Microscopia a due fotoni per lo studio dei tendini

Sommario

Questo articolo descrive il processo di preparazione, impostazione e imaging dei tendini utilizzando la microscopia multifotone. Inoltre, copre l'applicazione di SHG per l'analisi dell'allineamento delle fibrille di collagene e la creazione di una rappresentazione 3D dei tendini. Questa metodologia si rivela molto preziosa nella caratterizzazione delle cellule tendinee e della loro ECM durante la lesione e lo sviluppo.

Abstract

La microscopia a due fotoni è emersa come un potente strumento per valutare le cellule dei tessuti profondi e caratterizzare l'allineamento della matrice extracellulare (ECM) in vari sistemi biologici. Questa tecnica si basa su interazioni luce-materia non lineari per rilevare due segnali distinti: il segnale di diffusione generato dalla seconda armonica (SHG), che facilita la visualizzazione delle fibre di collagene e il loro orientamento, e il segnale di eccitazione nel vicino infrarosso per l'imaging dell'autofluorescenza eccitata dai raggi ultravioletti.

L'imaging SHG si dimostra particolarmente efficace nella visualizzazione delle fibre di collagene grazie alla struttura cristallina non centrosimmetrica del collagene fibrillare I. Dato che i tendini sono tessuti ricchi di matrice con un numero limitato di cellule, il loro alto contenuto di collagene li rende candidati ideali per l'analisi mediante microscopia a due fotoni. Di conseguenza, la microscopia a due fotoni offre un mezzo prezioso per analizzare e caratterizzare le anomalie del collagene nei tendini. La sua applicazione si estende allo studio dello sviluppo dei tendini, delle lesioni, della guarigione e dell'invecchiamento, consentendo la caratterizzazione completa delle cellule tendinee e delle loro interazioni con la MEC in varie condizioni utilizzando strumenti di microscopia a due fotoni. Questo protocollo delinea l'uso della microscopia a due fotoni nella biologia dei tendini e presenta una metodologia adattata per ottenere un imaging e una caratterizzazione efficaci delle cellule tendinee durante lo sviluppo e dopo la lesione. Il metodo consente l'utilizzo di sottili sezioni microscopiche per creare un'immagine completa della ECM all'interno dei tendini e delle cellule che interagiscono con questa matrice. In particolare, l'articolo mostra una tecnica per generare immagini 3D utilizzando la microscopia a due fotoni in modelli animali.

Introduzione

Per funzionare correttamente e trasmettere la forza dal muscolo all'osso¹, i tendini si basano sui legami intermolecolari e intramolecolari tra le fibre di collagene. L'intricato autoassemblaggio, la reticolazione e l'allineamento delle fibre di collagene provocano la creazione di una matrice altamente organizzata che contribuisce alla resistenza biomeccanica e alla flessibilità del tessuto tendineo ^2,3,4. Sebbene anche altre proteine della MEC contribuiscano alla stabilità della rete fibrillare nei tendini⁵, la massa secca del tendine è composta per circa l'86% da collagene⁶, con il collagene I che costituisce fino al 96% del contenuto totale di collagene ^7,8. Questo in definitiva rende la struttura del collagene un output chiave per la normale salute e funzione dei tendini.

Alcune modalità di imaging clinico utilizzate per i tendini sono la risonanza magnetica e/o l'ecografia. Sebbene la tecnologia a ultrasuoni fornisca immagini della struttura fascicolare del tendine e riveli parte della struttura fibrillare nel tessuto⁹, la risoluzione non è ideale per la quantificazione. La risonanza magnetica ha una risoluzione spaziale migliore rispetto all'ecografia, ma è ancora limitata. Tuttavia, questi metodi sono anche limitati nella loro potenziale profondità di imaging attraverso un tessuto. Su scala più micrometrica, la diffusione della luce a piccolo e grandangolo e la microscopia confocale possono essere utilizzate per valutare la struttura delle fibrille di collagene e qualsiasi potenziale anomalia.

