Method Article

Processazione tissutale e isolamento di fibroblasti primari dalla vagina umana

DOI:

10.3791/65864

⸱

November 22nd, 2024

 ,  , 
1Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Division of Urogynecology, Massachusetts General Hospital, 2Massachusetts General Hospital/Vincent Center for Reproductive Biology/Harvard Medical School, 3Department of Obstetrics, Gynecology and Reproductive Biology, Massachusetts General Hospital, Vincent Center for Reproductive Biology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo protocollo dimostra una tecnica affidabile ed efficace per isolare i fibroblasti primari dal tessuto vaginale umano in premenopausa o postmenopausa. I protocolli esistenti per l'isolamento dei fibroblasti vaginali non considerano le sfide dell'isolamento cellulare dal tessuto senescente. Il tessuto vaginale è stato ottenuto da donne dopo un intervento chirurgico di prolasso degli organi pelvici.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il prolasso degli organi pelvici è un disturbo che influisce gravemente sulla qualità della vita delle donne. Si verifica quando i muscoli e i legamenti si indeboliscono e causano l'abbassamento degli organi pelvici nel bacino, creando un rigonfiamento nella vagina. La chirurgia per correggere il prolasso degli organi pelvici è stata un trattamento fondamentale. Recentemente, c'è stato un crescente interesse nello studio della composizione tissutale dei pazienti con prolasso a livello cellulare.

Attualmente c'è poco consenso riguardo all'effetto dell'età del donatore o del paziente sulle terapie cellulari. Gli attuali protocolli pubblicati per l'isolamento dei fibroblasti vaginali si concentrano sul tessuto in premenopausa o trascurano di commentare l'età del tessuto del donatore. La maggior parte dei protocolli esistenti utilizza modelli animali. La consistenza del tessuto vaginale umano è più densa rispetto ai tessuti utilizzati nella maggior parte dei protocolli. In questo studio, il tessuto vaginale umano è stato ottenuto principalmente da donatori più anziani, il che probabilmente ha contribuito al fallimento dei protocolli esistenti.

Lo scopo di questo studio è descrivere un protocollo standard per l'acquisizione affidabile di fibroblasti vaginali umani, indipendentemente dall'età del donatore e dallo stato della menopausa. I risultati sono stati riprodotti utilizzando il tessuto di nove donatori separati sottoposti a chirurgia del prolasso degli organi pelvici. Sei pazienti erano in postmenopausa, con il donatore più anziano di 78 anni. L'età media dei donatori di tessuto era di 59 anni.

Qui, descriviamo un metodo affidabile per generare una sospensione unicellulare arricchita con fibroblasti utilizzando una combinazione di dissociazione enzimatica e meccanica e raggruppamento di sospensioni cellulari di più biopsie vaginali da un singolo donatore. L'isolamento affidabile dei fibroblasti primari vaginali umani può essere utile nello studio del prolasso degli organi pelvici e delle interazioni microbioma-ospite.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La disparità di genere nella scienza e nella ricerca è un problema costante. La ricerca sui disturbi che colpiscono principalmente le persone di genere femminile è sottofinanziata1. Il prolasso degli organi pelvici è un disturbo fortemente associato al genere femminile. Si verifica quando i muscoli e i legamenti si indeboliscono e causano l'abbassamento degli organi pelvici nel bacino, creando un rigonfiamento nella vagina2. Poco si sa sulle interazioni cellulari nel contesto di questa fisiopatologia, né su come i fattori a livello tissutale influenzino il successo degli interventi chirurgici3.

Le cellule primarie piuttosto che le linee cellulari sono ampiamente riconosciute come essenziali per la ricerca clinica traslazionale nel fornire una maggiore rilevanza fisiologica4. Le cellule primarie vengono prelevate direttamente dal tessuto corporeo di interesse e possono imitare più precisamente la fisiologia in vivo . L'isolamento dei fibroblasti primari dalla vagina umana può essere utile per studiare i meccanismi biologici del prolasso degli organi pelvici e la modellazione della malattia, considerando le caratteristiche chiave del donatore, come l'età e lo stato della menopausa.

