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Articolo metodologico

Rottura della barriera emato-encefalica del topo da piccole vescicole extracellulari da placente umane ipossiche

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DOI:

10.3791/65867

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26 gennaio 2024

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1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences, Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty, Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department, Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences, Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Viene presentato un protocollo per valutare se le piccole vescicole extracellulari (sEV) isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche (modellando un aspetto della preeclampsia) interrompono la barriera emato-encefalica in topi femmine adulte non gravide.

Abstract

Le complicanze cerebrovascolari, tra cui l'edema cerebrale e l'ictus ischemico ed emorragico, costituiscono la principale causa di mortalità materna associata alla preeclampsia. I meccanismi alla base di queste complicanze cerebrovascolari rimangono poco chiari. Tuttavia, sono collegati alla disfunzione placentare e all'interruzione della barriera emato-encefalica (BBB). Tuttavia, la connessione tra questi due organi distanti è ancora in fase di determinazione. Prove crescenti suggeriscono che la placenta rilascia molecole di segnalazione, comprese le vescicole extracellulari, nella circolazione materna. Le vescicole extracellulari sono classificate in base alle loro dimensioni, con piccole vescicole extracellulari (sEV di diametro inferiore a 200 nm) considerate particelle di segnalazione critiche sia in condizioni fisiologiche che patologiche. Nella preeclampsia, c'è un aumento del numero di sEV circolanti nella circolazione materna, la cui funzione di segnalazione non è ben compresa. Le sEV placentari rilasciate nella preeclampsia o dalle placente della gravidanza normale esposte all'ipossia inducono disfunzione endoteliale cerebrale e interruzione della BBB. In questo protocollo, valutiamo se le sEV isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche (modellando un aspetto della preeclampsia) interrompono la BBB in vivo.

Introduzione

Circa il 70% dei decessi materni dovuti a preeclampsia, una sindrome gravidica ipertensiva caratterizzata da alterazione dei processi di placentazione, disfunzione endoteliale sistemica maternae, nei casi più gravi, insufficienza multiorgano 1,2, sono associati a complicanze cerebrovascolari acute 3,4. La maggior parte dei decessi materni si verifica nei paesi a basso e medio reddito5. Tuttavia, i meccanismi sottostanti non sono ancora chiari nonostante la rilevanza clinica ed epidemiologica delle complicanze cerebrovascolari associate alla preeclampsia.

D'altra parte, le vescicole extracellulari (EV) (diametro ~30-400 nm) sono mediatori essenziali della comunicazione intercellulare tra tessuti e organi, compresa l'interazione materno-placentare6. Oltre alle proteine e ai lipidi sulla superficie esterna, le vescicole extracellulari trasportano il carico all'interno (proteine, RNA e lipidi). Le vescicole extracellulari possono essere classificate in (1) esosomi (diametro ~50-150 nm, chiamati anche piccole vescicole extracellulari (sEV)), (2) vescicole extracellulari medie/grandi e (3) corpi apoptotici, che differiscono per dimensioni, biogenesi, contenuto e potenziale funzione di segnalazione. La composizione delle vescicole extracellulari è determinata dalle cellule da cui hanno origine e dal tipo di malattia7. Le vescicole extracellulari derivate dal sinciziotrofoblasto esprimono la fosfatasi alcalina placentare (PLAP)8,9, che rileva le piccole vescicole extracellulari circolanti derivate dalla placenta (PDsEV) in gravidanza. Inoltre, il PLAP aiuta a discernere i cambiamenti nel carico di PDsEVs e i loro effetti nella preeclampsia rispetto alle gravidanze normotese 10,11,12,13,14,15.