Al contrario, la microscopia a generazione di seconda armonica (SHG) differisce da altri metodi di imaging in quanto può catturare il guscio esterno delle fibrille di collagene. Le fibrille di collagene I nei tendini sono organizzate in modo parallelo uniassiale attraverso l'ECM tendineo e sono di natura non centrosimmetrica ^4,10. Queste proprietà possono essere sfruttate per l'imaging utilizzando un microscopio multifotone, che può produrre immagini nitide fino a 2-3 volte più profonde rispetto all'imaging confocale¹¹. Questo ci permette anche di generare sezioni ottiche del tendine di migliore qualità. Quando la luce viene proiettata nel campione di interesse, viene prodotto un segnale SHG e questa dispersione della luce può essere catturata. Nei tendini, questo produce un'immagine della struttura e dell'allineamento del collagene, permettendoci così di valutare le potenziali conseguenze morfologiche e patologiche di tendinopatie, lesioni, ecc.

Poiché il collagene costituisce la maggior parte della massa secca del tendine e contribuisce alla funzione tendinea ^6,12, l'interruzione della struttura del collagene può influenzare le proprietà biomeccaniche dei tendini. Pertanto, l'analisi della sua struttura può aiutarci a comprendere meglio l'impatto e la gravità delle lesioni, oltre a creare una metrica per l'efficacia della guarigione. Questo articolo esamina un metodo che utilizza la microscopia multifotone e SHG per analizzare come lo sviluppo e le lesioni influenzano la struttura e l'allineamento delle fibrille di collagene I e per generare immagini 3D della ECM tendinea in modelli animali. Pertanto, il nostro metodo per l'imaging dei tendini può aiutare i ricercatori a caratterizzare le cellule tendinee e la MEC durante lo sviluppo o dopo una lesione.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità con l'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Protocollo #2013N0000062) e le linee guida AAALAC presso il Massachusetts General Hospital. Per il presente studio sono stati utilizzati BHLHE40 topi femmina knockout nulli o eterozigoti in un background Scx-GFP, dell'età di 30 giorni. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione e fissazione dei tessuti

1. Per preparare il tessuto, sopprimere i topi in una camera di CO₂ (seguendo protocolli approvati istituzionalmente) seguita da lussazione cervicale.
2. Per ridurre la quantità di pelo che può attaccarsi al campione di tessuto, spruzzare il topo con il 70% di EtOH fino a quando il pelo non è saturo. Spellare gli arti posteriori e poi, usando le forbici, rimuovere i due arti posteriori tagliando l'articolazione dell'anca.
3. Posizionare i due arti posteriori in un flaconcino di scintillazione da 20 ml e immergerli in PFA al 4% in modo che il flaconcino sia pieno. Posizionare i flaconcini a 4 °C agitando per una notte.
4. Lavare gli arti posteriori in 1x PBS a temperatura ambiente (RT) agitando per 10 minuti e ripetere per un totale di 3 volte. Immergere gli arti posteriori in EDTA 0,5 M (pH 8,0) a 4 °C agitando per un massimo di 2 settimane, sostituendo con EDTA fresco ogni 2-3 giorni.
5. Lavare gli arti posteriori in 1x PBS a RT con agitazione per 10 minuti, ripetendo i lavaggi per un totale di 3 volte.
6. Immergere gli arti in 1x PBS fresco e conservare a 4 °C fino a quando non vengono utilizzati per l'imaging.

