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Research Article
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Qui, presentiamo un modello di ratto con lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI) a testa chiusa e la sua convalida che mostra una notevole somiglianza con l'mTBI umano per quanto riguarda le manifestazioni comportamentali durante le fasi acute e subacute.
I modelli animali sono fondamentali per far progredire la nostra comprensione delle lesioni cerebrali traumatiche lievi (mTBI) e guidare la ricerca clinica. Per ottenere informazioni significative, è essenziale sviluppare un modello animale stabile e riproducibile. In questo studio, riportiamo una descrizione dettagliata di un modello di mTBI a testa chiusa e un metodo di validazione rappresentativo che utilizza ratti Sprague-Dawley per verificare l'effetto di modellazione. Il modello prevede la caduta di un peso di 550 g da un'altezza di 100 cm direttamente sulla testa di un ratto su una superficie distruttibile, seguita da una rotazione di 180 gradi. Per valutare la lesione, i ratti sono stati sottoposti a una serie di valutazioni neurocomportamentali 10 minuti dopo l'infortunio, tra cui il tempo di perdita di coscienza, il tempo di primo comportamento di ricerca, la capacità di fuga e il test di capacità di equilibrio del raggio. Durante le fasi acute e subacute successive all'infortunio, sono stati condotti test comportamentali per valutare la capacità di coordinazione motoria (Beam task), l'ansia (Open Field test) e le capacità di apprendimento e memoria (Morris Water Maze test). Il modello mTBI a testa chiusa ha prodotto una risposta coerente alle lesioni con una mortalità minima e ha replicato situazioni di vita reale. Il metodo di convalida ha verificato efficacemente lo sviluppo del modello e ha garantito la stabilità e la coerenza del modello.
La lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI), o commozione cerebrale, è il tipo più diffuso di lesione e può portare a vari sintomi a breve termine e cronici1. Questi sintomi possono includere vertigini, mal di testa, depressione e anedonia, tra gli altri, portando a una sofferenza significativa per le persone affette da mTBI2. Poiché la maggior parte degli mTBI sono causati da traumi da corpo contundente3, diventa imperativo sviluppare modelli animali che imitino accuratamente tali lesioni. Questi modelli sono essenziali per ottenere una migliore comprensione della lesione e dei suoi meccanismi sottostanti, offrendo un ambiente controllato con variabilità ed eterogeneità ridotte rispetto agli studi sull'uomo.
Sono stati sviluppati numerosi modelli di roditori ben consolidati per le lesioni cerebrali traumatiche (TBI), tra cui la lesione da percussione fluida (FPI)4, l'impatto corticale controllato (CCI)5, la lesione da caduta di peso6, la lesione cerebrale traumatica da esplosione7 e altre. Tuttavia, questi modelli si concentrano principalmente sulla replica di scenari di trauma cranico da moderato a grave. Al contrario, i modelli sperimentali specificamente progettati per simulare l'mTBI hanno ricevuto relativamente meno attenzione e rimangono poco esplorati8. Pertanto, c'è un bisogno critico di stabilire un modello animale stabile e riproducibile che rappresenti accuratamente l'mTBI. Un tale modello migliorerebbe significativamente la nostra comprensione delle conseguenze neurobiologiche e comportamentali associate all'mTBI.
Non è possibile distinguere i deficit funzionali nei ratti con mTBI rispetto ai ratti normali attraverso l'osservazione casuale dopo che gli effetti dell'anestesia sono svaniti. Pertanto, è necessario somministrare test specifici. Nell'uomo, un'ampia gamma di valutazioni cliniche viene utilizzata per valutare i pazienti 9,10,11. Allo stesso modo, la creazione di un modello di successo nel modello di ratto richiede anche l'utilizzo di strumenti di valutazione rapida per determinarne la validità.
In questo studio, presentiamo un modello di ratto mTBI a testa chiusa, che consente di studiare l'mTBI in un modo che assomiglia molto alla condizione umana. La descrizione dettagliata del modello e della sua procedura di validazione fornisce una comprensione completa dell'approccio sperimentale utilizzato nello studio dell'mTBI.
Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali della Central South University. Tutti gli studi sono stati condotti in linea con il benessere e i principi etici degli animali da laboratorio.
