Questo protocollo dimostra una tecnica affidabile ed efficace per isolare i fibroblasti primari dal tessuto vaginale umano in premenopausa o postmenopausa. I protocolli esistenti per l'isolamento dei fibroblasti vaginali non considerano le sfide dell'isolamento cellulare dal tessuto senescente. Il tessuto vaginale è stato ottenuto da donne dopo un intervento chirurgico di prolasso degli organi pelvici.
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Articolo metodologico
Processazione tissutale e isolamento di fibroblasti primari dalla vagina umana
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il prolasso degli organi pelvici è un disturbo che influisce gravemente sulla qualità della vita delle donne. Si verifica quando i muscoli e i legamenti si indeboliscono e causano l'abbassamento degli organi pelvici nel bacino, creando un rigonfiamento nella vagina. La chirurgia per correggere il prolasso degli organi pelvici è stata un trattamento fondamentale. Recentemente, c'è stato un crescente interesse nello studio della composizione tissutale dei pazienti con prolasso a livello cellulare.
Attualmente c'è poco consenso riguardo all'effetto dell'età del donatore o del paziente sulle terapie cellulari. Gli attuali protocolli pubblicati per l'isolamento dei fibroblasti vaginali si concentrano sul tessuto in premenopausa o trascurano di commentare l'età del tessuto del donatore. La maggior parte dei protocolli esistenti utilizza modelli animali. La consistenza del tessuto vaginale umano è più densa rispetto ai tessuti utilizzati nella maggior parte dei protocolli. In questo studio, il tessuto vaginale umano è stato ottenuto principalmente da donatori più anziani, il che probabilmente ha contribuito al fallimento dei protocolli esistenti.
Lo scopo di questo studio è descrivere un protocollo standard per l'acquisizione affidabile di fibroblasti vaginali umani, indipendentemente dall'età del donatore e dallo stato della menopausa. I risultati sono stati riprodotti utilizzando il tessuto di nove donatori separati sottoposti a chirurgia del prolasso degli organi pelvici. Sei pazienti erano in postmenopausa, con il donatore più anziano di 78 anni. L'età media dei donatori di tessuto era di 59 anni.
Qui, descriviamo un metodo affidabile per generare una sospensione unicellulare arricchita con fibroblasti utilizzando una combinazione di dissociazione enzimatica e meccanica e raggruppamento di sospensioni cellulari di più biopsie vaginali da un singolo donatore. L'isolamento affidabile dei fibroblasti primari vaginali umani può essere utile nello studio del prolasso degli organi pelvici e delle interazioni microbioma-ospite.
Introduzione
La disparità di genere nella scienza e nella ricerca è un problema costante. La ricerca sui disturbi che colpiscono principalmente le persone di genere femminile è sottofinanziata1. Il prolasso degli organi pelvici è un disturbo fortemente associato al genere femminile. Si verifica quando i muscoli e i legamenti si indeboliscono e causano l'abbassamento degli organi pelvici nel bacino, creando un rigonfiamento nella vagina2. Poco si sa sulle interazioni cellulari nel contesto di questa fisiopatologia, né su come i fattori a livello tissutale influenzino il successo degli interventi chirurgici3.
Le cellule primarie piuttosto che le linee cellulari sono ampiamente riconosciute come essenziali per la ricerca clinica traslazionale nel fornire una maggiore rilevanza fisiologica4. Le cellule primarie vengono prelevate direttamente dal tessuto corporeo di interesse e possono imitare più precisamente la fisiologia in vivo . L'isolamento dei fibroblasti primari dalla vagina umana può essere utile per studiare i meccanismi biologici del prolasso degli organi pelvici e la modellazione della malattia, considerando le caratteristiche chiave del donatore, come l'età e lo stato della menopausa.
Il prolasso degli organi pelvici colpisce comunemente gli individui più anziani o in postmenopausa. L'isolamento e la proliferazione delle cellule primarie dei fibroblasti nello studio di questa condizione sono difficili a causa della riduzione delle popolazioni cellulari e della capacità clonogenica dei donatori più anziani5. Nella nostra esperienza, l'uso di protocolli precedentemente descritti per la dissociazione del tessuto vaginale non è riuscito ad estrarre alcun fibroblasto da una biopsia tissutale standard di 1 cm2 .
