Isolamento chimico basato sull'affinità di vescicole extracellulari da biofluidi per analisi proteomiche e fosfoproteomiche

Summary

Il presente protocollo fornisce descrizioni dettagliate per l'isolamento efficiente delle vescicole extracellulari urinarie utilizzando microsfere magnetiche funzionalizzate. Inoltre, comprende analisi successive, tra cui western blotting, proteomica e fosfoproteomica.

Abstract

Le vescicole extracellulari (EV) dei biofluidi hanno recentemente guadagnato un'attenzione significativa nel campo della biopsia liquida. Rilasciati da quasi tutti i tipi di cellule, forniscono un'istantanea in tempo reale delle cellule ospiti e contengono una grande quantità di informazioni molecolari, comprese le proteine, in particolare quelle con modificazioni post-traduzionali (PTM) come la fosforilazione, come principale attore delle funzioni cellulari e dell'insorgenza e progressione della malattia. Tuttavia, l'isolamento delle vescicole extracellulari dai biofluidi rimane impegnativo a causa delle basse rese e delle impurità degli attuali metodi di isolamento delle vescicole extracellulari, rendendo difficile l'analisi a valle del carico di vescicole extracellulari, come le fosfoproteine delle vescicole extracellulari. In questo articolo, descriviamo un metodo di isolamento rapido ed efficace delle EV basato su microsfere magnetiche funzionalizzate per l'isolamento delle EV da biofluidi come l'urina umana e l'analisi della proteomica e della fosfoproteomica a valle dopo l'isolamento delle vescicole extracellulari. Il protocollo ha consentito un'elevata resa di recupero delle vescicole extracellulari urinarie e dei profili sensibili del proteoma e del fosfoproteoma delle vescicole extracellulari. Inoltre, in questa sede vengono affrontate anche la versatilità di questo protocollo e le relative considerazioni tecniche.

Introduction

Le vescicole extracellulari (EV) sono nanoparticelle incapsulate nella membrana secrete da tutti i tipi di cellule e sono presenti in biofluidi come sangue, urina, saliva, ecc.1,2,3,4. Le vescicole extracellulari trasportano un carico di diverse molecole bioattive che riflettono lo stato fisiologico e patologico delle loro cellule ospiti e, quindi, funzionano come fattori cruciali nella progressione della malattia ^4,5,6. Inoltre, studi approfonditi hanno stabilito che i marcatori di malattia basati sulle vescicole extracellulari possono essere identificati prima dell'insorgenza dei sintomi o del rilevamento fisiologico dei tumori ^5,6,7.

La fosforilazione agisce come un meccanismo chiave nella segnalazione e nella regolazione cellulare. Pertanto, le fosfoproteine forniscono una fonte preziosa per la scoperta di biomarcatori poiché eventi di fosforilazione aberranti sono associati a vie di segnalazione cellulare disregolate e allo sviluppo di malattie metastatiche come il cancro ^8,9,10. Sebbene la profilazione delle dinamiche di fosforilazione consenta l'identificazione di firme fosfoproteiche specifiche della malattia come potenziali biomarcatori, la bassa abbondanza e la natura dinamica delle fosfoproteine pongono grandi sfide nello sviluppo delle fosfoproteine come biomarcatori^11,12. In particolare, le fosfoproteine poco abbondanti incapsulate all'interno delle vescicole extracellulari sono protette dalla digestione enzimatica esterna nell'ambiente extracellulare⁸. Di conseguenza, le vescicole extracellulari e le fosfoproteine derivate da EV offrono una fonte ideale per la scoperta di biomarcatori nella diagnosi precoce del cancro e di altre malattie.

Sebbene l'analisi della fosforilazione delle proteine nelle vescicole extracellulari offra una risorsa preziosa per comprendere la segnalazione del cancro e la diagnosi precoce della malattia, la mancanza di metodi efficienti di isolamento delle vescicole extracellulari rappresenta un ostacolo importante. L'isolamento delle vescicole extracellulari è comunemente ottenuto attraverso l'ultracentrifugazione differenziale (DUC)¹³. Tuttavia, questo metodo richiede molto tempo e non è adatto per le implicazioni cliniche a causa della bassa produttività e della scarsa riproducibilità^13,14. Gli approcci alternativi di isolamento delle EV, come la precipitazione indotta da polimeri¹⁵, sono limitati dalla bassa specificità dovuta alla co-precipitazione delle proteine non-EV. Gli approcci basati sull'affinità, tra cui la cattura dell'affinità basata sugli anticorpi¹⁶ e la filtrazione dell'affinità¹⁷, offrono una maggiore specificità, ma sono limitati a un tasso di recupero relativamente basso a causa del volume ridotto.