1. Alimentazione degli animali e procedura di anestesia
2. Configurazione preoperatoria
3. Induzione mTBI
4. Induzione fittizia
5. Procedura di validazione: valutazioni neurocomportamentali acute
NOTA: Le seguenti valutazioni sono state modificate in base ai punteggi di gravità neurologica9 e al protocollo di Flierl et al.10. Tutte queste valutazioni sono state eseguite 10 minuti dopo che il ratto aveva recuperato il riflesso di raddrizzamento.
6. Procedura di validazione: valutazione del neurocomportamento
NOTA: Prima degli esperimenti comportamentali, i ratti sono stati manipolati per 2 minuti al giorno per 3 giorni consecutivi per ridurre al minimo lo stress e l'interruzione della novità. Tutti gli esperimenti comportamentali sono stati eseguiti ponendo gli animali nell'ambiente di prova per 60 minuti prima dell'inizio dell'esperimento.
L'apparecchio utilizzato in questo lavoro era una versione modificata del modello Kane e del modello pediatrico11,12 di Richelle Mychasiuk. In questo studio, i ratti SD sono stati assegnati a gruppi sham e mTBI. Per dimostrare la riproducibilità di questo modello, abbiamo condotto tre repliche indipendenti di questo modello insieme alla valutazione neurocomportamentale acuta, con ogni esperimento che ha coinvolto 8-12 ratti. In questo studio, abbiamo utilizzato più di 30 ratti con mTBI, con 2 ratti che hanno sperimentato la mortalità a causa dell'anestesia. Tuttavia, nessun ratto ha ceduto a lesioni cerebrali durante l'esperimento. I risultati di questi esperimenti sono presentati nella Figura 2. Inoltre, le valutazioni neurocomportamentali sono state effettuate durante le fasi acute e subacute (Figura 3, Figura 4 e Figura 5).
Risultati della valutazione neurocomportamentale acuta
Tutte queste valutazioni sono state eseguite dopo anestesia/impatto 0 min (tempo di perdita di coscienza e tempo di primo comportamento di ricerca) o 10 min (uscita dal cerchio e bilanciamento del raggio), rispettivamente.
Come mostrato nella Figura 2A, i ratti con mTBI hanno trascorso molto più tempo a riprendersi dallo stato di incoscienza, il che è in linea con i risultati ottenuti in studi precedenti12,13. Il comportamento di ricerca nei ratti, considerato un'attività fisiologica normale, ha mostrato un aumento statisticamente significativo del periodo di recupero all'interno del gruppo mTBI (Figura 2B). Questa scoperta suggerisce che i ratti mTBI hanno richiesto una durata più lunga per riacquistare le loro capacità di locomozione, olfatto, sondaggio tattile e scansione ambientale.
Il test circolatorio esistente ha sostituito i test sensoriali originali nel punteggio di gravità neurologica, che in precedenza si basava sulle osservazioni soggettive degli esaminatori come i test di posizionamento e propriocettivi. I ratti con mTBI hanno trascorso un tempo significativamente più lungo uscendo dal cerchio rispetto ai ratti fittizi (Figura 2C). L'analisi statistica utilizzando un'ANOVA bidirezionale per il tempo di uscita dal cerchio ha mostrato un effetto principale significativo della lesione (F [1, 36] = 21,29, p < 0,0001), indicando una differenza tra i gruppi mTBI e sham. Tuttavia, diversi studi non hanno avuto alcun effetto significativo (F [2, 36] = 0,1396, p = 0,87).
I risultati del test di bilanciamento del fascio sono stati analizzati utilizzando un'ANOVA a due vie, seguita da confronti multipli di Bonferroni per le differenze tra le medie di gruppo (Figura 2D). C'è stato un effetto complessivo significativo della lesione in tutte le attività a fascio largo (3 cm: F = 13,89, p < 0,001; 2 cm: F = 42,7, p < 0,001; 1,5 cm: F = 27,25, p < 0,001), indicando che i ratti mTBI hanno mostrato una compromissione dell'equilibrio rispetto ai ratti fittizi dopo 10 minuti dall'impatto. Secondo tre ripetuti esperimenti indipendenti, il fascio di bilanciamento largo 2 cm e 1,5 cm ha mostrato una migliore discriminazione tra i gruppi sham e mTBI rispetto al fascio largo 3 cm.
