Modello transitorio di occlusione dell'arteria cerebrale media dell'ictus

L'ictus è una malattia devastante che colpisce circa 15 milioni di persone in tutto il mondo ogni anno, secondo l'OMS. Circa un terzo dei pazienti soccombe alla condizione, mentre un altro terzo sperimenta una disabilità permanente. L'ictus è una patologia complessa che coinvolge vari tipi di cellule, come le cellule immunitarie neurali e periferiche, la vascolarizzazione e le risposte sistemiche¹. L'intricata rete di reazioni innescate dall'ictus a livello di sistema non può attualmente essere replicata utilizzando modelli in vitro . Pertanto, i modelli animali sperimentali sono essenziali per approfondire i meccanismi della malattia e per sviluppare e testare nuove terapie. Attualmente, la riperfusione tissutale precoce è l'unico intervento approvato, sia attraverso la trombolisi con attivatore del plasminogeno di tipo tissutale (tPA) che la trombectomia endovascolare¹.

Le occlusioni dell'arteria cerebrale media (MCA) sono frequenti nei pazienti colpiti da ictus. Di conseguenza, nei ratti ^2,3,4 sono stati inizialmente sviluppati modelli di occlusione transitoria di MCA (tMCAo) di roditori. Al giorno d'oggi, i topi geneticamente modificati sono gli animali più comunemente usati nei modelli sperimentali di ictus. In questo studio, descriviamo un modello minimamente invasivo di tMCAo intraluminale nei topi. L'approccio viene eseguito attraverso l'arteria carotide a livello del collo, senza craniectomia.

La durata del periodo di occlusione è un fattore critico che determina l'estensione della lesione ischemica. Anche brevi occlusioni di 10 minuti possono causare la morte neuronale selettiva senza un apparente infarto, mentre occlusioni più lunghe, in genere della durata di 30-60 minuti, provocano un certo grado di infarto cerebrale. A differenza dei rami prossimali e distali dell'MCA che irrorano la corteccia e hanno collaterali, le arterie lenticolo-striatali che forniscono sangue allo striato mancano di collaterali⁵. Di conseguenza, c'è una maggiore riduzione del flusso sanguigno nello striato rispetto alla corteccia dopo tMCAo. Pertanto, occlusioni di 30 minuti o meno colpiscono generalmente lo striato ma non la corteccia, mentre occlusioni più lunghe, da 45 minuti in poi, spesso generano una lesione ischemica in tutto il territorio MCA, compreso lo striato e la corteccia dorsolaterale.

Per garantire il benessere dei topi, somministriamo analgesici prima della procedura e utilizziamo l'anestesia durante l'intervento chirurgico. Ciononostante, l'anestesia può potenzialmente introdurre alterazioni artificiali nella fisiologia del topo e influenzare alcune misure di esito⁶. L'intervento chirurgico, se eseguito da personale esperto, di solito dura circa 15 minuti per l'induzione di MCAo. Successivamente, il tempo totale sotto anestesia dipende dal periodo di occlusione. Per gli esperimenti in cui è fondamentale ridurre al minimo l'anestesia, una fase alternativa della procedura prevede l'interruzione dell'anestesia durante il periodo di occlusione e la limitazione alle sole fasi chirurgiche per l'inserimento e il ritiro del filamento che occlude l'MCA. Questo approccio riduce la durata dell'anestesia e minimizza i suoi potenziali effetti artefatti sul modello sperimentale ^7,8. Pertanto, il metodo di induzione dell'ischemia focale transitoria è presentato mediante occlusione intraluminale dell'MCA con due varianti: con il topo anestetizzato durante l'intero periodo di occlusione o con il topo sveglio durante questo periodo. In entrambi i casi, un intervento chirurgico fittizio dovrebbe essere eseguito in parallelo all'intervento effettuato sui topi ischemici. Inoltre, vengono forniti dati sulla valutazione dell'esito misurati da test comportamentali e risonanza magnetica in vari momenti dopo la riperfusione. Infine, vengono discussi i principali fattori da considerare nell'implementazione della procedura sperimentale.