Il prolasso degli organi pelvici colpisce comunemente gli individui più anziani o in postmenopausa. L'isolamento e la proliferazione delle cellule primarie dei fibroblasti nello studio di questa condizione sono difficili a causa della riduzione delle popolazioni cellulari e della capacità clonogenica dei donatori più anziani5. Nella nostra esperienza, l'uso di protocolli precedentemente descritti per la dissociazione del tessuto vaginale non è riuscito ad estrarre alcun fibroblasto da una biopsia tissutale standard di 1 cm2 .

Attraverso una revisione della letteratura, abbiamo scoperto che studi simili erano suddivisi in due gruppi: modelli animali, come il murino6, e modelli umani 7,8. Quando si segue il protocollo del topo, l'uso di forbici per la lavorazione dei tessuti del tessuto vaginale umano ha prodotto una digestione meccanica inadeguata. L'estrapolazione dei protocolli utilizzando il tessuto murino e altri siti tissutali9 non ha avuto successo.

La maggior parte degli articoli che utilizzavano campioni vaginali umani utilizzavano tessuto di individui in premenopausa con prolasso degli organi pelvici 7,10. Sebbene alcuni articoli abbiano riportato l'uso di campioni di individui in premenopausa e postmenopausa11, non hanno descritto in modo sufficientemente dettagliato il protocollo utilizzato per isolare con successo i fibroblasti da donatori anziani o in postmenopausa. L'isolamento e la modellazione della malattia utilizzando fibroblasti da tessuto in postmenopausa possono essere essenziali per comprendere la fisiopatologia cellulare del prolasso degli organi pelvici, poiché questa condizione ha la più alta prevalenza negli individui nel decennio successivo alla menopausa12.

Descriviamo un metodo per l'isolamento e la coltura di una sospensione di una singola cellula arricchita di fibroblasti da tessuto vaginale umano utilizzando una combinazione di dissociazione meccanica ed enzimatica. Questo articolo descrive un protocollo affidabile su come acquisire fibroblasti vaginali umani in postmenopausa o in invecchiamento. Le cellule isolate sono state confermate come fibroblasti attraverso l'esame morfologico mediante microscopia a contrasto di fase e immunofluorescenza (IF) per valutare l'espressione di vimentina, F-actina e actina muscolare liscia α (α-SMA).

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il tessuto vaginale è stato ottenuto da donne sottoposte a chirurgia del prolasso degli organi pelvici. Il tessuto vaginale raccolto dopo l'intervento chirurgico era considerato materiale di scarto e altrimenti sarebbe stato scartato. Lo studio è stato condotto in conformità con le linee guida istituzionali ed è stato approvato dall'Institutional Review Board del Massachusetts, il generale Brigham.

1. Prelievo di tessuto vaginale dal paziente

  1. Diagnosticare il prolasso degli organi pelvici prendendo un'anamnesi e utilizzando i risultati dell'esame pelvico: le misurazioni della quantificazione del prolasso degli organi pelvici (POP-Q) sono state ottenute in clinica, mostrando prove di prolasso degli organi pelvici.
  2. Utilizzare i seguenti criteri di inclusione: oltre i 18 anni di età; anamnesi di prolasso sintomatico degli organi pelvici; scegliendo per la correzione chirurgica del prolasso degli organi pelvici.
  3. Escludere: donne in gravidanza e pazienti che rifiutano di donare tessuti.
  4. Tagliare il tessuto vaginale in eccesso come passaggio necessario della chirurgia del prolasso degli organi pelvici. Questo epitelio vaginale viene asportato in spessore totale dopo i seguenti interventi chirurgici: colporrafia anteriore, colporifia posteriore e colpocleosi.
  5. Trasportare il tessuto in laboratorio in una tazza sterile per la raccolta dei campioni con soluzione fisiologica normale o terreno DMEM/F12 (Gibco) privo di siero. Mantenere il ghiaccio.

