Questo protocollo descrive il modello di ischemia cerebrale focale transitoria nei topi attraverso l'occlusione intraluminale dell'arteria cerebrale media. Inoltre, vengono mostrati esempi di valutazione dei risultati utilizzando la risonanza magnetica per immagini e test comportamentali.
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Articolo metodologico
Modello transitorio di occlusione dell'arteria cerebrale media dell'ictus
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'ictus è una delle principali cause di morte o disabilità cronica a livello globale. Tuttavia, i trattamenti ottimali esistenti sono limitati alle terapie di riperfusione durante la fase acuta dell'ictus ischemico. Per ottenere informazioni sulla fisiopatologia dell'ictus e sviluppare approcci terapeutici innovativi, i modelli di ictus in vivo dei roditori svolgono un ruolo fondamentale. La disponibilità di animali geneticamente modificati ha particolarmente favorito l'uso dei topi come modelli sperimentali di ictus.
Nei pazienti colpiti da ictus, l'occlusione dell'arteria cerebrale media (MCA) è un evento comune. Di conseguenza, il modello sperimentale più diffuso prevede l'occlusione intraluminale dell'MCA, una tecnica minimamente invasiva che non richiede craniectomia. Questa procedura prevede l'inserimento di un monofilamento attraverso l'arteria carotide esterna (ECA) e l'avanzamento attraverso l'arteria carotide interna (ICA) fino a raggiungere il punto di ramificazione dell'MCA. Dopo un'occlusione arteriosa di 45 minuti, il monofilamento viene rimosso per consentire la riperfusione. Durante tutto il processo, il flusso sanguigno cerebrale viene monitorato per confermare la riduzione durante l'occlusione e il successivo recupero dopo la riperfusione. Gli esiti neurologici e tissutali vengono valutati utilizzando test comportamentali e studi di risonanza magnetica per immagini (MRI).
Introduzione
L'ictus è una malattia devastante che colpisce circa 15 milioni di persone in tutto il mondo ogni anno, secondo l'OMS. Circa un terzo dei pazienti soccombe alla condizione, mentre un altro terzo sperimenta una disabilità permanente. L'ictus è una patologia complessa che coinvolge vari tipi di cellule, come le cellule immunitarie neurali e periferiche, la vascolarizzazione e le risposte sistemiche1. L'intricata rete di reazioni innescate dall'ictus a livello di sistema non può attualmente essere replicata utilizzando modelli in vitro . Pertanto, i modelli animali sperimentali sono essenziali per approfondire i meccanismi della malattia e per sviluppare e testare nuove terapie. Attualmente, la riperfusione tissutale precoce è l'unico intervento approvato, sia attraverso la trombolisi con attivatore del plasminogeno di tipo tissutale (tPA) che la trombectomia endovascolare1.
Le occlusioni dell'arteria cerebrale media (MCA) sono frequenti nei pazienti colpiti da ictus. Di conseguenza, nei ratti 2,3,4 sono stati inizialmente sviluppati modelli di occlusione transitoria di MCA (tMCAo) di roditori. Al giorno d'oggi, i topi geneticamente modificati sono gli animali più comunemente usati nei modelli sperimentali di ictus. In questo studio, descriviamo un modello minimamente invasivo di tMCAo intraluminale nei topi. L'approccio viene eseguito attraverso l'arteria carotide a livello del collo, senza craniectomia.
La durata del periodo di occlusione è un fattore critico che determina l'estensione della lesione ischemica. Anche brevi occlusioni di 10 minuti possono causare la morte neuronale selettiva senza un apparente infarto, mentre occlusioni più lunghe, in genere della durata di 30-60 minuti, provocano un certo grado di infarto cerebrale. A differenza dei rami prossimali e distali dell'MCA che irrorano la corteccia e hanno collaterali, le arterie lenticolo-striatali che forniscono sangue allo striato mancano di collaterali5. Di conseguenza, c'è una maggiore riduzione del flusso sanguigno nello striato rispetto alla corteccia dopo tMCAo. Pertanto, occlusioni di 30 minuti o meno colpiscono generalmente lo striato ma non la corteccia, mentre occlusioni più lunghe, da 45 minuti in poi, spesso generano una lesione ischemica in tutto il territorio MCA, compreso lo striato e la corteccia dorsolaterale.
