Dissociazione meccanica dei tessuti per l'analisi di singole cellule mediante dispositivo motorizzato

Summary

Viene fornito un protocollo generale per la dissociazione meccanica enzimatica e semiautomatica combinata dei tessuti per generare sospensioni a singola cellula per analisi a valle, come la citometria a flusso. Sono incluse le istruzioni per la fabbricazione, l'assemblaggio e il funzionamento del dispositivo meccanico a basso costo sviluppato per questo protocollo.

Abstract

Essere in grado di isolare e preparare singole cellule per l'analisi di campioni di tessuto è diventato rapidamente cruciale per le nuove scoperte e ricerche biomediche. I protocolli manuali per gli isolamenti a singola cellula sono molto dispendiosi in termini di tempo e soggetti a variabilità dell'utente. I protocolli meccanici automatizzati sono in grado di ridurre i tempi di elaborazione e la variabilità dei campioni, ma non sono facilmente accessibili o convenienti in contesti di ricerca con risorse ridotte. Il dispositivo qui descritto è stato progettato per la dissociazione semiautomatica dei tessuti utilizzando materiali disponibili in commercio come alternativa a basso costo per i laboratori accademici. Sono state fornite le istruzioni per fabbricare, assemblare e utilizzare il design del dispositivo. Il protocollo di dissociazione produce in modo affidabile sospensioni a singola cellula con rese cellulari e vitalità del campione paragonabili alle preparazioni manuali su più tessuti di topo. Il protocollo offre la possibilità di elaborare fino a 12 campioni di tessuto contemporaneamente per dispositivo, rendendo più gestibili gli studi che richiedono campioni di grandi dimensioni. Il software di accompagnamento consente inoltre di personalizzare il protocollo del dispositivo per adattarsi ai diversi tessuti e vincoli sperimentali.

Introduction

L'analisi di singole cellule è diventata rapidamente cruciale per le nuove scoperte biomediche, sia per applicazioni come la citometria a flusso, l'identificazione di diversi tipi di cellule, il sequenziamento di singole cellule o per l'identificazione di variazioni genomiche o trascrittomiche tra le cellule¹. L'esecuzione di tali isolamenti cellulari dai tessuti di interesse richiede la triturazione dei tessuti sezionati e la loro spinta attraverso un filtro cellulare fine per filtrare il tessuto connettivo dalle cellule desiderate (Figura 1A). L'isolamento di tipi di cellule aderenti, come le cellule dendritiche ....

Protocol

Questo protocollo è stato approvato dall'UMD Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Per questi studi sono stati utilizzati tessuti di topi femmina C57BL/6J di età compresa tra 7 e 9 settimane. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Dissociazione manuale

NOTA: Questo passaggio è adattato da Maisel K. et ^al.7.

1. Rimuovere il tessuto sezionato e metterlo in terreno di coltura cellulare freddo con il 5% di siero fetale bovino (FBS).
2. Tritare il tessuto usando forbici da dissezion....

Results

Questo protocollo meccanico semi-automatizzato è in grado di replicare i risultati di esperimenti in cui le cellule sono state elaborate manualmente. Le sospensioni cellulari preparate utilizzando questo dispositivo e mediante dissociazione manuale mostrano rese cellulari comparabili e vitalità del campione nei tessuti polmonari, renali e cardiaci del topo (Figura 2A,B). Le popolazioni di cellule immunitarie, come le cellule T e le cellule dendritiche, non sono state signifi.......

Discussion

Questo dispositivo è stato progettato per un facile assemblaggio in ambito di ricerca per fornire sospensioni unicellulari da tessuti interi per la successiva analisi di singole cellule. Le caratteristiche, sebbene di base, sono sufficienti per soddisfare le esigenze dei ricercatori in ambito accademico e non solo. Un vantaggio chiave dell'utilizzo di questo dispositivo è il suo potenziale per migliorare la preparazione di sospensioni a singola cellula riducendo la variabilità. Inoltre, la capacità di elaborare 12+ campi.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ lastra acrilica da 12" x 24"	Acrylic Mega Store	N/A
½ lastra acrilica da 12" x 12"	SimbaLux	SL-AS13-12x12
12 G filo in acciaio inossidabile (per bracci di tensione)	Cavo elettrico Everbilt	1000847413
16 G (intrecciato)	Best Connections	N/A
2 magneti da 3 mm	SU-CRO0587	N/A
(per invertire la polarità della corrente ai motori)	AEDIKO	AE06233
Motori CC con diametro di 37 mm (12 V, 200 giri/min) x 12	Greartisan	N/A	Coppia nominale: 2,2 Kg.cm Rapporto di riduzione: 1:22 Corrente nominale: 0,1 A Dimensioni dell'albero di uscita a forma di D: 6 x 14 mm (0,24" x 0,55") (D x L) Dimensioni del cambio: 37 x 25 mm (1,46" x 0,98") (P x L) Dimensioni del motore: 36,2 x 33,3 mm (1,43" x 1,31") (P x L) Dimensioni del foro di montaggio: M3 (non incluso)
Adattatore di alimentazione AC/C con regolatore di tensione variabile    (5 Ampere, 3-12 volt)	Mo-gu	J19091-2-MG-US
AC-DC 5 V 1 A Convertitore buck di precisione trasformatore step-down	Walfront	1A	(adattatore di alimentazione per l'alimentazione di Arduino Nano)
Arduino Nano    (Lafvin)	8541582500		LAFVIN
nbsp;	Awpeye	Pulsante
C57BL6/J mouse	Jackson Laboratory
Collagenase 4	Worthington	CLS4 LS004188
Collagenase D	Roche	11088866001
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)	Corning	10-013-CV
DNAse	Roche	11284932001
Nastro biadesivo in schiuma	SANKA	N/A
Circuito stampato per prototipazione su entrambi i lati	deyue	N / A
EDTA	Sigma- Aldrich	E7889
Saldatore elettrico per saldatura e saldatore	LDK	1002P
Nastro isolante	3M	03429NA
FBS (siero fetale bovino)	Gibco	16140089
delicatoMACS C Tubi	Miltenyi	130-093-237
Graphpad Prism	GraphPad, La Jolla, CA		Software di grafica e analisi statistica
Sensore ad effetto Hall Dimensioni: 0,79 x 0,79 x 0,39 pollici	SunFounder	43237-2
Accoppiatore esagonale Motore con foro da 6 mm Ottone x 2 x 12	Uxcell	N/A
Bulloni a testa esagonale (M4-.70 X 12 Vite a testa esagonale) x 12	cavi di	FAS N/A
(per Arduino Nano)	ELEGOO	EL-CP-004
Schermo LCD	JANSANE	N / A
M3 Viti a testa cilindrica con esagono incassato x 12	Shenzhen Baishichuangyou Technology co. Ltd	310luosditaozhuang
M3 Acciaio inossidabileViti a macchina Viti a testa piatta a testa esagonale (30 mm) x 36	Still Awake	a52400001
Connettori terminali a sgancio rapido	IEUYO	22010064
Tampone per lisi dei globuli rossi (10x)	Segnalazione cellulare	46232
Schermo adattatore terminale Scheda di espansione per Arduino Nano  12" x 24"	Shenzhen Weiyapuhua Tecnologia	60-026-3