Il lavoro sugli animali è stato condotto seguendo le leggi catalane e spagnole (Real Decreto 53/2013) e le Direttive Europee, con l'approvazione del Comitato Etico (Comité Ètic d'Experimentació Animal, CEEA) dell'Università di Barcellona e degli organismi di regolamentazione locali della Generalitat de Catalunya. Gli studi sono riportati in conformità con le linee guida ARRIVE. Questa procedura è progettata per essere eseguita in topi adulti, a partire dalle 8 settimane di età, senza limiti di età. Esempi della procedura chirurgica sviluppata in topi C57BL/6 di 10-12 settimane di età sono forniti qui. Devono essere prese in considerazione le differenze anatomiche a seconda del ceppo del topo.

1. Preparazione dell'animale

1. Prima di iniziare la procedura chirurgica, raccogliere e sterilizzare tutti i materiali e gli strumenti necessari. Allestire il tavolo operatorio con tutto il materiale chirurgico necessario (elencato nella Tabella dei materiali).
2. Anestetizzare l'animale mediante inalazione di isoflurano in una miscela di ossigeno e protossido di azoto (30%/70%).
3. Somministrare buprenorfina (vedere Tabella dei materiali) per via sottocutanea alla dose di 0,05 mg/kg di peso corporeo per fornire analgesia e alleviare il dolore e il disagio.
   NOTA: L'analgesia è obbligatoria, ma sono accettati protocolli diversi. Anche i segni di dolore e disagio devono essere controllati durante i primi giorni dopo l'MCAo (vedere fase 4). Applicare soluzioni correttive quando necessario.
4. Mettere l'animale in una scatola di induzione per anestesia (vedi Tabella dei materiali) con isoflurano al 5% fino a quando non raggiunge uno stato di anestesia profonda (perdita del riflesso nella puntura della zampa e riflesso oculare).
5. Posizionare il mouse sul tavolo operatorio e diminuire il livello di isoflurano all'1,5%, erogato dalla maschera facciale. Applicare un unguento veterinario per evitare la secchezza degli occhi durante la procedura.
6. Mantenere la temperatura corporea a 37 ± 0,5 °C controllata da una sonda rettale collegata a un termoforo (vedi Tabella dei materiali).
7. Radere la parte ventrale del collo e la testa (calvaria) con un rasoio elettrico. Rimuovere con cura i detriti di pelo e disinfettare le aree cutanee tre volte con movimenti circolari con disinfettante a base di iodio e alcol al 70%.
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2. Valutazione del flusso sanguigno cerebrale (CBF) con flussimetria laser Doppler (LDF)

1. Con le forbici, praticare un'incisione sulla pelle della testa, in direzione della sutura sagittale, dalle orecchie alla zona tra gli occhi.
2. Ritrarre la pelle e rimuovere il periostio sul lato destro del cranio.
3. Trovare le coordinate (2,5 mm lateralmente da Bregma) e fissare il supporto Doppler (vedi Tabella dei Materiali) utilizzando il cianoacrilato. Dopo che la colla si è asciugata, collegare la sonda Doppler e verificare la corretta lettura del segnale.

3. Occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media (tMCAo)

1. Capovolgere il mouse in posizione supina e fissarlo al tavolo operatorio con del nastro adesivo.
2. Fai un'incisione sulla linea mediana sul collo. Tirare indietro lateralmente la pelle e le ghiandole salivari utilizzando i divaricatori (vedere Tabella dei materiali) per esporre il territorio carotideo.
3. Identificare l'anatomia vascolare dell'arteria carotide comune (CCA), dell'ICA e dell'ECA, nonché le diverse arterie da esse derivate (mascellare e linguale, tiroide superiore, occipitale e pterigopalatino) (Figura 1A).
4. Staccare le arterie principali dal tessuto connettivo adiacente in modo che possano essere maneggiate.
   NOTA: Prestare particolare attenzione a non danneggiare i nervi, in particolare il nervo vago, che corre parallelo al CCA.
5. Avvolgere una sutura di seta 6-0 (vedere Tabella dei materiali) attorno all'ECA in corrispondenza della biforcazione mascellare/linguale. Fissare saldamente un nodo per interrompere definitivamente la circolazione.
6. Passare una seconda sutura intorno alla stessa arteria, tra il primo nodo e la biforcazione CCA, e mantenere questo nodo sciolto.
7. Metti un terzo filo attorno al CCA e fai un nodo scorsoio che può essere facilmente sciolto.
   NOTA: Questo può essere effettuato anche con una clip vascolare, ma il filo consente maggiore movimento e flessibilità. In questa fase è possibile osservare una prima diminuzione del CBF nel segnale LDF.
8. Posizionare una clip vascolare (vedere Tabella dei materiali) che interrompa la circolazione sanguigna dall'ICA.
9. Fai una piccola incisione nell'ECA, vicino all'area in cui si trova il nodo stretto.
10. Inserire il monofilamento fino a quando lo spesso rivestimento non è completamente penetrato nel lume arterioso.
11. Stringere il secondo nodo per trattenere il monofilamento all'interno dell'arteria ed evitare che la pressione esercitata dal sangue lo spinga fuori (Figura 1B).
12. Rimuovere la clip vascolare dall'ICA.
13. Tagliare l'ECA al di sotto del primo nodo e ruotare il moncone per orientarlo nella direzione dell'ICA (Figura 1C).
14. Far avanzare il monofilamento attraverso l'ICA fino al punto in cui l'MCA si dirama.
    NOTA: L'occlusione si riflette in un brusco calo del flusso sanguigno nella lettura LDF. Consideriamo un'occlusione di successo quando il calo del CBF è maggiore del 70% rispetto al valore basale. Se non sono disponibili sistemi di misurazione del CBF, il punto di occlusione può essere notato dalla resistenza all'avanzamento, che nei topi adulti è solitamente a circa 11 mm dalla biforcazione del CCA.
    1. Se l'anestesia viene continuata durante il periodo di occlusione, monitorare il topo e tenerlo sotto costante osservazione per 45 minuti.
    2. Nel caso in cui il topo si risvegli durante il periodo di occlusione, suturare la pelle del collo con diversi punti di sutura. Senza scollegare la sonda LDF, posizionare il mouse nella scatola a temperatura controllata, consentendo il recupero dall'anestesia.
       NOTA: È comune che il topo mostri un comportamento circolatorio spontaneo durante questo periodo, indicativo di un'occlusione riuscita.
    3. Dopo 40 minuti, anestetizzare nuovamente il topo seguendo le stesse procedure di anestesia e disinfezione indicate ai punti 1.4, 1.5 e 1.7. Riposizionalo sul tavolo operatorio e rimuovi i punti dal collo.
15. Dopo 45 minuti di occlusione, allentare il nodo che tiene in posizione il monofilamento. Tirare lentamente e delicatamente il filamento e controllare che si verifichi la ricanalizzazione del tessuto.
16. Estrarre il filamento e stringere il nodo per evitare la perdita di sangue.
17. Sciogliere il nodo CCA. Assicurarsi che non vi siano danni alla parete arteriosa.
18. Rimuovere i divaricatori e riposizionare i muscoli, le ghiandole e la pelle. Suturare la pelle (6-0) e applicare il disinfettante.
19. Scollegare la sonda Doppler e staccare il supporto. Suturare e disinfettare la pelle della testa.
20. Durante il periodo di recupero dall'anestesia, lasciare il topo in una gabbia dotata di un riscaldatore per mantenere la temperatura. Tenerlo sotto costante osservazione fino a quando non si è completamente ripreso dall'anestesia. Dopo il recupero, il topo può essere riportato nella sua gabbia.
    NOTA: L'alloggio con arricchimento sociale è altamente raccomandato. Tuttavia, non mescolare mai topi operati con topi non operati nella stessa gabbia senza alcuna separazione fisica al fine di prevenire l'aggressione.