Attraverso una revisione della letteratura, abbiamo scoperto che studi simili erano suddivisi in due gruppi: modelli animali, come il murino6, e modelli umani 7,8. Quando si segue il protocollo del topo, l'uso di forbici per la lavorazione dei tessuti del tessuto vaginale umano ha prodotto una digestione meccanica inadeguata. L'estrapolazione dei protocolli utilizzando il tessuto murino e altri siti tissutali9 non ha avuto successo.
La maggior parte degli articoli che utilizzavano campioni vaginali umani utilizzavano tessuto di individui in premenopausa con prolasso degli organi pelvici 7,10. Sebbene alcuni articoli abbiano riportato l'uso di campioni di individui in premenopausa e postmenopausa11, non hanno descritto in modo sufficientemente dettagliato il protocollo utilizzato per isolare con successo i fibroblasti da donatori anziani o in postmenopausa. L'isolamento e la modellazione della malattia utilizzando fibroblasti da tessuto in postmenopausa possono essere essenziali per comprendere la fisiopatologia cellulare del prolasso degli organi pelvici, poiché questa condizione ha la più alta prevalenza negli individui nel decennio successivo alla menopausa12.
Descriviamo un metodo per l'isolamento e la coltura di una sospensione di una singola cellula arricchita di fibroblasti da tessuto vaginale umano utilizzando una combinazione di dissociazione meccanica ed enzimatica. Questo articolo descrive un protocollo affidabile su come acquisire fibroblasti vaginali umani in postmenopausa o in invecchiamento. Le cellule isolate sono state confermate come fibroblasti attraverso l'esame morfologico mediante microscopia a contrasto di fase e immunofluorescenza (IF) per valutare l'espressione di vimentina, F-actina e actina muscolare liscia α (α-SMA).
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Protocollo
Il tessuto vaginale è stato ottenuto da donne sottoposte a chirurgia del prolasso degli organi pelvici. Il tessuto vaginale raccolto dopo l'intervento chirurgico era considerato materiale di scarto e altrimenti sarebbe stato scartato. Lo studio è stato condotto in conformità con le linee guida istituzionali ed è stato approvato dall'Institutional Review Board del Massachusetts, il generale Brigham.
1. Prelievo di tessuto vaginale dal paziente
- Diagnosticare il prolasso degli organi pelvici prendendo un'anamnesi e utilizzando i risultati dell'esame pelvico: le misurazioni della quantificazione del prolasso degli organi pelvici (POP-Q) sono state ottenute in clinica, mostrando prove di prolasso degli organi pelvici.
- Utilizzare i seguenti criteri di inclusione: oltre i 18 anni di età; anamnesi di prolasso sintomatico degli organi pelvici; scegliendo per la correzione chirurgica del prolasso degli organi pelvici.
- Escludere: donne in gravidanza e pazienti che rifiutano di donare tessuti.
- Tagliare il tessuto vaginale in eccesso come passaggio necessario della chirurgia del prolasso degli organi pelvici. Questo epitelio vaginale viene asportato in spessore totale dopo i seguenti interventi chirurgici: colporrafia anteriore, colporifia posteriore e colpocleosi.
- Trasportare il tessuto in laboratorio in una tazza sterile per la raccolta dei campioni con soluzione fisiologica normale o terreno DMEM/F12 (Gibco) privo di siero. Mantenere il ghiaccio.
2. Elaborazione e digestione dei tessuti
- Preparazione dei tessuti
- Misurare e tagliare il tessuto in modo da comprendere l'intero spessore dell'epitelio vaginale, creando segmenti di circa 1 cm2.
- Garantire una misurazione precisa della dimensione della biopsia 1 cm2.
NOTA: La sovrastima delle dimensioni della biopsia tissutale può compromettere la digestione dei tessuti. - Preparare 2-3 biopsie vaginali aggiuntive di 1 cm2 ciascuna da un singolo donatore e mettere da parte le biopsie.