2. Elaborazione e digestione dei tessuti

  1. Preparazione dei tessuti
    1. Misurare e tagliare il tessuto in modo da comprendere l'intero spessore dell'epitelio vaginale, creando segmenti di circa 1 cm2.
    2. Garantire una misurazione precisa della dimensione della biopsia 1 cm2.
      NOTA: La sovrastima delle dimensioni della biopsia tissutale può compromettere la digestione dei tessuti.
    3. Preparare 2-3 biopsie vaginali aggiuntive di 1 cm2 ciascuna da un singolo donatore e mettere da parte le biopsie.
  2. Digestione meccanica
    1. Posizionare la biopsia vaginale in una capsula di Petri per colture cellulari di 10 cm. Pipettare 500-1.000 μL di terreno privo di siero integrato con 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2,5 μg/mL di amfotericina Bonto nel tessuto vaginale per evitare che il tessuto si secchi.
    2. Tritare il tessuto vaginale in piccoli frammenti utilizzando due bisturi sterili (n. 11 o n. 15) con entrambe le mani.
    3. Assicurarsi che le punte delle lame siano perpendicolari alla superficie del tessuto. Applicare una pressione uguale e costante sulla superficie del tessuto, utilizzando due bisturi. Eseguire un'azione di trazione alternata per tagliare il tessuto in pezzi molto piccoli.
    4. Ripetere questa tecnica di macinazione utilizzando la tecnica a due bisturi fino a quando il campione non è di consistenza uniforme con pezzi da 1-2 mm.
      NOTA: La digestione meccanica con questa tecnica a due bisturi di una biopsia di 1 cm2 dovrebbe richiedere circa 15-20 minuti per essere completata.
    5. Aggiungere 2-3 mL di terreno DMEM/F12 privo di siero integrato con 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2,5 μg/mL di amfotericina B alla piastra, sospendendo il tessuto tritato. Pipettare la soluzione contenente frammenti di tessuto su e giù per rompere eventuali grumi.
  3. Digestione enzimatica
    1. Trasferire la soluzione contenente frammenti di tessuto in una provetta conica da 15 mL. Aggiungere terreni DMEM/F12 privi di siero alla piastra di coltura tissutale in cui è stato tritato il tessuto vaginale per raccogliere eventuali frammenti di tessuto rimanenti. Trasferire la soluzione contenente frammenti di tessuto nella provetta conica. Aggiungere altri terreni DMEM/F12 privi di siero fino a quando il volume totale non raggiunge i 10 ml.
    2. Sciogliere 5 mg di Liberase in 1 mL di acqua sterile (5 mg/mL). Conservare in aliquote da 230 μl a -20 °C per un massimo di un mese o a -80 °C per 6 mesi.
    3. Aggiungere 230 μL di Liberase (stock 13 U/mL) alla provetta, con concentrazione finale di 0,3 U/mL.
      NOTA: L'attività di Liberase può variare da un lotto all'altro. Scongelare ogni aliquota immediatamente prima dell'uso utilizzando un bagno d'acqua. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti.
    4. Ripetere i passaggi 2.1-2.3 per 2-3 biopsie vaginali aggiuntive della stessa donatrice.
      NOTA: Conservare ogni soluzione contenente frammenti di tessuto di una singola biopsia in tubi conici separati. Ad esempio, 4 biopsie vaginali in 4 tubi. Questo è importante per una pellettatura ottimale delle celle dopo la centrifugazione.
    5. Incubare le provette per 3 ore a 37 °C con agitazione costante e vigorosa utilizzando un miscelatore per campioni.
    6. Posizionare un miscelatore di campioni in un incubatore di CO2 . Mantenere un'agitazione costante. (Impostazioni del miscelatore di esempio: 25 giri/min di movimento rotatorio per 5 s, 30° di movimento reciproco (rotazione inclinabile) per 5 s e 2° di movimento di vibrazione (vortice) per 3 s).
    7. Durante l'incubazione, agitare le provette a intervalli di 30 minuti.
    8. Centrifugare i campioni a 3.000 x g per 5 minuti. Rimuovere ed eliminare il surnatante.
    9. Risospendere il pellet in 1-2 mL di terreno DMEM/F12 con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2,5 μg/mL di amfotericina B per diluire l'enzima Liberase. Pipettare energicamente fino a quando il pellet non è completamente risospeso.