4. Cure post-operatorie

1. Sorvegliare periodicamente gli animali seguendo le procedure e le normative stabilite secondo le normative locali. Fornire un trattamento analgesico secondo il programma appropriato per ridurre al minimo il dolore dopo l'intervento chirurgico.
   NOTA: Nel presente studio, è stato applicato lo stesso analgesico dell'inizio dell'intervento (buprenorfina 0,05 mg/kg di peso corporeo) a 6 ore e 24 ore dopo l'intervento chirurgico.
2. Eseguire l'eutanasia quando i parametri di supervisione lo indicano, seguendo i protocolli istituzionalmente approvati.
3. Monitorare giornalmente il peso degli animali. Fornire cibo morbido agli animali durante i primi giorni dopo l'intervento. Inoltre, idratarli mediante iniezione sottocutanea di soluzione fisiologica (200 μL) subito dopo l'intervento chirurgico e successivamente periodicamente se si osserva che il topo non si idrata da solo. Disporre il cibo e l'acqua in modo che siano facilmente accessibili all'animale.
4. Una volta completato lo studio in vivo , anestetizzare i topi, sopprimerli e rimuovere il tessuto cerebrale per ulteriori analisi istopatologiche (se necessario).

Esistono diversi approcci per valutare l'esito della procedura tMCAo. In questo caso vengono utilizzati metodi di neuroimaging (MRI) in vivo e test comportamentali.

I topi sviluppano lesioni ischemiche nel cervello, che colpiscono principalmente il territorio fornito dall'MCA omolaterale all'occlusione, come lo striato e la corteccia dorsolaterale. Esistono diversi metodi per determinare l'estensione della lesione, tra cui la colorazione tissutale del cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC), la colorazione istologica (ematossilina/eosina, acetato di tionina) e le modalità di neuroimaging in vivo come la risonanza magnetica. La risonanza magnetica è stata scelta per la sua natura non invasiva e la capacità di utilizzare lo stesso tessuto per altri studi, fornendo una valutazione completa della lesione in ciascun topo. Inoltre, la risonanza magnetica consente misurazioni ripetute negli stessi animali, aumentando la riproducibilità dei risultati e spesso riducendo il numero di animali necessari per uno studio.

Nelle sedute di risonanza magnetica è stato utilizzato lo stesso protocollo di anestesia con isoflurano (induzione 5%, mantenimento 1,5%). Per la valutazione del volume della lesione, è stata utilizzata una sequenza veloce pesata in T2 (T2w turbo RARE fast spin-echo)9 per ridurre al minimo il tempo in cui l'animale viene anestetizzato, il che è importante quando gli studi longitudinali con acquisizioni MRI in tempi diversi devono essere eseguiti negli stessi topi. Questa procedura consente di valutare le variazioni della lesione nel tempo negli stessi animali ed è molto utile quando viene applicata per studi di neuroprotezione o per testare l'efficacia dei farmaci, tra gli altri. Gli esperimenti di immagine sono stati condotti su uno scanner animale orizzontale 7T. Le specifiche tecniche della sequenza anatomica (possono differire a seconda dell'intensità del campo magnetico): T2_TurboRARE; 22 sezioni coronali; spessore 0,5 mm; tempo di eco (TE) = 33 ms; tempo di ripetizione (TR) = 2336,39 ms. 2 medie. Angolo di ribaltamento, 90°; campo visivo (FOV) = 20 mm x 20 mm, con una dimensione della matrice di 256 x 256. La Figura 2A mostra un esempio rappresentativo di immagini RM dell'evoluzione della lesione nello stesso topo, valutate a 40 min, 6 h, 24 h e 48 h dopo la riperfusione. La progressione del volume della lesione richiede da ore a circa due giorni per essere completata. La quantificazione del volume della lesione mostra questa evoluzione nel tempo (Figura 2B).

Sono state descritte diverse scale neurologiche per valutare la compromissione neurologica causata dall'insulto ischemico. Suggeriamo di utilizzare test di neuroscore che sono stati ampiamente descritti in manoscritti precedenti. Ad esempio, si raccomanda il test riportato in dettaglio da Orsini et al. (2012)10 .