Per affrontare i problemi nell'esplorazione della dinamica delle fosfoproteine nelle vescicole extracellulari, il nostro gruppo ha sviluppato una tecnica di recupero e purificazione totale delle vescicole extracellulari (EVtrap) basata sull'affinità chimica per catturare le vescicole extracellulari su microsfere magnetiche funzionalizzate¹⁸. Risultati precedenti hanno dimostrato che questo metodo di isolamento delle vescicole extracellulari basato su microsfere magnetiche è altamente efficace nell'isolare le vescicole extracellulari da un'ampia gamma di campioni di biofluidi ed è in grado di ottenere una resa di vescicole extracellulari molto più elevata, riducendo al minimo la contaminazione rispetto al DUC e ad altri metodi di isolamento esistenti^18,19. Abbiamo utilizzato con successo EVtrap e un metodo di arricchimento di fospopeptidi a base di titanio sviluppato dal nostro gruppo²⁰ per profilare il fosfoproteoma di vescicole extracellulari derivate da diversi biofluidi e per rilevare potenziali biomarcatori fosfoproteici per varie malattie 19,21,22.

Qui presentiamo un protocollo basato su EVtrap per l'isolamento delle vescicole extracellulari circolanti. Il protocollo si concentra sulle vescicole extracellulari urinarie. Dimostriamo anche la caratterizzazione di vescicole extracellulari isolate utilizzando il western blotting. Descriviamo quindi in dettaglio la preparazione del campione e l'acquisizione della spettrometria di massa (MS) per le analisi di proteomica e fosfoproteomica. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro efficiente e riproducibile per la profilazione del proteoma e del fosfoproteoma delle vescicole extracellulari urinarie, che faciliterà ulteriori studi sulle vescicole extracellulari e sulle loro applicazioni cliniche²³.

Protocol

Tutti i campioni di urina sono stati raccolti da individui sani dopo il consenso informato. Gli esperimenti erano conformi a tutti gli standard etici che coinvolgono campioni umani e conformi alle linee guida del programma di protezione della ricerca umana della Purdue University.

1. Raccolta dei campioni

1. Centrifugare 12 mL di campione di urina in una provetta da centrifuga conica da 15 mL per 10 minuti a 2.500 x g, 4 °C per rimuovere i detriti cellulari e i corpi apoptotici di grandi dimensioni.
2. Trasferire 10 mL del surnatante in una nuova provetta da 15 mL e procedere con l'isolamento delle vescicole extracellulari.
   NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa e i campioni possono essere conservati a -80 °C e scongelati a 37 °C al momento dell'uso.

2. Isolamento delle vescicole extracellulari con l'approccio EVtrap

1. Aggiungere 0,5 mL di tampone di carico (rapporto 1:10 v/v) e 100 μL di liquame a microsfere EVtrap (rapporto 1:50 v/v) al campione secondo le istruzioni del produttore.
2. Incubare il campione ruotandolo da un'estremità all'altra per 30 minuti a temperatura ambiente.
3. Pellet il campione posizionando la provetta conica da 15 mL su un rack separatore magnetico. Rimuovere il surnatante.
4. Risospendere le perle in 1 mL di tampone di lavaggio e trasferire la sospensione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Pipettare delicatamente per risospendere le perle legate all'EV.
5. Posizionare la provetta su un rack separatore magnetico per provette da microcentrifuga da 1,5 mL e aspirare il surnatante. Utilizzare una pipetta P200 per aspirare completamente il surnatante ed evitare di aspirare le microsfere.
6. Lavare le perline con 1 ml di tampone di lavaggio. Aggiungere il tampone subito dopo aver aspirato il surnatante per evitare che le perle si secchino.
7. Lavare le perle 2 volte con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a temperatura ambiente.
8. Incubare le microsfere con 100 μL di trietilammina da 100 mM appena preparata per 10 minuti a temperatura ambiente e raccogliere la soluzione eluita contenente EV utilizzando un rack separatore magnetico per provette da microcentrifuga da 1,5 mL.
   NOTA: Per preparare 1 mL di trietilammina 100 mM, diluire 14 μL di soluzione di trietilammina in acqua.
9. Ripetere il passaggio 2.8 e unire le soluzioni eluite. Essiccare l'eluato utilizzando un concentratore centrifugo sottovuoto a 4 °C.
   NOTA: L'esperimento può essere messo in pausa qui. I campioni di EV essiccati possono essere conservati a -80 °C per diversi mesi senza effetti negativi sui passaggi successivi o sui risultati.

