quantità desiderata di terreno di coltura per l'impacchettamento di lentiti e lentivirus. Aggiungere 5 μg/mL di polybrene (concentrazione madre: 10 mg/mL).
      5. Il giorno 3, osserva le cellule al microscopio a fluorescenza. L'iMSCSCX+ di nuova produzione dovrebbe emettere fluorescenza GFP. Sostituire il terreno contenente il virus con un terreno MSC preriscaldato. A questo punto, il protocollo può essere messo in pausa e riavviato in un secondo momento, a seconda della tempistica sperimentale.

4. Passaggio ed espansione di iMSCSCX+

  1. Eseguire il passaggio, l'espansione, il congelamento e lo scongelamento di iMSCSCX+ come per gli iMSC, come descritto nel passaggio 2 del protocollo.

5. Carico meccanico

NOTA: Questa sezione richiede un minimo di 4 giorni, ma può essere più lunga a seconda che si osservi o meno una contrazione cellulare.

  1. Preparazione dell'esperimento
    1. Preparare le piastre in silicone.
      1. Autoclavare 2 piastre in silicone (vedi Tabella dei Materiali). Successivamente, in condizioni sterili, rimuovere le piastre in silicone dal sacchetto dell'autoclave e posizionarle in piastre da 150 mm.
      2. Combinare 130 μL di fibronectina (100x, vedere la tabella dei materiali) con 13 mL di PBS sterile in una provetta conica da 15 mL. Capovolgere il tubo più volte per mescolare.
      3. Aggiungere 400 μL di soluzione di fibronectina a ciascun pozzetto delle piastre di silicone. Incubare le piastre a 37 °C per un minimo di 2 ore o per tutta la notte.
      4. Prima dell'uso, aspirare la soluzione di fibronectina e lasciare asciugare le piastre all'aria nella cappa di coltura cellulare per almeno 30 minuti per far evaporare completamente la soluzione di fibronectina.
        NOTA: La soluzione di fibronectina può essere rimossa dai pozzetti in anticipo e le piastre ora rivestite possono rimanere a 37 °C per un massimo di un paio di settimane fino all'uso.
    2. Preparare i supporti estensibili MSC.
      1. Preparare i terreni estensibili MSC aggiungendo 140 μL di acido ascorbico (stock: 100x, concentrazione finale: 50 μg/mL) a 14 mL di terreni MSC preriscaldati in una provetta conica da 15 mL.
        NOTA: L'acido ascorbico deve essere aggiunto fresco al terreno MSC prima di ogni cambio di terreno.
  2. Semina di iMSCSCX+ nelle piastre siliconiche
    1. Eseguire il "Protocollo standard delle celle di sollevamento" (punto 1.3).
    2. Risospendere le cellule nei terreni MSC e contare le cellule vitali utilizzando un emocitometro o un contatore di cellule.
    3. Calcolare il volume di sospensione cellulare necessario per ottenere 1,25 x 104 cellule/cm2.
    4. Rimuovere questo volume di terreno estensibile MSC dalla provetta conica da 15 ml. Aggiungi le celle di destinazione. Invertire in modo omogeneo la nuova sospensione cellulare.
    5. Aggiungere 400 μL della nuova sospensione cellulare a ogni pozzetto di entrambe le piastre di silicone.
    6. Rimettere il coperchio sulle piastre da 150 mm e rimetterle nell'incubatrice a 37 °C per 24 ore.
  3. Tensione uniassiale
    1. Il giorno successivo, sciacquare l'apparecchio di filatura (vedi tabella dei materiali) con ddH2O seguito da etanolo al 70%. Pulire l'apparecchio, posizionarlo nella cappa per colture cellulari e UV per 15 minuti.
    2. Recupera le piastre seminate e controlla che i pozzetti siano ben attaccati alle cellule.
    3. Lasciare una piastra nell'incubatrice (controllo statico) e posizionare la piastra in silicone con il secondo seme nell'apparecchio di filatura allineando le viti con i fori della piastra in silicone. Riposizionare il coperchio dell'apparecchio per garantire la sterilità.
    4. Collegare l'apparecchio con la piastra in silicone seminato alla sorgente elettronica (vedi Tabella dei materiali) e posizionarlo nell'incubatrice a 37 °C.
    5. Nel programma, impostare il protocollo di stretching ciclico al 4% di sforzo sinusoidale, 0,5 Hz, 2 ore al giorno. Inizia l'allungamento premendo una volta il pulsante di avvio . Lo stretching dovrebbe iniziare immediatamente.
    6. Allungare le cellule per un minimo di 3 giorni. Monitorare le cellule quotidianamente e interrompere il protocollo di allungamento se si può osservare una contrazione cellulare. Sostituire il supporto con un nuovo supporto estensibile MSC a giorni alterni.