Per garantire il benessere dei topi, somministriamo analgesici prima della procedura e utilizziamo l'anestesia durante l'intervento chirurgico. Ciononostante, l'anestesia può potenzialmente introdurre alterazioni artificiali nella fisiologia del topo e influenzare alcune misure di esito6. L'intervento chirurgico, se eseguito da personale esperto, di solito dura circa 15 minuti per l'induzione di MCAo. Successivamente, il tempo totale sotto anestesia dipende dal periodo di occlusione. Per gli esperimenti in cui è fondamentale ridurre al minimo l'anestesia, una fase alternativa della procedura prevede l'interruzione dell'anestesia durante il periodo di occlusione e la limitazione alle sole fasi chirurgiche per l'inserimento e il ritiro del filamento che occlude l'MCA. Questo approccio riduce la durata dell'anestesia e minimizza i suoi potenziali effetti artefatti sul modello sperimentale 7,8. Pertanto, il metodo di induzione dell'ischemia focale transitoria è presentato mediante occlusione intraluminale dell'MCA con due varianti: con il topo anestetizzato durante l'intero periodo di occlusione o con il topo sveglio durante questo periodo. In entrambi i casi, un intervento chirurgico fittizio dovrebbe essere eseguito in parallelo all'intervento effettuato sui topi ischemici. Inoltre, vengono forniti dati sulla valutazione dell'esito misurati da test comportamentali e risonanza magnetica in vari momenti dopo la riperfusione. Infine, vengono discussi i principali fattori da considerare nell'implementazione della procedura sperimentale.
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Protocollo
Il lavoro sugli animali è stato condotto seguendo le leggi catalane e spagnole (Real Decreto 53/2013) e le Direttive Europee, con l'approvazione del Comitato Etico (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) dell'Università di Barcellona e degli organismi di regolamentazione locali della Generalitat de Catalunya. Gli studi sono riportati in conformità con le linee guida ARRIVE. Questa procedura è progettata per essere eseguita in topi adulti, a partire dalle 8 settimane di età, senza limiti di età. Esempi della procedura chirurgica sviluppata in topi C57BL/6 di 10-12 settimane di età sono forniti qui. Devono essere prese in considerazione le differenze anatomiche a seconda del ceppo del topo.
1. Preparazione dell'animale
- Prima di iniziare la procedura chirurgica, raccogliere e sterilizzare tutti i materiali e gli strumenti necessari. Allestire il tavolo operatorio con tutto il materiale chirurgico necessario (elencato nella Tabella dei materiali).
- Anestetizzare l'animale mediante inalazione di isoflurano in una miscela di ossigeno e protossido di azoto (30%/70%).
- Somministrare buprenorfina (vedere Tabella dei materiali) per via sottocutanea alla dose di 0,05 mg/kg di peso corporeo per fornire analgesia e alleviare il dolore e il disagio.
NOTA: L'analgesia è obbligatoria, ma sono accettati protocolli diversi. Anche i segni di dolore e disagio devono essere controllati durante i primi giorni dopo l'MCAo (vedere fase 4). Applicare soluzioni correttive quando necessario. - Mettere l'animale in una scatola di induzione per anestesia (vedi Tabella dei materiali) con isoflurano al 5% fino a quando non raggiunge uno stato di anestesia profonda (perdita del riflesso nella puntura della zampa e riflesso oculare).
- Posizionare il mouse sul tavolo operatorio e diminuire il livello di isoflurano all'1,5%, erogato dalla maschera facciale. Applicare un unguento veterinario per evitare la secchezza degli occhi durante la procedura.
- Mantenere la temperatura corporea a 37 ± 0,5 °C controllata da una sonda rettale collegata a un termoforo (vedi Tabella dei materiali).
- Radere la parte ventrale del collo e la testa (calvaria) con un rasoio elettrico. Rimuovere con cura i detriti di pelo e disinfettare le aree cutanee tre volte con movimenti circolari con disinfettante a base di iodio e alcol al 70%.
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2. Valutazione del flusso sanguigno cerebrale (CBF) con flussimetria laser Doppler (LDF)
- Con le forbici, praticare un'incisione sulla pelle della testa, in direzione della sutura sagittale, dalle orecchie alla zona tra gli occhi.
- Ritrarre la pelle e rimuovere il periostio sul lato destro del cranio.
- Trovare le coordinate (2,5 mm lateralmente da Bregma) e fissare il supporto Doppler (vedi Tabella dei Materiali) utilizzando il cianoacrilato. Dopo che la colla si è asciugata, collegare la sonda Doppler e verificare la corretta lettura del segnale.
3. Occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media (tMCAo)
- Capovolgere il mouse in posizione supina e fissarlo al tavolo operatorio con del nastro adesivo.
- Fai un'incisione sulla linea mediana sul collo. Tirare indietro lateralmente la pelle e le ghiandole salivari utilizzando i divaricatori (vedere Tabella dei materiali) per esporre il territorio carotideo.
- Identificare l'anatomia vascolare dell'arteria carotide comune (CCA), dell'ICA e dell'ECA, nonché le diverse arterie da esse derivate (mascellare e linguale, tiroide superiore, occipitale e pterigopalatino) (Figura 1A).
- Staccare le arterie principali dal tessuto connettivo adiacente in modo che possano essere maneggiate.
NOTA: Prestare particolare attenzione a non danneggiare i nervi, in particolare il nervo vago, che corre parallelo al CCA. - Avvolgere una sutura di seta 6-0 (vedere Tabella dei materiali) attorno all'ECA in corrispondenza della biforcazione mascellare/linguale. Fissare saldamente un nodo per interrompere definitivamente la circolazione.
- Passare una seconda sutura intorno alla stessa arteria, tra il primo nodo e la biforcazione CCA, e mantenere questo nodo sciolto.
- Metti un terzo filo attorno al CCA e fai un nodo scorsoio che può essere facilmente sciolto.
NOTA: Questo può essere effettuato anche con una clip vascolare, ma il filo consente maggiore movimento e flessibilità. In questa fase è possibile osservare una prima diminuzione del CBF nel segnale LDF. - Posizionare una clip vascolare (vedere Tabella dei materiali) che interrompa la circolazione sanguigna dall'ICA.
- Fai una piccola incisione nell'ECA, vicino all'area in cui si trova il nodo stretto.
- Inserire il monofilamento fino a quando lo spesso rivestimento non è completamente penetrato nel lume arterioso.
- Stringere il secondo nodo per trattenere il monofilamento all'interno dell'arteria ed evitare che la pressione esercitata dal sangue lo spinga fuori (Figura 1B).
- Rimuovere la clip vascolare dall'ICA.
- Tagliare l'ECA al di sotto del primo nodo e ruotare il moncone per orientarlo nella direzione dell'ICA (Figura 1C).
- Far avanzare il monofilamento attraverso l'ICA fino al punto in cui l'MCA si dirama.
NOTA: L'occlusione si riflette in un brusco calo del flusso sanguigno nella lettura LDF. Consideriamo un'occlusione di successo quando il calo del CBF è maggiore del 70% rispetto al valore basale. Se non sono disponibili sistemi di misurazione del CBF, il punto di occlusione può essere notato dalla resistenza all'avanzamento, che nei topi adulti è solitamente a circa 11 mm dalla biforcazione del CCA.- Se l'anestesia viene continuata durante il periodo di occlusione, monitorare il topo e tenerlo sotto costante osservazione per 45 minuti.
- Nel caso in cui il topo si risvegli durante il periodo di occlusione, suturare la pelle del collo con diversi punti di sutura. Senza scollegare la sonda LDF, posizionare il mouse nella scatola a temperatura controllata, consentendo il recupero dall'anestesia.
NOTA: È comune che il topo mostri un comportamento circolatorio spontaneo durante questo periodo, indicativo di un'occlusione riuscita. - Dopo 40 minuti, anestetizzare nuovamente il topo seguendo le stesse procedure di anestesia e disinfezione indicate ai punti 1.4, 1.5 e 1.7. Riposizionalo sul tavolo operatorio e rimuovi i punti dal collo.
- Dopo 45 minuti di occlusione, allentare il nodo che tiene in posizione il monofilamento. Tirare lentamente e delicatamente il filamento e controllare che si verifichi la ricanalizzazione del tessuto.
- Estrarre il filamento e stringere il nodo per evitare la perdita di sangue.
- Sciogliere il nodo CCA. Assicurarsi che non vi siano danni alla parete arteriosa.
- Rimuovere i divaricatori e riposizionare i muscoli, le ghiandole e la pelle. Suturare la pelle (6-0) e applicare il disinfettante.
- Scollegare la sonda Doppler e staccare il supporto. Suturare e disinfettare la pelle della testa.
- Durante il periodo di recupero dall'anestesia, lasciare il topo in una gabbia dotata di un riscaldatore per mantenere la temperatura. Tenerlo sotto costante osservazione fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia. Dopo il recupero, il topo può essere riportato nella sua gabbia.