3. Caratterizzazione delle vescicole extracellulari mediante western blotting

1. Risospendere il 5% del campione EV essiccato (equivalente a 0,5 mL del campione di urina) in 20 μL di 1 tampone per campioni di litio dodecilsolfato (LDS) con 10 mM di ditiotreitolo (DTT).
   NOTA: Le vescicole extracellulari da 0,5 mL di urina sono sufficienti per rilevare il segnale CD9 (un marcatore^{EV 24}) nel western blotting.
2. Far bollire il campione per 5 minuti a 95 °C. Caricare il campione su un gel di poliacrilammide ed eseguire l'elettroforesi e l'immunoblotting seguendo i protocolli standard²⁵.
3. Dopo aver trasferito le proteine su una membrana in fluoruro di polivinilidene a bassa fluorescenza (PVDF), bloccare la membrana con albumina sierica bovina (BSA) all'1% in soluzione salina tamponata tris tween-20 (TBST) per 1 ora a temperatura ambiente. Per preparare 1 L di tampone TBST, aggiungere 19 mM di Tris base, 137 mM di NaCl e 1 mL di Tween-20; regolare il pH a 7,4 utilizzando HCl.
4. Incubare la membrana con l'anticorpo anti-CD9 di coniglio in rapporto 1:5.000 in BSA all'1% in TBST a 4 °C per una notte o per 2 ore a temperatura ambiente.
5. Lavare la membrana 3 volte per 5 minuti ciascuna con TBST. Incubare la membrana con IgG anti-coniglio, anticorpo secondario legato all'HRP in rapporto 1:5000 in BSA all'1% in TBST per 1 ora a temperatura ambiente.
6. Lavare la membrana 3 volte per 5 minuti ciascuna con TBST. Aggiungere i substrati a chemiluminescenza avanzata (ECL) ottenuti commercialmente (rapporto 1:1) sulla membrana e rilevare i segnali su un sistema di imaging a chemiluminescenza.