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Risultati

Differenziazione delle iPSC umane in iMSCs
Come descritto in precedenza, l'attuale protocollo per differenziare le iPSC in iMSC prevede la formazione di corpi embrioidi2. Questo processo richiede circa dieci giorni per indurre le iMSC dalle iPSC (Figura 1A). Tuttavia, si consiglia vivamente di passare gli iMSC appena generati almeno due volte. Questo non solo aiuta a eliminare la necessità di piastre rivestite di gelatina, ma stabilisce anche un'es...

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Discussione

In questo protocollo, gli itenociti sono generati attraverso tre fasi principali: (1) induzione di iPSC a iMSC, (2) sovraespressione di SCX utilizzando un vettore lentivirale e (3) maturazione delle cellule attraverso la tensione uniassiale 2D.

Il protocollo presentato per differenziare le iPSC in iMSC è stato precedentemente descritto dal nostro gruppo2. Da quella pubblicazione, sono stati sviluppati numerosi protocolli, tra cui un protocollo consolidato per l'utilizzo...

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Dichiarazioni

Tutti gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato parzialmente supportato dal NIH/NIAMS K01AR071512 e dal CIRM DISC0-14350 a Dmitriy Sheyn. I due plasmidi di confezionamento dei lentivirus sono stati donati dal laboratorio Simon Knott (Dipartimento di Scienze Biomediche, Cedars-Sinai Medical Center).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
2-mercaptoetanolo Sigma AldrichM3148
AccutaseStemCell Technologies7920reagente di dissociazione cellulare
Soluzione antibiotico-antimicoticaThermofisher15240096
Anti-CD105Ancell326-050
APC topo anti-umano CD44BD Biosciences559942
APC mouse IgG2 K controllo dell'isotipoBD Biosciences555745
BenchMark fetale siero bovinoGeminiBio100-106
BiglycanThermofisherHs00959143_m1
Siero bovino albuminaMillipore SigmaA3733
Collagene di tipo I alfa 1 catena umana Taqman primerThermofisherHs00164004_m1
Collagene di tipo III alfa 1 catena umana Taqman primerThermofisherHs00943809_m1
Dimetil solfossidoMillipore SigmaD8418
DMEM, basso glucosio, piruvato, senza glutammina, senza fenolo rossoThermofisher11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)ATCC30-2003
Fibronectina plasma bovinoSigma AldrichF1141
FITC topo anti-umano CD90BD Biosciences555595
Gelatina da pelle suinaSigma AldrichG1890
Capra anti Topo IgG1-PEBio-RadSTAR117
HEK 293T/17ATCCCRL-11268
IMDM, senza fenolo rossoThermofisher21056023
iPSC: 83i-cntr-33n1Cedars-Sinai iPSC Core FacilityN/Ahttps://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Anticorpo per il controllo degli isotipi, topo IgG2a-FITCMiltenyi Biotec130-113-271
Sostituzione del siero KnockOutThermofisher10828010
acido L-ascorbicoSigma AldrichA4544
L-GlutamminaThermofisher2503081
MatrigelCorning354230matrice a membrana basale
MechanoCulture FXCellScaleN/Aapparato di stretching
MEM soluzione di aminoacidi non essenzialiThermofisher11140050
Mohawk umano Taqman primerThermofisherHs00543190_m1
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276
PBSThermofisher10010023
Recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine Un primer Taqman umanoThermofisherHs00998018_m1
Poli(2-idrossietilmetacrilato)Sigma Aldrich192066
Reagenti per infezione/trasfezione di PolybreneMillipore SigmaTR-1003
Ricombinante umano  TGF-beta 1 proteina umana Taqman primerRnD Systems240-B
Scleraxis umano Taqman primerThermofisherHs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) umano taggato ORF cloneOriGeneRC224305L4
Piastre in siliconeCellScaleN/A
Sodio azideMillipore SigmaS2002
Tenascin C Primer Taqman umanoThermofisherHs00370384_m1
Tenomodulin primer Taqman umanoThermofisherHs00223332_m1
Trombospondina 4 primer Taqman umanoThermofisherHs00170261_m1
Reagente di trasfezione, BioTBioland Scientific LLCB01-01
Tripsina-EDTA (0,25%)Thermofisher25200072
Membro della famiglia delle proteine che promuovono la polimerizzazione della tubulina 3ThermofisherHs03043892_m1
Dicloridrato di Y-27632Biogems1293823

Riferimenti

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