3. Coltura cellulare

  1. Rimozione di frammenti di tessuto non digeriti
    1. Posizionare un colino cellulare da 100 μm su un contenitore conico sterile da 50 mL.
    2. Raggruppare la sospensione cellulare dalle biopsie tissutali multiple dello stesso donatore.
    3. Filtrare la sospensione tissutale/enzimatica, premendo con uno stantuffo della siringa da 5 mL. Ripetere questo passaggio fino a quando i frammenti di tessuto rimanenti sembrano essere completamente premuti.
      NOTA: Potrebbe esserci del muco dai frammenti di tessuto vaginale che non viene completamente lavorato attraverso il colino. Scartare il muco con il colino cellulare.
  2. Pooling di colture cellulari
    1. Sospensione cellulare aggregata su piastra da più biopsie vaginali (dallo stesso donatore) su una piastra di Petri (60 mm x 15 mm).
    2. Incubare la capsula di Petri in un incubatore di CO2 a 37 °C per una notte.
    3. Osservare e confermare la presenza di cellule non aderenti con un microscopio a contrasto di fase.
    4. Assicurarsi che la messa a fuoco del microscopio sia sul fondo della lastra.
      NOTA: Potrebbero esserci molte cellule immunitarie in primo piano. Un numero minore di fibroblasti sarà attaccato al fondo della piastra.
    5. Attendere 18-24 ore prima di cambiare i terreni di coltura cellulare per garantire un'adeguata aderenza cellulare.
    6. Cambiare il terreno di coltura ogni tre giorni fino a quando non si verifica una confluenza dell'80%. Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, espandersi in un pallone più grande o congelare aliquote di cellule per un uso futuro.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il tessuto vaginale è stato raccolto da 10 donatori indipendenti sottoposti a chirurgia del prolasso degli organi pelvici. Utilizzando il protocollo descritto, le cellule sono state isolate dal tessuto vaginale umano. Le popolazioni cellulari avevano un caratteristico aspetto allungato, piatto e a forma di fuso. Come altri studi, abbiamo osservato capacità di raddoppio cellulare significativamente più lente e ridotta capacità clonogenica dei fibroblasti con l'aumentare dell'età del donatore. Queste differenze sono state marcate confrontando i fibroblasti isolati da individui più anziani (75-78 anni) con quelli isolati da individui giovani (35-47 anni). Le cellule di donatori di mezza età hanno mostrato un profilo intermedio (56-61 anni). I tassi di proliferazione cellulare sono stati inizialmente stimati mediante visualizzazione diretta utilizzando un microscopio a contrasto di fase con la stessa densità di semina nota.

figure-results-1
Figura 1: Rappresentazione schematica del protocollo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La Figura 1 mostra una rappresentazione schematica del protocollo di dissociazione e isolamento. Seguendo questi passaggi, questo protocollo ha prodotto un tasso di successo del 90% di isolamento dei fibroblasti primari in nove donatori su dieci in un numero di cellule sufficiente per consentire la subcoltura delle cellule. L'età media dei donatori era di 59 anni.

Protocollo (Autore, anno)Tessuto donatore del protocollo originaleNumero di donatoriEtà del donatore in anniFibroblasti ottenutiMorfologia
Ruiz-Zapata et al., 2013Vagina umana356-78NoN/A
Khan et al., 2016Orecchio e coda del topo248-65NoN/A
Waise et al., 2019Tessuto umano356-75NoN/A
Nadalutti et al., 2020Prepuzio umano165NoN/A
CorrenteVagina umana1035-79SìA forma di fuso

Tabella 1: Confronto dei protocolli per il successo dell'isolamento dei fibroblasti vaginali umani. Confronto tra diversi protocolli esistenti con il nostro e testimoniato da risultati morfologici.

La Tabella 1 mostra i risultati dell'utilizzo di altri protocolli per tentare l'isolamento dei fibroblasti vaginali in questo studio. Abbiamo sviluppato un protocollo standard per l'isolamento dei fibroblasti primari dalla mucosa vaginale e da donatori anziani5.

Abbiamo testato diversi protocolli stabiliti, inclusi quelli elencati nella Tabella 1, e non abbiamo osservato alcun successo nell'isolamento cellulare utilizzando questi protocolli nel nostro studio. Proponiamo le seguenti ragioni per le loro limitazioni.