2. Dissezione del tendine e preparazione del tessuto per l'imaging

1. Tenendo il piede con una pinza, far scorrere un'estremità della lama delle forbici a molla (vedi Tabella dei materiali) sotto il tendine d'Achille e assicurarsi di tagliare il più vicino possibile alla giunzione miotendinea.
2. Tenere l'estremità miotendinea recisa del tendine con una pinza e utilizzare le forbici a molla per tagliare il tendine il più vicino possibile all'osso.
   NOTA: Se necessario, utilizzare una pinza per tenere il tendine d'Achille lontano dal resto dell'arto posteriore durante il primo taglio. Assicurarsi di non schiacciare o danneggiare il tessuto, poiché ciò influenzerà l'allineamento del collagene durante l'imaging.
3. Per permeabilizzare e avere una controcolorazione nucleare, immergere il tendine sezionato in PBT (1% Triton-X in PBS) con 0,1% di Draq5 (concentrazione madre, 5 mM, vedi Tabella dei materiali). Posizionare il tendine in una provetta da microcentrifuga da 2 mL e aggiungere 1 uL di Draq5 a 1 mL di PBT. Incubare per una notte a RT su un bilanciere. Poiché Draq5 è sensibile alla luce, coprire le provette per microcentrifuga con un foglio di alluminio e proteggere i campioni dalla luce.
4. Prima dell'imaging, rimuovere la soluzione Draq5 e sostituirla con dPBS. Assicurarsi di continuare a proteggere il campione dalla luce.
   ATTENZIONE: Draq5 ha una tossicità di categoria tre ed è considerato pericoloso dallo standard OSHA per la comunicazione dei pericoli. Evitare il contatto e smaltirlo in un contenitore per rifiuti etichettato.
5. Utilizzando un punzone per biopsia con un diametro interno di 6 mm, ritagliare un pezzo di schiuma gel (vedi Tabella dei materiali) e posizionarlo in una piccola piastra di Petri da 60 x 15 mm. Aggiungere ddH₂O al piatto per consentire alla schiuma di gel di espandersi.
6. Posizionare il tendine d'Achille sezionato su schiuma di gel. Utilizzando un vetrino coprioggetti incollato a una rondella, posizionare con cura la rondella sul tendine fino a quando il vetrino coprioggetti non entra in contatto con il tessuto. Per evitare problemi durante l'imaging, assicurarsi che non vi siano bolle d'aria tra il campione e il vetrino coprioggetti. Se necessario, aggiungere altro ddH₂O al piatto per coprire il campione e la lavatrice con il vetrino coprioggetti.

3. Imaging con un microscopio multifotone

1. Utilizzando un microscopio laser multifotone FVMPE-RS, un obiettivo 25x che può essere immerso in acqua, un laser pulsato IR HPDS-O e un laser pulsato IR (vedere la tabella dei materiali), individuare il campione e la regione di interesse che verranno ripresi utilizzando il percorso della luce EPI. Una volta individuato il campione, posizionare la telecamera sull'estremità miotendinea o entesale del tendine d'Achille.
2. Cambia il percorso della luce su LSH, regola l'impostazione del laser IR di Laser 2 su 840 nm e allinea attivamente. Regolare l'intensità HV per essere in grado di vedere il tessuto e il segnale SHG, senza superare il 20%. Non regolare il guadagno e mantenere l'offset uguale a 0.
3. Quindi, configura i parametri z-stack per acquisire le immagini di esempio. Utilizzare una dimensione di scansione 1024 x 1024 e impostare la dimensione del passo su 0,4 micron. Gli Z-stack sono, in media, circa 150 fette e partono dalla guaina esterna e si spostano verso il centro del tendine fino a quando il segnale SHG non è più chiaro, producendo sezioni ottiche sagittali¹³.
4. Regolare la potenza del laser sulla modalità Z luminosa per consentire la standardizzazione del rilevamento del segnale. Una volta stabiliti i parametri di avvio/arresto Z-stack, impostare l'intensità del laser da 4 all'inizio dell'imaging e 6 alla fine dell'imaging. Questo aiuta a mantenere la coerenza nella segnalazione SHG mentre l'endoscopio immagini più in profondità nel tessuto.
5. Una volta generati gli z-stack, elaborateli ulteriormente in ImageJ/FIJI per creare un filmato delle sezioni ottiche con orientamento trasversale. A tale scopo, aprire il software ImageJ/FIJI¹⁴ e fare clic su Image > Stacks > Reslice. Questo ci permetterà di avere una visione trasversale del tendine d'Achille, rivelando la morfologia stellata dei tenociti e il loro orientamento nella matrice di collagene.