NOTA: L'alloggio con arricchimento sociale è altamente raccomandato. Tuttavia, non mescolare mai topi operati con topi non operati nella stessa gabbia senza alcuna separazione fisica al fine di prevenire l'aggressione.
4. Cure post-operatorie
- Sorvegliare periodicamente gli animali seguendo le procedure e le normative stabilite secondo le normative locali. Fornire un trattamento analgesico secondo il programma appropriato per ridurre al minimo il dolore dopo l'intervento chirurgico.
NOTA: Nel presente studio, è stato applicato lo stesso analgesico dell'inizio dell'intervento (buprenorfina 0,05 mg/kg di peso corporeo) a 6 ore e 24 ore dopo l'intervento chirurgico. - Eseguire l'eutanasia quando i parametri di supervisione lo indicano, seguendo i protocolli istituzionalmente approvati.
- Monitorare giornalmente il peso degli animali. Fornire cibo morbido agli animali durante i primi giorni dopo l'intervento. Inoltre, idratarli mediante iniezione sottocutanea di soluzione fisiologica (200 μL) subito dopo l'intervento chirurgico e successivamente periodicamente se si osserva che il topo non si idrata da solo. Disporre il cibo e l'acqua in modo che siano facilmente accessibili all'animale.
- Una volta completato lo studio in vivo , anestetizzare i topi, sopprimerli e rimuovere il tessuto cerebrale per ulteriori analisi istopatologiche (se necessario).
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Risultati
Esistono diversi approcci per valutare l'esito della procedura tMCAo. In questo caso vengono utilizzati metodi di neuroimaging (MRI) in vivo e test comportamentali.
I topi sviluppano lesioni ischemiche nel cervello, che colpiscono principalmente il territorio fornito dall'MCA omolaterale all'occlusione, come lo striato e la corteccia dorsolaterale. Esistono diversi metodi per determinare l'estensione della lesione, tra cui la colorazione tissutale del cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazol...
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Discussione
La procedura tMCAo intraluminale è il modello più comunemente utilizzato di ischemia cerebrale focale con riperfusione nella ricerca di base. Attualmente, i topi sono il modello animale preferito a causa della disponibilità di ceppi geneticamente modificati. Tuttavia, è essenziale riconoscere che i topi geneticamente modificati e il loro background genetico possono avere un impatto sulla vascolarizzazione del cervello. La presenza di circolazione collaterale e di anastomosi tra diversi territori arteriosi può influenzare...
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Studio finanziato dalla sovvenzione PID2020-113202RB-I00 finanziata dal Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 e dal Fondo europeo di sviluppo regionale (FESR). Un modo di fare Europa". NCC e MAR avevano borse di studio pre-dottorato (rispettivamente PRE2021-099481 e PRE2018-085737) finanziate da MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 e da "European Social Fund (ESF) Investing in your future". Ringraziamo Francisca Ruiz-Jaén e Leonardo Márquez-Kisinousky per il loro supporto tecnico. Riconosciamo il supporto della struttura di imaging MRI dell'Institut d'Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Il Programma Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) della Generalitat de Catalunya sostiene l'IDIBAPS.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Sutura 6/0 | Legature vascolari | Arago | |
| 6/0 sutura con ago curvo | Arago | Suture cutanee | |
| 9 mg/mL Soluzione salina | Fresenius Kabi | CN616003 EC | Per l'idratazione |
| Sistema di anestesia | Divaricatori | ||
| smussati, larghi 1 mm | Strumenti di scienza | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | per sollievo dal dolore | |
| Pinza per l'applicazione di pinze | Fine Science Tools | S & T CAF4 | |
| Dumont mini pinze | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Pinze | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Colla | Loctite | Per attaccare la sonda LDF al cranio | |
| Misuratore di forza di presa | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurano | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed Periflux | System 5000 | |
| LDF Supporti per sonde | Perimed | PH 07-4 | |
| Nastro | |||
| Magnete per risonanza magnetica | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germania | BioSpec 70/30 scanner orizzontale per animali | |
| Porta aghi con taglierina per sutura | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Filamento di nylon | Doccol | 701912PK5Re | |
| Gabbia di recupero con cuscinetto | |||
| Forbici sirgiche | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Kit cauterizzatore per piccoli vasi | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscopio e luce fredda | Leica | M60 | |
| Pinze per legare suture | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Termostato, sonda rettale e tappetino per mouse | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Forbici a molla Vannas (tagliente da 4 mm) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Morsetti vascolari | Fine Science Tools | 00396-01 |
Riferimenti
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