Il protocollo pubblicato da Ruiz et al.3 prevede la raschiatura della fascia e il taglio del tessuto in piccoli pezzi. Nella nostra esperienza, è difficile distinguere la fascia e i tentativi di raschiamento possono comportare una significativa riduzione della resa cellulare. Sebbene questo metodo sia semplice, manca di dettagli critici, il che ne limita la generalizzabilità. Inoltre, la digestione meccanica in questo protocollo sembra insufficiente per il tessuto in postmenopausa, che tende ad essere più denso.

I protocolli pubblicati da Khan et al.9 e Waise et al.13 impiegano forbici per la macinazione dei tessuti, che non introducono forze di taglio multidirezionali significative rispetto alla tecnica del bisturi. Nella nostra esperienza, anche il metodo delle forbici non ha funzionato in modo efficace.

Infine, il protocollo Nadalutti et al.14 , che utilizzava il metodo dell'espianto, non ha prodotto con successo fibroblasti nelle nostre mani. Questo metodo può essere meno efficace a causa della natura del tessuto postmenopausale, che può richiedere un'elaborazione meccanica ed enzimatica più aggressiva per dissociare con successo i fibroblasti.

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Figura 2: Immagine a contrasto di fase delle cellule sospese il giorno 0. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

La Figura 2 mostra le celle sospese il giorno 0 utilizzando il nostro protocollo.

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Figura 3: Immagine a contrasto di fase di fibroblasti primari vaginali al 14° giorno di coltura con ingrandimento di 100x da una sospensione cellulare aggregata di tre biopsie tissutali da 1 cm2 . Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

La Figura 3 mostra i fibroblasti primari con un ingrandimento di 100x da una sospensione cellulare aggregata di 3 biopsie tissutali di 1 cm² di dimensioni.

L'identità dei fibroblasti è stata studiata mediante tecniche di immunofluorescenza, come descritto in precedenza, con piccole modifiche. Per verificare l'origine cellulare delle cellule vaginali primarie, abbiamo utilizzato specifici biomarcatori di origine fibroblastica tramite colorazione immunofluorescente. Le cellule sono state identificate come fibroblasti sulla base della colorazione positiva di vimentina (Figura 4), F-actina e α-SMA da campioni di tessuto in premenopausa e postmenopausa (Figura 5). I fibroblasti sono stati coltivati fino all'espansione con un'elevata vitalità (>90%) per l'uso negli esperimenti.

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Figura 4: Colorazione positiva della vimentina dei fibroblasti vaginali. I fibroblasti primari isolati del tessuto premenopausale e postmenopausale sono stati sottoposti ad analisi IF e le immagini sono state scattate con un ingrandimento di 200x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 5: Colorazione positiva di F-actina e α-SMA di fibroblasti vaginali. I risultati dell'espressione proteica rispetto al controllo delle IgG. Le immagini sono state raccolte con un ingrandimento di 200x. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Molti studi precedenti hanno riportato come isolare i fibroblasti primari dalla vagina umana 3,7. Diversi studi hanno utilizzato tessuto vaginale umano di individui in premenopausa con prolasso degli organi pelvici. Sebbene alcuni articoli abbiano riportato l'uso di tessuti da individui in premenopausa e postmenopausa 7,11, non hanno descritto in modo sufficientemente dettagliato il protocollo utilizzato per isolare con successo i fibroblasti da donatori anziani o in postmenopausa. La parete vaginale è più spessa nelle donne in postmenopausa con prolasso genitale rispetto alle donne in premenopausa, il che può spiegare l'aumento della difficoltà di isolamento in questa popolazione13. Il successo dell'isolamento da donatori in postmenopausa è essenziale per la modellazione e l'indagine della malattia, poiché i disturbi del pavimento pelvico sono più diffusi nei gruppi di età postmenopausale o più avanzata.

Abbiamo stabilito un protocollo per raccogliere e coltivare con successo e in modo coerente fibroblasti vaginali umani da donatori di età compresa tra 35 e 78 anni. L'origine cellulare delle cellule vaginali primarie è stata confermata da biomarcatori di origine fibroblastica tramite colorazione immunofluorescente.