La placenta è stata riconosciuta come il componente necessario nella fisiopatologia della preeclampsia16 o delle complicanze cerebrali associate a questa malattia 17,18,19. Tuttavia, non si sa come questo organo distante possa indurre alterazioni nella circolazione cerebrale. Poiché le sEV svolgono un ruolo fondamentale nella comunicazione cellula-cellula grazie alla loro capacità di trasferire componenti bioattivi dalle cellule donatrici a quelle riceventi 6,20,21, un numero crescente di studi ha associato le sEV placentari alla generazione di disfunzione endoteliale materna 21,22,23,24, comprese le cellule endoteliali cerebrali 25,26nelle donne con preeclampsia. Pertanto, la compromissione della funzione endoteliale cerebrale può portare all'interruzione della barriera emato-encefalica (BBB), una componente critica nelle complicanze cerebrovascolari associate alla preeclampsia 3,27.

Tuttavia, i risultati preclinici che hanno utilizzato vasi cerebrali di ratto esposti al siero di donne con preeclampsia28 o cellule endoteliali cerebrali umane esposte al plasma di donne con preeclampsia29 hanno riportato che i fattori circolanti inducono l'interruzione della BBB. Nonostante diversi candidati con il potenziale di danneggiare la BBB presente nella circolazione materna durante la preeclampsia, come livelli elevati di citochine proinfiammatorie (cioè il fattore di necrosi tumorale)18,28 o regolatori vascolari (cioè il fattore di crescita dell'endotelio vascolare (VEGF))29,30,31, o molecole ossidative come le lipoproteine ossidate (oxo-LDL)32,33, tra gli altri34, nessuno di essi stabilisce una connessione diretta tra la placenta e la BBB. Recentemente, le sEV isolate da placente ipossiche hanno mostrato la capacità di interrompere la BBB in topi femmina non gravidi25. Poiché le sEV placentari possono trasportare la maggior parte dei fattori circolanti elencati con la capacità di interrompere la BBB, le sEV sono considerate candidati adatti per collegare la placenta lesa, essere il vettore di fattori circolanti dannosi e interrompere la BBB nella preeclampsia.

Questo protocollo ci permette di indagare se le sEV isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche possono interrompere la BBB in topi femmine non gravidi come proxy per comprendere la fisiopatologia delle complicanze cerebrali durante la preeclampsia.

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Protocollo

La ricerca è stata condotta seguendo i principi espressi nella Dichiarazione di Helsinki e sotto l'autorizzazione dei rispettivi Comitati di Revisione Etica. Tutti i partecipanti umani hanno dato il loro consenso informato prima della raccolta del campione, come riportato in precedenza25. Inoltre, il Comitato per la Bioetica e la Biosicurezza dell'Università Bío-Bío ha approvato questo progetto (borsa di studio Fondecyt 1200250). Il lavoro sugli animali è stato condotto in conformità con i principi cardine delle tre R nell'uso degli animali nella sperimentazione35 e secondo le raccomandazioni delle linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicate dal National Institute of Health degli Stati Uniti. Gli animali venivano tenuti in ambienti appropriati presso il Vivarium dell'Università di Bío-Bío. Le placente fresche (n = 4) sono state ottenute entro 1 ora dopo il taglio cesareo elettivo da madri (di età compresa tra 28 e 31 anni) con gravidanze normali a termine (da 38 a 41 settimane di gestazione). I tagli cesarei sono stati eseguiti presso l'Ospedale Clinico Herminda Martin, Chillan, Cile, come precedentemente riportato25. Per applicare il modello in vivo , sono stati utilizzati topi femmine non gravide di 4-6 mesi (ceppo C57BLACK/6). Sono stati divisi in tre gruppi sperimentali: (1) di controllo (senza trattamento), (2) trattati con sEV da normossia (sEVs-Nor) e (3) trattati con sEV da placenta in coltura ipossica (sEVs-Hyp), che sono stati utilizzati per valutare l'interruzione della BBB in vivo25. Tutte le soluzioni iniettate erano sterili. Inoltre, la preparazione delle sEV è stata eseguita in condizioni asettiche e sotto una cappa di biosicurezza di classe II per evitare contaminazioni.