Risultati

Questo protocollo è utile per caratterizzare le cellule tendinee e la loro matrice extracellulare (ECM) dopo una lesione, durante lo sviluppo o in una condizione mutante. Con un'attenta dissezione e preparazione del campione, i video z-stack possono essere generati attraverso il tessuto in orientamento sagittale (Video 1 e Video 2). Utilizzando ImageJ/FIJI per elaborare e sezionare le immagini, viene creata una vista trasversale del tendine d'Achille (Video 3 e Video 4). Questo rivela la morfologia stellata dei tenociti e ci permette di osservare la loro architettura unica all'interno della densa matrice di collagene.

Utilizzando la microscopia multifotone e sfruttando le proprietà cristalline non centrosimmetriche del collagene fibrillare I, sono state generate immagini in sezione ottica ad alta risoluzione che catturano sia le cellule tendinee che la loro matrice. Queste sezioni ottiche sono isolate dagli z-stack sia per il BHLHE40 +/-; Scx-GFP e BHLHE40 -/-; Topi Scx-GFP (Figura 1A, B, rispettivamente). Le sezioni sono prese dallo z-stack sagittale originale creato dall'imaging 2-P e dallo z-stack ri-affettato generato utilizzando ImageJ/FIJI. Oltre a questo, possiamo anche utilizzare questo metodo di imaging per analizzare eventuali differenze potenziali nell'organizzazione del collagene, nella morfologia cellulare, ecc., tra i due topi.

Figura 1: Sezione ottica del BHLHE40 +/-; Scx-GFP e BHLHE40 -/-; Tendine di topo Scx-GFP. Z-stack è stato catturato utilizzando un microscopio multifotone. (A) Le sezioni ottiche acquisite dallo Z-stack mostrano il segnale SHG e le celle GFP+/Draq5+ in un BHLHE40 +/-; Scx-GFP (P30, femmina, 14,68 g) e (B) BHLHE40 -/-; Scx-GFP (P30, femmina, 12,16 g). Le sezioni sagittali hanno il segnale SHG incluso mentre le sezioni trasversali no. I campioni sono stati controcolorati con Draq5. L'SHG cattura la matrice di collagene nel tessuto. Barra della scala = 10 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Video 1: video Z-stack della vista sagittale di BHLHE40 +/-; Tendine di topo Scx-GFP. Z-stack è stato catturato utilizzando un microscopio a due fotoni. Il video mostra la vista sagittale del tendine d'Achille. I campioni sono stati controcolorati con Draq5. L'SHG cattura la matrice di collagene nel tessuto. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 2: video Z-stack della vista sagittale di BHLHE40 -/-; Scx-GFP tendine d'Achille del topo. Z-stack è stato catturato utilizzando un microscopio a due fotoni. Il video mostra la vista sagittale del tendine d'Achille in un topo BHLHE40 KO null. I campioni sono stati controcolorati con Draq5. L'SHG cattura la matrice di collagene nel tessuto. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 3: video Z-stack della vista trasversale di BHLHE40 +/-; Tendine di topo Scx-GFP. Z-stack è stato catturato utilizzando un microscopio a due fotoni. Il video mostra la vista trasversale del tendine d'Achille. I campioni sono stati controcolorati con Draq5. L'SHG cattura la matrice di collagene nel tessuto. Clicca qui per scaricare questo video.

Video 4: Video Z-stack della vista trasversale di BHLHE40 -/-; Scx-GFP tendine d'Achille del topo. Z-stack è stato catturato utilizzando un microscopio a due fotoni. Il video mostra la vista trasversale del tendine d'Achille in un topo BHLHE40 KO nullo. I campioni sono stati controcolorati con Draq5. L'SHG cattura la matrice di collagene nel tessuto. Clicca qui per scaricare questo video.