- Digestione meccanica
- Posizionare la biopsia vaginale in una capsula di Petri per colture cellulari di 10 cm. Pipettare 500-1.000 μL di terreno privo di siero integrato con 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2,5 μg/mL di amfotericina Bonto nel tessuto vaginale per evitare che il tessuto si secchi.
- Tritare il tessuto vaginale in piccoli frammenti utilizzando due bisturi sterili (n. 11 o n. 15) con entrambe le mani.
- Assicurarsi che le punte delle lame siano perpendicolari alla superficie del tessuto. Applicare una pressione uguale e costante sulla superficie del tessuto, utilizzando due bisturi. Eseguire un'azione di trazione alternata per tagliare il tessuto in pezzi molto piccoli.
- Ripetere questa tecnica di macinazione utilizzando la tecnica a due bisturi fino a quando il campione non è di consistenza uniforme con pezzi da 1-2 mm.
NOTA: La digestione meccanica con questa tecnica a due bisturi di una biopsia di 1 cm2 dovrebbe richiedere circa 15-20 minuti per essere completata. - Aggiungere 2-3 mL di terreno DMEM/F12 privo di siero integrato con 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2,5 μg/mL di amfotericina B alla piastra, sospendendo il tessuto tritato. Pipettare la soluzione contenente frammenti di tessuto su e giù per rompere eventuali grumi.
- Digestione enzimatica
- Trasferire la soluzione contenente frammenti di tessuto in una provetta conica da 15 mL. Aggiungere terreni DMEM/F12 privi di siero alla piastra di coltura tissutale in cui è stato tritato il tessuto vaginale per raccogliere eventuali frammenti di tessuto rimanenti. Trasferire la soluzione contenente frammenti di tessuto nella provetta conica. Aggiungere altri terreni DMEM/F12 privi di siero fino a quando il volume totale non raggiunge i 10 ml.
- Sciogliere 5 mg di Liberase in 1 mL di acqua sterile (5 mg/mL). Conservare in aliquote da 230 μl a -20 °C per un massimo di un mese o a -80 °C per 6 mesi.
- Aggiungere 230 μL di Liberase (stock 13 U/mL) alla provetta, con concentrazione finale di 0,3 U/mL.
NOTA: L'attività di Liberase può variare da un lotto all'altro. Scongelare ogni aliquota immediatamente prima dell'uso utilizzando un bagno d'acqua. Evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti. - Ripetere i passaggi 2.1-2.3 per 2-3 biopsie vaginali aggiuntive della stessa donatrice.
NOTA: Conservare ogni soluzione contenente frammenti di tessuto di una singola biopsia in tubi conici separati. Ad esempio, 4 biopsie vaginali in 4 tubi. Questo è importante per una pellettatura ottimale delle celle dopo la centrifugazione. - Incubare le provette per 3 ore a 37 °C con agitazione costante e vigorosa utilizzando un miscelatore per campioni.
- Posizionare un miscelatore di campioni in un incubatore di CO2 . Mantenere un'agitazione costante. (Impostazioni del miscelatore di esempio: 25 giri/min di movimento rotatorio per 5 s, 30° di movimento reciproco (rotazione inclinabile) per 5 s e 2° di movimento di vibrazione (vortice) per 3 s).
- Durante l'incubazione, agitare le provette a intervalli di 30 minuti.
- Centrifugare i campioni a 3.000 x g per 5 minuti. Rimuovere ed eliminare il surnatante.
- Risospendere il pellet in 1-2 mL di terreno DMEM/F12 con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e 100 U/mL di penicillina/streptomicina, 2,5 μg/mL di amfotericina B per diluire l'enzima Liberase. Pipettare energicamente fino a quando il pellet non è completamente risospeso.
3. Coltura cellulare
- Rimozione di frammenti di tessuto non digeriti
- Posizionare un colino cellulare da 100 μm su un contenitore conico sterile da 50 mL.
- Raggruppare la sospensione cellulare dalle biopsie tissutali multiple dello stesso donatore.