1. Espianti di coltura placentare

  1. Per estrarre gli espianti di placente normali della gravidanza, controllare il metodo pubblicato da Miller et al. 200536.
  2. Rimuovere con cautela i coaguli dalla placca basale della placenta umana utilizzando una pinza sterilizzata. Estrarre piccoli espianti per ottenere un'estrazione tissutale finale di 10 g.
  3. Assicurarsi che gli espianti placentari vengano rimossi dai quattro quadranti della porzione materna della placenta. Assicurarsi che i tessuti devitalizzati e le aree calcificate siano esclusi.
  4. Per manipolare il tessuto placentare, farlo su ghiaccio, in condizioni sterili e all'interno di un armadio di biosicurezza.
  5. Lavare gli espianti (almeno tre volte) con abbondanti quantità (cinque volumi di espianti) di soluzione tampone fosfato fredda (4 °C) (PBS 1x, pH 7,4) per rimuovere quanto più sangue possibile. Centrifugare (252 x g per 10 min) a temperatura ambiente tra un lavaggio e l'altro.
  6. Risospendere 10 g di espianti lavati in 20 mL di terreno di coltura integrato con il 2% di siero fetale bovino, 100 UI/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina (vedere Tabella dei materiali).
  7. Mettere la sospensione in un piatto di coltura da 100 mm. Lasciare gli espianti per 2 ore in incubatrice a 37 °C con il 21% di ossigeno e il 5% di CO2 .
  8. Successivamente, rilavare gli espianti con 1x PBS a 37 °C (tre volte). Centrifugare (252 x g per 10 min) a temperatura ambiente tra un lavaggio e l'altro.
  9. Inoltre, risospendere il tessuto in 20 mL di terreno di coltura precedentemente impoverito di nanoparticelle.
    NOTA: Per l'esaurimento delle nanoparticelle, eseguire l'ultracentrifugazione (120.000 x g per 18 ore a temperatura ambiente) e la microfiltrazione (filtro da 0,22 μm).
  10. Dividere gli espianti risospesi in due piastre di coltura (100 mm). Ogni capsula di coltura deve contenere 10 ml di espianti risospesi.
  11. Successivamente, posizionare una delle piastre contenenti espianti placentari in condizioni di coltura standard (37 °C con l'8% di ossigeno e il 5% di CO2 ), mentre l'altra viene posta in una camera ipossica con l'1% di O2 .
    NOTA: (FACOLTATIVO) L'analisi della vitalità tissutale può essere eseguita utilizzando le stesse estrazioni tissutali e il saggio del bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (saggio MTT) come descritto altrove37,38. Utilizzare la concentrazione proteica totale misurata negli omogenati degli espianti per normalizzare i valori di MTT.
  12. Dopo 18 ore di coltura, raccogliere i terreni condizionati degli espianti in una nuova provetta da 15 ml.
    NOTA: A questo punto, i terreni condizionati possono essere congelati (-80 °C) per un periodo prolungato (settimane).

