Visualizzazione dei monocarbossilati e di altri metaboliti rilevanti nel cervello larvale ex vivo di Drosophila utilizzando sensori geneticamente codificati

Sommario

Qui presentiamo un protocollo per visualizzare il trasporto di monocarbossilati, glucosio e ATP nelle cellule gliali e nei neuroni utilizzando sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Förster geneticamente codificati in una preparazione cerebrale larvale di Drosophila ex-vivo .

Abstract

L'elevato fabbisogno energetico del cervello dovuto all'attività elettrica è una delle loro caratteristiche più distintive. Questi requisiti sono soddisfatti dalla produzione di ATP dal glucosio e dai suoi metaboliti, come i monocarbossilati lattato e piruvato. Non è ancora chiaro come questo processo sia regolato o chi siano gli attori chiave, in particolare in Drosophila.

Utilizzando sensori basati sul trasferimento di energia di risonanza Förster codificati geneticamente, presentiamo un metodo semplice per misurare il trasporto di monocarbossilati e glucosio nelle cellule gliali e nei neuroni in una preparazione cerebrale larvale di Drosophila ex-vivo . Il protocollo descrive come sezionare e far aderire un cervello larvale che esprime uno dei sensori su un vetrino coprioggetto.

Presentiamo i risultati di un intero esperimento in cui il trasporto del lattato è stato misurato nel cervello larvale abbattendo i trasportatori di monocarbossilati precedentemente identificati nelle cellule gliali. Inoltre, dimostriamo come aumentare rapidamente l'attività neuronale e monitorare i cambiamenti dei metaboliti nel cervello attivo. Il metodo descritto, che fornisce tutte le informazioni necessarie, può essere utilizzato per analizzare altri tessuti viventi di Drosophila .

Introduzione

Il cervello ha un elevato fabbisogno energetico a causa dell'elevato costo del ripristino dei gradienti ionici nei neuroni causati dalla generazione e dalla trasmissione del segnale elettrico neuronale, nonché dalla trasmissione sinaptica ^1,2. A lungo si è pensato che questa elevata richiesta di energia fosse soddisfatta dalla continua ossidazione del glucosio per produrre ATP³. Trasportatori specifici alla barriera emato-encefalica trasferiscono il glucosio nel sangue al cervello. Livelli glicemici costanti assicurano che il cervello riceva un apporto costante di glucosio

Protocollo

1. Mantenimento del ceppo di mosca e sincronizzazione larvale

1. Per eseguire questi esperimenti, utilizzare colture di moscerini allevate a 25 °C su un alimento standard a base di Drosophila composto dal 10% di lievito, dall'8% di glucosio, dal 5% di farina di frumento, dall'1,1% di agar, dallo 0,6% di acido propionico e dall'1,5% di metilparabene.
2. Per seguire questo protocollo, utilizzare le seguenti linee: w¹¹¹⁸ (background di controllo sperimentale), OK6-GAL4 (driver per motoneuroni), repo-GAL4 (driver per tutte le cellule gliali), CG-GAL4 (driver per corpi grassi), UAS-Pyronic (sensore di piruvato), U....

Risultati

Per un massimo di 1 ora, questa procedura consente di misurare facilmente i cambiamenti intracellulari nella fluorescenza dei sensori di monocarbossilato e glucosio. Come mostrato nella Figura 4, i sensori laconici sia nelle cellule gliali che nei motoneuroni rispondono a 1 mM di lattato a una velocità simile all'inizio dell'impulso, ma i motoneuroni raggiungono un aumento maggiore rispetto al basale durante l'impulso di 5 minuti, come precedentemente dimostrato¹⁷. Qu.......

Discussione

L'uso del modello Drosophila per lo studio del metabolismo cerebrale è relativamente nuovo²⁶ ed è stato dimostrato che condivide più caratteristiche con il metabolismo dei mammiferi di quanto ci si aspettasse, che è stato studiato principalmente in vitro in colture di neuroni primari o fette di cervello. La Drosophila eccelle negli esperimenti in vivo grazie alla batteria di strumenti genetici e sensori geneticamente codificati disponibili che consentono ai rice.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agarosio	Sigma	A9539
CaCl2	Sigma	C3881
CCD Camera ORCA-R2	Hamamatsu-Cell-R
Software	Olympus-CG-GAL4
	Bloomington Drosophila Stock Center	7011	Fat body driver
Dumont # 5 Pinze	Fine Science Tools	11252-30
Sistema di divisione a emissione DV2	Fotometria-Vetrini
coprioggetti (diametro 25 mm)	Marienfeld	111650	Germania
Glucosio	Sigma	G8270
GraphPad Prisma	GraphPad Versione software	8,0,2
HEPES	Sigma	H3375
ImageJ	National Institutes of Health	Versione 1,53t
KCl	Sigma	P9541
LUMPlanFl 40x/0.8 obiettivo ad immersione in acqua	Olympus-Methylparaben
	Sigma	H5501
MgCl2	Sigma	M1028
NaCl	Sigma	S7653
OK6-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center		Driver per motoneuroni
Picrotossina	Sigma	P1675S	ATTENZIONE-Fatale se ingerito
Poli-L-lisina	Sigma	P4707
Acido propionico	Sigma	P1386
Repo-GAL4	Bloomington Drosophila Stock Center	7415	Driver per cellule gliali (tutti)
Lattato di sodio	Sigma	71718
Piruvato di sodio	Sigma	P2256
Microscopio a fluorescenza a disco rotante BX61WI	Olympus-Saccarosio
	Sigma	S0389
Trealosio	US Biological	T8270
UAS-AT1.03NL	Kyoto Drosophila Stock Center	117012	sensore ATP
UAS-Chk RNAi GD1829	Vienna Drosophila Resource Center	v37139	Chk RNAi linea
UAS-FLII12Pglu700md6	Bloomington Drosophila Stock Center	93452	Sensore di glucosio
UAS-GCaMP6f	Bloomington Drosophila Stock Center	42747	Sensore di calcio
UAS-Laconic	Sierralta	Lab-Sensore	di lattato
UAS-Pyronic	Pierre Yves Placais/Thomas Preat-CNRS-Paris
UMPlanFl 20x/0.5 obiettivo ad immersione in acqua	Olympus	-