Discussione

Questo articolo presenta un metodo per preparare, sezionare e visualizzare il tendine d'Achille del topo, utilizzando le proprietà cristalline non centrosimmetriche della ECM tendinea. Le fasi chiave della preparazione dei tessuti riguardano la permeabilizzazione delle controcolorazioni e il corretto posizionamento dei tessuti in una capsula di Petri durante l'imaging. Al posto di Draq5, Hoechst 33258 può essere utilizzato con una diluizione 1:100.000¹³, ma Draq5 è preferito per la sua elevata permeabilità, fotostabilità e fotosbiancamento minimo. Il corretto posizionamento dei tessuti è fondamentale per evitare bolle tra il vetrino coprioggetti e il tendine, poiché un orientamento errato può influire sulle immagini risultanti.

Rispetto ad altri metodi di microscopia, la microscopia a generazione di seconda armonica (SHG) consente la cattura di fibrille di collagene e cellule tendinee all'interno della matrice¹⁰. In combinazione con le controcolorazioni, questi dati consentono l'analisi di come lo sviluppo, le lesioni o le mutazioni influenzano la struttura tendinea. La generazione di immagini 3D dell'ECM tendinea consente l'osservazione delle sezioni ottiche mentre passano attraverso il tendine. Sebbene la tecnologia multifotone fornisca una penetrazione tissutale superiore, presenta ancora limitazioni nell'imaging attraverso l'intero tendine d'Achille, richiedendo tecniche aggiuntive come il sezionamento. Tuttavia, questo metodo consente la produzione di circa 150 sezioni ottiche da 0,4 micron con chiarezza, evitando la perturbazione dei tessuti attraverso il sezionamento.

In sintesi, questo metodo offre preziose informazioni sulla caratterizzazione dello sviluppo tendineo, delle lesioni, della guarigione e dell'invecchiamento, mediante l'imaging delle cellule tendinee e della MEC utilizzando la microscopia multifotone. L'utilizzo dell'imaging multifotone per le sezioni ottiche e dei video z-stack in tutto il tessuto fornisce una migliore comprensione dei cambiamenti nella morfologia del tendine in condizioni sperimentali.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,5 M EDTA pH 8,0	Invitrogen	AM9262
Provette per microcentrifuga da 2 mL	USA Scientific	1620-2700
Fiala di scintillazione da 20 mL	Sigma-Aldrich	Z190527-1PAK
4% Paraformaldeide	Microscopia elettronica	Scienze 50-980-487	Utilizzare l'ampuola di PFA per creare una soluzione di PFA al 4%
Strumento di punzonatura per biopsia da 6 mm	Ted Pella Inc.	15111-60
			Petri da 60 x 15 mm
BHLHE40 topi knockout nulli o eterozigoti su sfondo Scx-GFP	Il Jackson Laboratory	JAX ID #029732	MGI ID #3717419
Vetrini coprioggetti	Fisher	12-544-F	Può utilizzare qualsiasi vetrino coprioggetti che copre l'area della rondella M20
dPBS	Gibco	14190144
Draq5	ABCAM	ab108410
Forbici fini 21 mm tagliente	Fine Science Tools	14060-10
FVMPE-RS laser multifotone microscopio a scansione	Olympus
Gelfoam Spugna sterile Misura 50	Pfizer	00009-0323-01
INSIGHT X3-OL Laser pulsato IR	Olympus
MaiTai HPDS-O Laser pulsato IR	Olympus
(1x)	Invitrogen	AM9625	Diluire 10x PBS in acqua milli-Q per ottenere 1x
soluzione Rondella piatta M20 in acciaio inossidabile	McMaster-Carr
Triton X-100	MP Biomedicals	807426	Diluire Triton X-100 in dPBS per ottenere una soluzione all'1%
Forbici a molla Vannas tagliente da 4 mm	Fine Science Tools	15018-10
XLPlan N 25X WMP Lens