- Filtrare la sospensione tissutale/enzimatica, premendo con uno stantuffo della siringa da 5 mL. Ripetere questo passaggio fino a quando i frammenti di tessuto rimanenti sembrano essere completamente premuti.
NOTA: Potrebbe esserci del muco dai frammenti di tessuto vaginale che non viene completamente lavorato attraverso il colino. Scartare il muco con il colino cellulare.
- Pooling di colture cellulari
- Sospensione cellulare aggregata su piastra da più biopsie vaginali (dallo stesso donatore) su una piastra di Petri (60 mm x 15 mm).
- Incubare la capsula di Petri in un incubatore di CO2 a 37 °C per una notte.
- Osservare e confermare la presenza di cellule non aderenti con un microscopio a contrasto di fase.
- Assicurarsi che la messa a fuoco del microscopio sia sul fondo della lastra.
NOTA: Potrebbero esserci molte cellule immunitarie in primo piano. Un numero minore di fibroblasti sarà attaccato al fondo della piastra. - Attendere 18-24 ore prima di cambiare i terreni di coltura cellulare per garantire un'adeguata aderenza cellulare.
- Cambiare il terreno di coltura ogni tre giorni fino a quando non si verifica una confluenza dell'80%. Quando le cellule raggiungono l'80-90% di confluenza, espandersi in un pallone più grande o congelare aliquote di cellule per un uso futuro.
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Risultati
Il tessuto vaginale è stato raccolto da 10 donatori indipendenti sottoposti a chirurgia del prolasso degli organi pelvici. Utilizzando il protocollo descritto, le cellule sono state isolate dal tessuto vaginale umano. Le popolazioni cellulari avevano un caratteristico aspetto allungato, piatto e a forma di fuso. Come altri studi, abbiamo osservato capacità di raddoppio cellulare significativamente più lente e ridotta capacità clonogenica dei fibroblasti con l'aumentare dell'età del donatore. Queste differenze sono state ...
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Discussione
Molti studi precedenti hanno riportato come isolare i fibroblasti primari dalla vagina umana 3,7. Diversi studi hanno utilizzato tessuto vaginale umano di individui in premenopausa con prolasso degli organi pelvici. Sebbene alcuni articoli abbiano riportato l'uso di tessuti da individui in premenopausa e postmenopausa 7,11, non hanno descritto in modo sufficientemente det...
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Dichiarazioni
Non abbiamo conflitti di interesse da divulgare.
Ringraziamenti
Vorremmo esprimere la nostra gratitudine a tutti i membri del Vincent Center of Reproductive Biology del Massachusetts General Hospital, così come alla VIncent Memorial Hospital Foundation, per il loro generoso sostegno. Un ringraziamento speciale al Dr. Bo Rueda e al suo laboratorio per i loro preziosi suggerimenti e per averci prestato attrezzature di laboratorio.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Amfotericina B | Bio Techne | B23192 | |
| Filtro cellulare (100 μ m) | ThermoFisher Scientific | 22363549 | |
| Provette da centrifuga coniche (15 mL) | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 11320033 | |
| Bisturi monouso in piuma n. 15 | Socorex | FB.15 | |
| Siero fetale bovino | Sigma Aldrich | NC1983075 | |
| Provette da centrifuga coniche ad alta chiarezza (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| HulaMixer Miscelatore per campioni | ThermoFisher Scientific | 15920D | |
| Fibronectina umana DuoSet ELISA | R& D Systems | DY1918-05 | |
| Umano Pro-Collagene I alfa 1 DuoSet ELISA | R& D Systems | DY6220-05 | |
| Liberase Research Grade | Sigma Aldrich | 05 401 119 001 | |
| Penicillina/Streptomicina (5000U/ml) | ThermoFisher Scientific | 15070063 | |
| Piastre di Petri, polistirene (100 mm x 20 mm) | Millipore Sigma | P5606 | |
| (10 mL) | ThermoFischer Scientific | 170356N | |
| Siringhe sterili (5 mL) | Fischer Scientific | 14-955-458 |
Riferimenti
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