4. Preparazione del campione per l'analisi proteomica e fosfoproteomica

1. Preparare un tampone di lisi fresco contenente 12 mM di desossicolato di sodio (SDC), 12 mM di sodio lauroil sarcosinato (SLS), 100 mM di tampone di bicarbonato di trietilammonio (TEAB), 10 mM di tris-(2-carbossietil)fosfina (TCEP), 40 mM di cloroacetammide (CAA) e 1x cocktail di inibitori della fosfatasi.
   NOTA: Le soluzioni stock sono elencate nella descrizione della Tabella dei materiali. Il tampone di lisi viene preparato aggiungendo le soluzioni madre per ottenere le concentrazioni desiderate a seconda del volume richiesto.
2. Solubilizzare il campione EV essiccato in 100 μL di tampone di lisi e riscaldare il campione per 10 minuti a 95 °C con agitazione a 1.100 giri/min.
3. Dopo aver raffreddato il campione a temperatura ambiente, diluirlo cinque volte aggiungendo 400 μL di TEAB 50 mM.
4. Misurare la concentrazione proteica utilizzando un kit di analisi BCA secondo le istruzioni del produttore. Utilizzare il tampone di lisi diluito cinque volte con 50 mM TEAB come bianco.
5. Aggiungere la miscela tripsina/Lys-C con un rapporto enzima/proteina di 1:50 p/p e incubare il campione a 37 °C per una notte con agitazione a 1.100 giri/min.
6. Aggiungere 50 μL di acido trifluoroacetico (TFA) al 10% per acidificare il campione.
7. Aggiungere 600 μL di acetato di etile ai campioni e agitare la miscela per 2 minuti.
8. Centrifugare il campione per 3 minuti a 20.000 x g e rimuovere lo strato superiore (strato organico). Evitare di disturbare l'interfaccia durante l'aspirazione.
9. Ripetere i passaggi 4.7-4.8. Essiccare la fase acquosa utilizzando un concentratore centrifugo sottovuoto.
10. Risospendere il campione essiccato in 200 μL di TFA allo 0,1% per acidificare i peptidi e dissalare il campione utilizzando una punta di desalinizzazione C18 secondo le istruzioni del produttore. Condizionare la punta con 200 μL di TFA allo 0,1% in acetonitrile all'80%, seguita da 2x con 200 μL di TFA allo 0,1%. Caricare il campione di peptide acidificato nella puntale e quindi lavare la punta 3 volte con 200 μL di TFA allo 0,1%. Eluire i peptidi con 200 μL di TFA allo 0,1% in acetonitrile all'80%.
11. Essiccare l'eluato utilizzando un concentratore centrifugo sottovuoto. Essiccare separatamente il 2% del campione peptidico (equivalente a 0,2 mL del campione di urina) per l'analisi proteomica. Utilizzare il resto (98%) del campione per l'analisi fosfoproteomica.
12. Arricchire i fosfopeptidi dal campione utilizzando un kit di arricchimento di fosfopeptidi secondo le istruzioni del produttore. Eseguire i passaggi descritti di seguito per l'arricchimento.
    1. Risospendere il campione essiccato in 200 μL di tampone di carico. Aggiungere 50 μL di microsfere al campione e agitare energicamente per 20 minuti a temperatura ambiente. Caricare il campione con le perle sulla punta fritta e centrifugare per 1 minuto a 100 x g.
    2. Lavare la punta con 200 μL di tampone di carico, quindi con il tampone di lavaggio 1, quindi con il tampone di lavaggio 2. Eseguire tutte e tre le fasi di lavaggio centrifugando una volta per 2 minuti a 20 x g e una volta per 1 minuto a 100 x g.
    3. Metti la punta con le perline in un nuovo tubo per raccogliere i fosfopeptidi eluiti. Aggiungere 50 μL di tampone di eluizione al puntale e centrifugare una volta per 2 minuti a 20 x g. Aggiungere altri 50 μL di tampone di eluizione al puntale e centrifugare una volta per 2 minuti a 20 x g. Centrifugare un'ultima volta per 1 minuto a 100 x g.
13. Essiccare i fosfopeptidi eluiti utilizzando un concentratore centrifugo sottovuoto.

5. Analisi LC-MS/MS

NOTA: È possibile utilizzare diversi sistemi/impostazioni LC-MS/MS e metodi di acquisizione dati, come l'acquisizione dipendente dai dati (DDA).

1. Risospendere i campioni essiccati di proteoma/fosfoproteoma in acido formico allo 0,1% (solvente A) e caricare i campioni secondo le istruzioni del produttore.
2. Iniettare i campioni nella MS a tempo di volo a mobilità ionica intrappolata attraverso il sistema di cromatografia liquida (LC) e utilizzare il metodo standardizzato preimpostato Whisper 40 campioni al giorno. I peptidi sono separati su una colonna C18 di 15 cm (diametro interno 75 μm, dimensione delle particelle 1,9 μm) come indicato nella tabella dei materiali.
3. Per l'analisi proteomica, acquisire i dati utilizzando un metodo di acquisizione parallelo-frammentazione seriale combinato con il metodo di acquisizione dia-PASEF (data-independent acquisition) con un intervallo di massa per rampa compreso tra 300-1200 m/z e da 0,6-1,50 1/K0 con un tempo di ciclo di 1,38 s.
4. Per l'analisi fosfoproteomica, acquisire i dati utilizzando un metodo di acquisizione dia-PASEF con un intervallo di massa per rampa compreso tra 400-1550 m/z e 0,6-1,50 1/K0 con un tempo di ciclo di 1,38 s.
5. Carica i file grezzi nel software di proteomica ed esegui l'estrazione, l'identificazione e la quantificazione del segnale utilizzando un flusso di lavoro di acquisizione indipendente dai dati senza libreria.
   1. Per le impostazioni di ricerca, utilizzare il database Homo sapiens , tipi di digest specifici con enzimi tripsina/P, 7 lunghezza minima del peptide, 52 lunghezza massima del peptide, due scissioni mancate, carbamidometilico alla cisteina come modifica fissa, azoto alla proteina acetilica N-termine, ossidazione alla metionina e fosforilazione alla serina, treonina e tirosina (per l'analisi fosfoproteomica) come modifiche variabili e 5 come modifiche variabili massime. Impostare l'FDR su PSM, peptide e gruppo proteico su 0,01.
      NOTA: In questo protocollo è stato utilizzato il software Spectronaut. Di uso comune vengono utilizzati anche altri software di ricerca dati DIA come DIA-NN e PEAKS. Se i dati sono stati acquisiti in modalità DDA, sono applicabili software come MaxQuant e Proteome Discoverer.