Risultati della valutazione neurocomportamentale
La capacità di coordinazione motoria è stata valutata utilizzando il compito del fascio a 1 giorno prima dell'anestesia/lesione e 1 giorno, 3 giorni e 7 giorni dopo l'anestesia/lesione (Figura 3). Il numero totale di scivolamenti degli arti posteriori (Figura 3A) è stato analizzato mediante ANOVA bidirezionale misurata ripetuta e i confronti multipli di Bonferroni hanno rilevato che i ratti con mTBI mostravano un numero significativamente maggiore di scivolamenti degli arti posteriori al giorno 1 dopo l'infortunio rispetto ai ratti fittizi (Figura 3A; p < 0,01). Tuttavia, dopo un recupero di 2 giorni, non sono state osservate alterazioni negli errori posteriori, con un numero totale di errori che si è risolto a livelli fittizi dopo 7 giorni. In particolare, tutti e 6 i ratti con mTBI hanno avuto più scivolamenti degli arti posteriori post-impatto rispetto alle loro prestazioni di base. Il leggero aumento degli slittamenti degli arti posteriori nei ratti finti potrebbe essere associato alla mancanza di pratica del raggio di equilibrio. A 1 giorno e 3 giorni dopo l'infortunio, i ratti con mTBI hanno trascorso più tempo a percorrere il fascio di 150 cm (39,8 s ± 3,79 s contro 28,68 s ± 0,82 s, 37,06 s ± 4,06 s contro 29,28 s ± 3,42 s), anche se non ci sono state differenze tra ratti mTBI e ratti sham nel tempo impiegato per attraversare il fascio in tutti i punti temporali (Figura 3B).
Non ci sono state differenze significative nella distanza percorsa tra i gruppi sham e mTBI (Figura 4A). Il comportamento ansioso è stato valutato misurando il tempo trascorso nella zona centrale durante il test in campo aperto. Sia a 3 giorni che a 7 giorni dopo l'infortunio, i ratti con mTBI hanno mostrato una significativa riduzione del tempo trascorso nella zona centrale rispetto ai ratti fittizi. Questo risultato indica che i ratti mTBI hanno mostrato livelli più elevati di comportamento ansioso dopo l'impatto entro 7 giorni (Figura 4B,C).
I risultati dei giorni di apprendimento del labirinto d'acqua di Morris hanno rivelato che i ratti mTBI hanno richiesto più tempo per localizzare la piattaforma nascosta rispetto ai ratti fittizi, indicando un apprendimento spaziale e una memoria compromessi nel gruppo mTBI (Figura 5). Successivamente, durante la prova della sonda, i ratti mTBI hanno mostrato deficit nel trattenere la memoria spaziale, come evidenziato dal fatto che hanno trascorso meno tempo a cercare la piattaforma rimossa. In particolare, non è stata osservata alcuna differenza significativa nella velocità di nuoto tra i gruppi sham e mTBI, supportando i risultati coerenti osservati nell'analisi della distanza percorsa condotta nel test in campo aperto. Questi risultati suggeriscono che l'impatto non ha avuto un effetto percepibile sulla funzione locomotoria spontanea.