2. Isolamento delle sEV di derivazione placentare

  1. Isolare le sEV dal mezzo condizionato utilizzando il protocollo di centrifugazione differenziale e microfiltrazione seguendo i rapporti precedentemente pubblicati 25,39.
  2. Eseguire la centrifugazione sequenziale per il terreno condizionato raccolto. Le fasi sequenziali delle centrifugazioni sono (1) 300 x g per 10 min, (2) 2000 x g per 10 min, (3) 10.000 x g per 30 min e (4) 120.000 x g per 2 h. Eseguire le centrifugazioni a temperatura ambiente.
  3. In tutte queste centrifugazioni, utilizzando una pipetta da 20-100 μL, raccogliere con cura il surnatante e scartare il pellet.
  4. Una volta fatto, far passare l'ultimo surnatante raccolto attraverso un filtro da 0,22 μm (vedi Tabella dei materiali). Successivamente, eseguire un'ulteriore centrifugazione a 120.000 x g per 18 ore a temperatura ambiente.
  5. Successivamente, scartare il surnatante risospendendo il pellet (che contiene sEV placentari) in 500 μL di PBS (pH 7,4) e passare nuovamente attraverso un filtro da 0,22 μm. Infine, eseguire un'ultima centrifugazione a 120.000 x g per 3 h a temperatura ambiente.
  6. Successivamente, risospendere il pellet (che contiene sEV placentari) in 500 μL di PBS (pH 7,4, precedentemente impoverito di sEV) e passare attraverso un filtro da 0,22 μm.
  7. Etichettare i campioni come stock di sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) o sEVs-Hypoxia (sEVs-Hyp).
    NOTA: Preparare aliquote da 50-100 μL delle sEV isolate per ulteriori esperimenti. I piccoli veicoli elettrici possono essere conservati a -80 °C per un periodo prolungato (mesi).
  8. Caratterizzare le sEV placentari in base alle dimensioni, al conteggio e al marcatore proteico delle sEV, come riportato in precedenza25. Il diametro medio ideale delle particelle delle sEV è di 50-150 nm.
    NOTA: la caratterizzazione delle sEVs include la rilevazione positiva di CD63, Tsg101, Alix e HSP70 (ad esempio, per caratterizzare la popolazione di sEVs arricchita negli esosomi). Inoltre, utilizzare PLAP come marcatore dell'origine placentare25.
  9. Misurare la quantità totale di proteine nella soluzione di sEVs utilizzando il kit per il test delle proteine BCA seguendo le istruzioni del produttore (vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: La Figura 1 mostra una panoramica della coltura dell'espianto placentare e dell'isolamento delle vescicole extracellulari.

3. Iniezione di topi

  1. Anestetizzare l'animale in una camera di induzione anestetica con distribuzione di isoflurano al 5% (vedi Tabella dei materiali). Verificare il livello di anestesia pizzicando le dita dei piedi.
  2. Dopo ~40 s, inserire il topo nel sistema di anestesia utilizzando una maschera facciale e mantenere un livello di anestesia del 2% di isoflurano.
  3. Successivamente, posizionare l'animale su una piattaforma riscaldante (vedi Tabella dei materiali) a una temperatura ambiente di 28 °C. Mantieni gli occhi lubrificati con lacrime artificiali.
  4. Prima dell'iniezione, diluire le sEV placentari (200 μg di proteina totale) con tampone fosfato (pH, 7,4) fino a raggiungere un volume finale di 70 μL.
  5. Disinfettare l'area di iniezione utilizzando etanolo al 70% e tamponi di cotone. Assicurarsi di utilizzare una siringa da insulina con un ago da 30 G per iniettare la soluzione di sEVs.
    NOTA: La siringa può essere posizionata sulla piattaforma riscaldante per 5 min per acquisire una temperatura fisiologica.
  6. Quindi, iniettare la soluzione nella vena giugulare esterna. Questo passaggio richiede una formazione speciale.
    NOTA: La procedura deve essere eseguita con cautela, ritraendo lentamente l'ago e aspirando delicatamente per evidenziare il reflusso sanguigno.
  7. Dopo l'iniezione, applicare una leggera pressione sull'area iniettata per ~15 s con un batuffolo di cotone asciutto. Dopodiché, riporta gli animali nelle rispettive gabbie.
  8. Assicurati di valutare la coscienza e il comportamento per 15 minuti. Un indicatore del raggiungimento della coscienza è il recupero dell'attività motoria totale da parte dell'animale.
    NOTA: Assicurarsi di mantenere una temperatura calda nelle gabbie degli animali.

4. Coma murino rapido e scala comportamentale (RMCBS)

  1. Utilizzare l'RMCBS per valutare i parametri neurologici e di benessere degli animali40.
    NOTA: RMCBS consente una valutazione rapida (~ 3 min) con il minimo stress dell'animale dovuto all'intervento dell'operatore. RMCBS ha dieci parametri (ogni punteggio è 0-2).
  2. Valutare il benessere del topo con la scala RMCBS a 0 ore (prima dell'iniezione di sEV) e 3 ore, 6 ore, 12 ore e 24 ore dopo l'iniezione.
    NOTA: Eseguire l'analisi della claudina-5 (a 6 ore dopo l'iniezione di sEVs) e dello stravaso blu di Evan (a 24 ore dopo l'iniezione di sEVs) per valutare l'interruzione della BBB (Figura 2).