Results

Questo protocollo dimostra un flusso di lavoro completo, dall'isolamento delle vescicole extracellulari alle analisi di proteomica e fosfoproteomica a valle (Figura 1). I campioni di urina triplicati sono stati sottoposti a isolamento EV. Le vescicole extracellulari isolate sono state caratterizzate mediante western blotting e successivamente processate per la preparazione del campione di proteomica basata sulla spettrometria di massa, compresa l'estrazione delle proteine, la digestione enzi...

Discussion

L'isolamento efficace delle vescicole extracellulari è un prerequisito essenziale per rilevare proteine e fosfoproteine a bassa abbondanza nelle vescicole extracellulari. Nonostante lo sviluppo di numerosi metodi per soddisfare questa esigenza, la maggior parte soffre ancora di limitazioni come lo scarso recupero o la bassa riproducibilità, che ne impediscono l'utilizzo in studi su larga scala e contesti clinici di routine. Il DUC è generalmente considerato il metodo più comune per l'isolamento delle vescicole extracellu...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL	Life Science Products	M-1700C-LB
Rack separatore magnetico per provette da 1,5 mL	Sergi Lab Supplies	1005
Provetta per centrifuga conica da 15 mL	Corning
rack separatore magnetico per provette da 15 mL	Sergi Lab Supplies	1002
IgG anti-coniglio, tecnologia di segnalazione cellulare anticorpo legata a HRP		7074P2
Agitatore incubato da banco	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P)	Tecnologia di segnalazione cellulare	13403S
Cloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Utilizzato per l'alchilazione di gruppi solfuro ridotti. Preparare appena 400 mM in acqua come soluzione madre.
Acetato di etile	Fisher Scientific	E145-4	Precipitati detergenti
Evosep One	Sistema di cromatografia liquida	Evotips
Evosep		EV2013	Caricamento del campione per il sistema Evosep One
EVtrap	Tymora Analytical		Biglie magnetiche funzionalizzate, tampone di carico e tampone di lavaggio
Membrana Immobilon-FL PVDF Sigma	-Aldrich		IPFL00010 Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 a 12%, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini Protein Gel, tampone
per campioni NuPAGE LDS	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1,9	Bruker	1893473	Colonna di separazione
Cocktail di inibitori della fosfatasi 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, inibitore della fosfatasi.
Cocktail di inibitori della fosfatasi 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Inibitore della fosfatasi.
Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce	ThermoFisher	23225
Substrato per blotting occidentale Pierce ECL	Substrato HRP ThermoFisher	32106	nbsp;
Kit di arricchimento di fosfopeptidi PolyMAC	Tymora Analytical		Cattura di affinità di ioni metallici a base di polimeri (PolyMAC) per l'arricchimento di fosfopeptidi
Sodio desossicolato	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergente per tampone di lisi. Preparare 120 mM in acqua come soluzione madre.
Sodio lauroil sarcosinato	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergente per tampone di lisi. Preparare 120 mM in acqua come soluzione madre.
timsTOF HT	Bruker		Spettrometria di massa a tempo di volo a mobilità ionica intrappolata
TopTip C-18 (10-200 μ L) suggerimenti	Glygen	TT2C18.96	Metodo di desalinizzazione
Trietilammina	Sigma -Aldrich	471283-100ML	Per eluizione EV.
Tampone trietilammonio bicabonato	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Acido trifluoroacetico	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carbossietil)fosfina cloridrato	Sigma -Aldrich	C4706	Utilizzato per la riduzione dei legami disolfuro. Preparare 200 mM in acqua come soluzione madre. Aliquotare la soluzione madre in piccoli volumi e conservarla in at-20° C (evitare cicli multipli di gelo-scongelamento).
Tripsina/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007