Figura 1: Apparato d'urto per mTBI nei ratti. (A) La vista dall'alto e la vista laterale del cuscino e dell'elmetto nella posizione relativa della testa del ratto. La linea rossa tratteggiata mostra la posizione del casco. (B) Un'immagine dell'intero gruppo che mostra un tubo guida verticale per il peso caduto posizionato sopra lo stadio di ratto e la spugna di raccolta. (C) Un fermo immagine catturato da un video di impatto che mostra la rotazione di 180° del ratto in seguito all'impatto con la testa e la successiva accelerazione/rotazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Risultati della valutazione neurocomportamentale acuta a seguito di ratti sham, mTBI, ripetuti tre volte in modo indipendente. (A) Significativamente aumentato il tempo di perdita di coscienza dopo l'interruzione dell'anestesia nei ratti che hanno ricevuto un mTBI rispetto ai ratti fittizi. C'è stato un effetto di gruppo significativo (P < 0,0001, ANOVA bidirezionale) ma nessun effetto significativo di tempo (P = 0,6226) o un'interazione di gruppo x tempo (P = 0,5803). (B) I ratti con mTBI hanno mostrato il loro primo comportamento di ricerca dopo l'anestesia. (C) I ratti fittizi hanno impiegato meno tempo a sfuggire al cerchio di 60 cm (*p < 0,01, **p < 0,001, t-test spaiato). (D) Le prestazioni nel punteggio di bilanciamento del fascio di 3 cm, 2 cm e 1,5 cm di larghezza. I risultati dei confronti multipli di Bonferroni per ciascun gruppo sono riportati nelle figure. Dati presentati come media ± errore standard della media. N = 8-12 ratti sono stati utilizzati per esperimento. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Le prestazioni dell'attività della trave prima dell'impatto e dopo l'impatto il giorno 1, il giorno 3 e il giorno 7. (A) I ratti mTBI hanno effettuato più scivolamenti degli arti posteriori al giorno 1 post-infortunio (*p < 0,001, ANOVA a 2 vie misurata ripetutamente). (B) Il tempo medio di attraversamento dei ratti fittizi è inferiore a quello dei ratti con mTBI. Dati presentati come media ± errore standard della media (N = 6/gruppo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Le prestazioni del test in campo aperto nel giorno 1 e nel giorno 1, nel giorno 3, nel giorno 7 e nel giorno 14 prima dell'infortunio. (A) Non c'era differenza tra ratti fittizi e mTBI nella distanza percorsa. (B) i ratti con mTBI hanno trascorso meno tempo al centro rispetto ai ratti fittizi al giorno 3 e al giorno 7 (*p < 0,01, **p < 0,001, ANOVA a 2 vie misurata ripetutamente), senza differenze apparenti al giorno 1 pre-infortunio e al giorno 1 e al giorno 14 post-infortunio. (C) Traccia la mappa dei ratti con mTBI nel giorno 1, nel giorno 3, nel giorno 7 e nel giorno 14 dopo mTBI. Dati presentati come media ± errore standard della media (N = 6-10/gruppo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Le prestazioni nel labirinto d'acqua di Morris. (A) Non c'era alcuna differenza di velocità nel test di abilità di nuoto tra i ratti sham e mTBI. (B) Latenza alla piattaforma nascosta dell'attività di memoria di riferimento il giorno della prova. (C) I ratti hanno attraversato la piattaforma più volte nella prova di prova della sonda di 2 minuti dopo 5 giorni di prova. Sham (5,14 ± 0,65) vs. mTBI (3,56 ± 0,6), (*p < 0,01, t-test spaiato). Dati presentati come media ± errore standard della media (N = 9/gruppo). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Gli autori non hanno alcun interesse finanziario da divulgare.
Qui, presentiamo un modello di ratto con lesione cerebrale traumatica lieve (mTBI) a testa chiusa e la sua convalida che mostra una notevole somiglianza con l'mTBI umano per quanto riguarda le manifestazioni comportamentali durante le fasi acute e subacute.
Vogliamo ringraziare tutti i borsisti del Dipartimento di Animali da Laboratorio della Central South University. Questo studio è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (n. 81971791); Laboratorio Chiave di Medicina Legale di Shanghai, Laboratorio Chiave di Scienze Forensi, Ministero della Giustizia, Cina (Accademia di Scienze Forensi) (No. KF202104).
| Scatola in acrilico | In-house | N/A | 15 cm x 22 cm x 43 cm |
| Macchina per anestesia | RWD Life Science Co. | R540 Mouse & Casco per macchina per anestesia | animale per ratti |
| Disco | in | acciaio inossidabile di 10 mm di diametro e 3 mm di spessore | |
| Labirinto d'acqua Morris | RWD Life Science Co. | Diametro 150 cm, altezza 50 cm, diametro piattaforma 35 cm | |
| Campo aperto | RWD Life Science Co. | 63007 | Larghezza100 cm, altezza 40 cm |
| Panlab SMART V3.0 | RWD Life Science Co. | SMART v3.0 | |
| Peso perforato | N/A | interno | Peso di 550 g e diametro di 18 mm |
| Cuscino | N/A | interno | Spugna a forma di cuneo da posizionare sotto la testa del ratto |