5. Analisi dello stravaso blu di Evan

  1. Dopo l'iniezione placentare di sEVs (24 ore), anestetizzare i topi come descritto al punto 3.1.
  2. Preparare la soluzione Evan's Blue (2%, diluita in soluzione tampone fosfato, 1x) (vedi Tabella dei materiali).
  3. Utilizzando l'accesso retroorbitale25, iniettare la soluzione Blue di Evan a 2 mL/kg.
  4. Lasciare circolare la soluzione blu di Evan per 20 minuti sotto anestesia.
  5. Successivamente, eseguire la perfusione intracardiaca seguendo il protocollo41 precedentemente descritto con soluzione salina (~3 ml, 0,9%, p/v) per rimuovere il colorante blu di Evan dalla circolazione. Questo passaggio è obbligatorio.
    NOTA: Per questa procedura, aumentare l'anestesia al 5% e verificare un piano profondo di anestesia (cioè una drastica riduzione della frequenza respiratoria).
  6. Esporre il cuore tramite toracotomia mediale41 (Figura 3).
  7. Successivamente, fissare l'intero animale con un'infusione intracardica di soluzione di paraformaldeide (4% in PBS, v/v).
    NOTA: Controllare la rigidità della coda per monitorare il fissaggio appropriato.
  8. Inoltre, una volta completata la fissazione, estrarre con cura il cervello, pesarlo e fotografarlo41. Scatta foto con tutto il cervello vicino a un righello42.
  9. Quindi, metti il cervello in un'affettatrice per mouse cerebrale (vedi Tabella dei materiali).
  10. Sezionare il cervello in nove sezioni, gru-caudale, compreso il cervelletto (100 μm ciascuna).
  11. Dopo la dissezione, visualizzare e acquisire immagini delle fette di cervello in un microscopio stereo-zoom (vedere Tabella dei materiali).
  12. Utilizzare le immagini acquisite per quantificare lo stravaso blu di Evan utilizzando il software ImageJ (vedere la tabella dei materiali).
    NOTA: Per analizzare la presenza del colorante blu di Evan, impostare i valori del blu di Evan utilizzando un controllo positivo della sezione cerebrale (da un animale di controllo a cui è stato iniettato il colorante ma senza perfusione intracardica). I valori di blu di Evan raggiunti dal controllo positivo sono generalmente compresi tra 75 e 110 nell'istogramma di intensità del canale blu (Figura 4).
  13. Assicurarsi che le immagini cerebrali siano analizzate alla cieca dal rispettivo gruppo sperimentale per evitare pregiudizi dell'osservatore. In alternativa, quantificare lo stravaso blu di Evan mediante omogeneizzazione cerebrale seguita da spettroscopia43.
    NOTA: In esperimenti separati, utilizzando cervelli appena isolati da topi iniettati con sEV (6 ore), analizzare i livelli proteici di claudina 5 (CLND-5) (vedi Tabella dei materiali), una giunzione stretta critica coinvolta nella tenuta della BBB44 (Figura 5).

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Risultati

Questo protocollo valuta la capacità delle sEV derivate da placente coltivate in ipossia di interrompere la BBB in topi non gravidi. Questo metodo permette di comprendere meglio la potenziale connessione tra la placenta e il cervello in condizioni normali e patologiche. In particolare, questo metodo può costituire un proxy per analizzare la partecipazione delle sEV placentari all'insorgenza di complicanze cerebrali nella preeclampsia.

Contrariamente ai topi iniettati con sEVs-Nor, i topi iniet...