È disponibile un'ampia varietà di test comportamentali, principalmente per rilevare le differenze nella compromissione delle funzioni motorie e sensoriali. A tale scopo, sono stati utilizzati il test della forza di presa e il test degli angoli. Il test della forza di presa viene utilizzato per valutare la funzione del motore. La forza degli arti anteriori viene misurata con un misuratore di forza di presa collegato a un trasduttore di forza digitale (vedi Tabella dei materiali). Il topo si aggrappa a una barra orizzontale con entrambe le zampe anteriori mentre la tira delicatamente all'indietro attraverso la coda. Si nota la forza massima della presa prima del rilascio delle zampe anteriori. Vengono eseguite cinque prove per animale e il valore principale viene calcolato escludendo i valori massimo e minimo. Il test d'angolo viene utilizzato per rilevare anomalie unilaterali delle funzioni sensoriali e motorie. L'apparecchio è costituito da un angolo con due assi (30 cm × 20 cm × 1 cm) fissate con un angolo di 30° e una piccola apertura all'estremità. Il mouse è posizionato a metà verso l'angolo. Quando il topo entra in profondità nell'angolo, entrambi i lati delle vibrisse vengono stimolati insieme. Il mouse si gira quindi di nuovo verso l'estremità aperta. Vengono eseguite un totale di 10 prove per animale e vengono annotati i lati scelti. Il 50% di giri a sinistra e a destra è previsto in condizioni fisiologiche, mentre una preferenza a destra è prevista nei topi con il MCAo destro. Una prova è considerata valida quando viene raggiunto un giro completo o quando il mouse gira la testa ≥ 90º. I risultati sono mostrati come percentuale di virate a destra (omolaterali).

Vengono presentati i risultati rappresentativi che mostrano la perdita di forza mostrata dai topi 24 ore dopo il tMCAo misurato dal test di forza di presa (Figura 3A), nonché la loro preferenza di girare lateralmente omolaterale alla lesione quando stimolati nel test d'angolo (Figura 3B). L'esecuzione di test comportamentali il giorno stesso dell'intervento può essere meno precisa poiché alcuni parametri potrebbero essere alterati a causa della vicinanza dell'anestesia e del periodo post-operatorio.

Figura 1: Rappresentazione schematica dell'albero vascolare del collo (lato destro). (A) L'immagine mostra le arterie principali (Arteria carotide comune-CCA, Arteria carotide esterna-ECA, Arteria carotide interna-ICA) e i diversi rami (Arteria pterigopalatina Pt; Arteria occipitale Occ; Arteria tiroidea superiore St; Arterie mascellari e linguali Max/Lin). (B) Le prime fasi della procedura chirurgica, con il CCA legato dalla sutura, la circolazione dell'ICA viene interrotta da una pinza vascolare e il monofilamento viene introdotto attraverso l'ECA. (C) Riorientamento dell'ECA per spingere il monofilamento verso la zona di occlusione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Immagini RM rappresentative. (A) Le immagini T2-w dello stesso topo in diversi momenti dopo la riperfusione mostrano l'evoluzione della lesione nella fase acuta. L'area interessata dall'infarto aumenta rapidamente nelle prime ore e subisce poche variazioni in seguito. (B) Evoluzione del volume della lesione nella fase acuta dopo MCAo. Ogni barra rappresenta la media ± DS della percentuale (%) del volume della lesione. Il volume della lesione aumenta significativamente durante le prime 24 ore dopo la riperfusione (*p = 0,0182; **p = 0,0088; ANOVA/test di Kruskal-Wallis a 1 via). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Test comportamentali prima (basale) e 24 ore dopo tMCAo (n = 16 topi). (A) Il test della forza di presa mostra la forza massima (Max.) per topo. (B) Il test in curva mostra la percentuale (%) di svolte a destra. I grafici mostrano scatola e baffi (valori da minimo a massimo) per gruppo e i punti corrispondono ai singoli topi (****p < 0,0001; Test di rango firmato a coppie abbinate di Wilcoxon). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.