La procedura di isolamento dei fibroblasti vaginali umani qui presentata consente l'isolamento e la coltura di cellule primarie di fibroblasti. Nella nostra esperienza, l'uso di protocolli precedentemente pubblicati per il tessuto animale9e umano 3,14,16 per la dissociazione delle cellule primarie non è riuscito a estrarre alcun fibroblasto da campioni di vagina umana in questo studio14.

Abbiamo ipotizzato due probabili ragioni per le sfide della dissociazione cellulare dal tessuto vaginale umano: (1) lo spessore dermico della mucosa è maggiore nei donatori più anziani e rispetto a quello del tessuto non mucoso dei donatori più anziani 13,17 rendendo più difficile la dissociazione cellulare e (2) la densità dei fibroblasti può essere notevolmente ridotta negli individui più anziani17.

Date queste sfide, ci sono alcuni passaggi critici in questo protocollo che non dovrebbero essere modificati. Il primo passo critico è l'attuazione di una digestione meccanica molto rigorosa. Qui usiamo la tecnica dei due bisturi. Nella nostra esperienza, la sostituzione con le forbici per tritare il tessuto non produce frammenti abbastanza piccoli da dissociare i fibroblasti dal tessuto vaginale umano.

L'altro passaggio critico è il raggruppamento della sospensione cellulare e il raggruppamento di 3-4 biopsie a tutto spessore (1 cm2) da un singolo donatore. Questo è necessario per ottenere un numero sufficiente di cellule per la coltivazione in corso. In tutti i casi, abbiamo raccolto una quantità significativamente maggiore di tessuto superiore a 1 cm2 poiché l'epitelio vaginale in eccesso viene tagliato come parte necessaria della chirurgia del prolasso degli organi pelvici. In questo studio, abbiamo raggruppato solo sospensioni cellulari originate dallo stesso donatore mentre cercavamo di studiare e differenziare le caratteristiche cellulari e la proliferazione tra i vari donatori.

Il nostro protocollo ha un netto vantaggio: la digestione meccanica ed enzimatica portano a migliori rese per il tessuto in postmenopausa, ma non hanno un impatto negativo sui campioni in premenopausa.

Riconosciamo diverse limitazioni al nostro protocollo. L'accesso al tessuto vaginale umano può essere difficile in situazioni in cui non viene eseguita la chirurgia del prolasso vaginale. Anche la necessità di raggruppare le sospensioni cellulari di più campioni di biopsia tissutale può essere una limitazione.

In conclusione, questo protocollo per l'acquisizione di fibroblasti vaginali umani sarà uno strumento utile per future indagini sui disturbi del pavimento pelvico, in particolare negli individui in postmenopausa, nonché un'importante aggiunta alla ricerca sulla salute delle donne.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Non abbiamo conflitti di interesse da divulgare.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vorremmo esprimere la nostra gratitudine a tutti i membri del Vincent Center of Reproductive Biology del Massachusetts General Hospital, così come alla VIncent Memorial Hospital Foundation, per il loro generoso sostegno. Un ringraziamento speciale al Dr. Bo Rueda e al suo laboratorio per i loro preziosi suggerimenti e per averci prestato attrezzature di laboratorio.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Amfotericina BBio TechneB23192
Filtro cellulare (100 μ m)ThermoFisher Scientific22363549
Provette da centrifuga coniche (15 mL)Fisher Scientific 14-959-53A
DMEM/F12ThermoFisher Scientific11320033
Bisturi monouso in piuma n. 15SocorexFB.15
Siero fetale bovinoSigma AldrichNC1983075
Provette da centrifuga coniche ad alta chiarezza (50 mL)Fisher Scientific 14-432-22
HulaMixer Miscelatore per campioniThermoFisher Scientific15920D
Fibronectina umana DuoSet ELISAR& D SystemsDY1918-05
Umano Pro-Collagene I alfa 1 DuoSet ELISAR& D SystemsDY6220-05
Liberase Research GradeSigma Aldrich05 401 119 001
Penicillina/Streptomicina (5000U/ml)ThermoFisher Scientific15070063
Piastre di Petri, polistirene (100 mm x 20 mm)Millipore SigmaP5606
(10 mL)ThermoFischer Scientific170356N
Siringhe sterili (5 mL)Fischer Scientific14-955-458
Pipette sierologiche

References

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