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Discussione

Questo studio svela nuove intuizioni sul potenziale danno derivante dalle sEV isolate da espianti placentari coltivati in condizioni ipossiche sulla rottura della barriera emato-encefalica dei roditori. Il meccanismo patologico comporta una riduzione di CLND-5 nella regione cerebrale posteriore25.

Indagini precedenti hanno rivelato che le sEV plasmatiche di individui con preeclampsia inducono disfunzione endoteliale in vari organi utilizzando modelli in vitro <...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi da dichiarare.

Ringraziamenti

Gli autori desiderano ringraziare i ricercatori di GRIVAS Health per il loro prezioso contributo. Inoltre, le ostetriche e il personale clinico del Servizio di Ostetricia e Ginecologia appartengono all'Hospital de Chillan, in Cile. Fondata da Fondecyt Regular 1200250.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Topi adulti brain slecer matrice 3D stampatoFile ad accesso apertoTopi adultiAffettatrice cerebrale per topi adulti. Stampato in filamento PLA.
Anticorpo primario anti β-actinaSigma-AldrichClon AC-74Anticorpo per il controllo del carico (Western blot)
Anticorpo primario anti-claudina5Santa cruz Biotechnologysc-374221Anticorpo primario per la proteina a giunzione stretta CLDN5 dei topi BBB (Western blot)
Kit di proteine BCAThermo Scientific23225Kit per la misurazione della concentrazione proteica
Terreni di coltura #200 500 mLThermo Fisher Scientificm200500Terreni di coltura per espianti placentari
D180 CO2 incubatoreRWD Life scienceD180Incubatore standard per l'espianti e la coltura di sEVs-Nor
Evans colorante blu  > 75% 10 gSigma-AldrichE2129.10GColorante per analizzare l'interruzione della barriera ematoencefalica IN VIVO
Siero fetale bovino 500 mLThermo Fisher Scientific16000044Fattore di crescita additivo per terreni di coltura 200
Himac Ultracentrifuga CP100NXHimac eppendorf group5720410101Ultracentrifuga per terreni condizionati > 1,20.000 x g
SoftwareImageJ NIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurano x 100 mLUSP Baxter212-094Agente per anestesia volatile per inalazione per topi
Kit CellTiter 96 Non radioattivo Promega0000105232In vitro test per la vitalità degli espianti placentari
Anticorpo secondario IgG di topoThermo Fisher ScientificMO 63103Anticorpo secondario per CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300Malvern Panalytical90278090Analisi nanotracking di particelle da espianti placentari in terreni condizionati
Paraformaldehide E 97% soluzione 500 mLThermo Fisher ScientificA11313.22Soluzione fissativa per fette di tessuto cerebrale e perfusione intracardica (una volta diluita)
PBS 1 X pH 7,4 500 mLThermo Fisher Scientific10010023Soluzione di lavaggio per espianti di placenta
Penicilina-streptomicina 100x 20 mLThermo Fisher Scientific10378016Antiobiotici per espianti placentari terreni
di colturaProOX C21 O2 e CO2 Controller per sottocameraBioSpherixSCR_021131Regolatore CO2 per indurre l'ipossia in camera stagna per sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 gChemie7061per eutanasia umanitaria
Sistema di anestesia a basso flusso SomnosuiteKent ScientificsSS-01Vaporizzatore di isoflurano per piccoli roditori
Piattaforma di riscaldamento chirurgicaKent ScientificsA41166Piattaforma di riscaldamento per la manutenzione dell'anestesia nei topi
Filtri per siringhe, Politetrafluoroetilene (PTFE), idrofobico, 0,22 e micro; m, Sterile, 25 mmSouthern labware10026Filtrazione di terreni condizionati raccolti da espianti placentari 
Microcentrifughe da tavolo ad alta velocità  HITACHI himac CT15E/CT15RESistemi medici Hitachi6020Centrifugazioni seriali di terreni condizionati < 1,20, 000 x g
Stereomicroscopio trinoculare a luce trasmidata e riflettente 10x-160x Center Medical2597Stereomicroscopio per la registrazione di fette di cervello
agente

Riferimenti

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